限制性酶切提高E.coli Hfq蛋白晶体结构分辨率

Hfq蛋白是一种促进sRNA结合互补RNA的细菌伴侣蛋白. Hfq蛋白可以抑制或上调目的蛋白的表达及促进mRNA的降解,从而调控细菌的生理功能使其适应周围胁迫环境.Hfq是同源六聚体蛋白质,在其中心部位有1个内环,每个单体上有1个极其保守的组氨酸分布在这个内环表面.根据Hfq这个特点,应用镍离子亲和柱直接从大肠杆菌中纯化Hfq,接着用凝胶过滤层析柱纯化,最终获得了纯度70%的Hfq蛋白.对该蛋白质进行结晶条件初筛前,应用胰凝乳蛋白酶对其进行限制性蛋白酶解,切除其C端无规则卷曲,便于Hfq结晶及提高晶体衍射率.初期得到的Hfq晶体是极小的针状晶体,通过优化结晶条件获得了较大的晶体.最终解析出了2个分辨率较高的Hfq晶体结构,其中1个晶体结构分辨率达到了1.63A.     

蛋白A信号肽引导的E.coli外泌高表达异源蛋白

利用葡萄球菌ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ信号序列（ＳＰＡ）,我们构建了不同启动子控制的分泌表达质粒。经表达研究,获得了可控性好、表达量高的ＰＬ启动子控制的分泌表达载体。通过菌种的筛选、培养条件和诱导条件的摸索,获得了能将表达产物的绝大部分分泌到培养液中的大肠杆菌高效外泌表达系统,外泌表达量可达１００ｍｇ／Ｌ（菌浓度为１Ａ６００／ｍｌ）以上,如此高的分泌表达量尚未见文献报道。利用该系统成功、高效地外泌表达了ｐ     

Study of E. coli Hfq’s RNA annealing acceleration and duplex destabilization activities using substrates with different GC-contents

Folding of RNA molecules into their functional three-dimensional structures is often supported by RNA chaperones, some of which can catalyse the two elementary reactions helix disruption and helix formation. Hfq is one such RNA chaperone, but its strand displacement activity is controversial. Whereas some groups found Hfq to destabilize secondary structures, others did not observe such an activity with their RNA substrates. We studied Hfq’s activities using a set of short RNAs of different thermodynamic stabilities (GC-contents from 4.8% to 61.9%), but constant length. We show that Hfq’s strand displacement as well as its annealing activity are strongly dependent on the substrate’s GC-content. However, this is due to Hfq’s preferred binding of AU-rich sequences and not to the substrate’s thermodynamic stability. Importantly, Hfq catalyses both annealing and strand displacement with comparable rates for different substrates, hinting at RNA strand diffusion and annealing nucleation being rate-limiting for both reactions. Hfq’s strand displacement activity is a result of the thermodynamic destabilization of the RNA through preferred single-strand binding whereas annealing acceleration is independent from Hfq’s thermodynamic influence. Therefore, the two apparently disparate activities annealing acceleration and duplex destabilization are not in energetic conflict with each other.     

天冬氨酸酶E.coli融合表达研究

以大肠杆菌基因组DNA为模板,设计引物扩增得到天冬氨酸酶基因,将其重组于胞内融合表达型T载体中,重组质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)。SDS-PAGE分析表明,工程菌经IPTG诱导,表达大量表观分子量约75kD的融合蛋白。经试验,工程菌细胞具有较高的天冬氨酸酶活性,融合形式的酶最适温度37℃,最适pH8.5,融合伴侣DsbA的存在对酶活没有影响。     

E.coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E.coli中的分泌…

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片中克隆出碱性磷酸酯酶的启动子和信号肽序列,在ＰｈｏＡ启动子５端设计了ＥｃｏＲⅠ酶位点,在信号肽编码序列３端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点,将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ倍点,组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－,之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体,使之有Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分     

商陆种子抗病毒蛋白的0.25nm分辨率晶体结构

在高蛋白浓度 ( 1 0 0mg/mL)和高温 ( 33℃ )条件下得到了美洲商陆种子抗病毒蛋白的单晶 ,具有较高的衍射分辨率 .用分子置换法在 0 .2 5nm分辨率确定了该蛋白晶体结构的初始模型 ,经分子动力学修正技术精化 ,晶体学R因子为 1 8.1 5 % ,键长键角对理想值的均方差分别为 0 .0 0 1 6nm和 2 .0 4° .通过与另外两种商陆抗病毒蛋白结构的比较 ,发现连接第 5条 β链段和第 2个α螺旋的环套区位于活性中心附近 ,并且为序列和结构的多变区 ,其上分布着可能的活性残基 ,因而可能是与活性差异有关的区域     

汉坦病毒H8205部分核壳蛋白基因在E.coli中的表达

根据汉坦病毒H8205株NP基因的序列,设计一对引物,扩增NP前292个氨基酸多肽基因片段,克隆于表达载体pGEX-3X,与载体中26kD的谷胱苷肽巯基转移酶(GST)融合表达.SDS-PAGE显示表达产物(GST-NP)主要以包涵体形式存在.Western-blotting表明此融合蛋白有抗原性.包涵体经分离、洗涤、溶解后,Sepharose 6B层析纯化,用此融合蛋白作抗原,进行ELISA法检测临床HFRS病人标本的IgG和IgM,有很好的特异性和敏感性.有生物活性的汉坦病毒H8205 NP的体外表达成功,为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础,也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原.     

衣藻CrFtsZ2-GFP融合蛋白在E.coli中的表达及其定位

FtsZ蛋白在细菌的分裂中担任着重要作用 ,能够在分裂位点形成一个环状结构而控制细菌的分裂过程。胞内FtsZ蛋白浓度的异常升高或降低均可阻断正常的细胞分裂过程进而形成分裂异常的丝状菌体。为了研究衣藻FtsZ蛋白的生物学活性 ,构建了衣藻CrFtsZ2cDNA全长与绿色荧光蛋白基因egfp的融合表达质粒 ,并对其在大肠杆菌中的表达与定位做了初步分析。在大肠杆菌JM10 9中 ,融合表达质粒的过量表达导致宿主菌形成了丝状菌体 ,通过荧光显微镜观察发现CrFtsZ2 EGFP融合蛋白沿着宿主菌体的纵轴方向有规律地聚集成荧光点或荧光带 ,暗示衣藻CrFtsZ2蛋白能够识别宿主菌内分裂位点的定位信号并参与其细胞分裂过程 ,初步验证了衣藻CrFtsZ2蛋白的功能。     

传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

汉坦病毒H8205部分核壳蛋白基因在E.coli中的表达

根据汉坦病毒Ｈ８２０５株ＮＰ基因的序列,设计一对引物,扩增ＮＰ前２９２个氨基酸多肽基因片段,克隆于表达载体ｐＧＥＸ３Ｘ,与载体中２６ｋＤ的谷胱苷肽巯基转移酶（ＧＳＴ）融合表达。ＳＤＳＰＡＧＥ显示表达产物（ＧＳＴＮＰ）主要以包涵体形式存在。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ表明此融合蛋白有抗原性。包涵体经分离、洗涤、溶解后,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ层析纯化,用此融合蛋白作抗原,进行ＥＬＩＳＡ法检测临床ＨＦＲＳ病人标本的ＩｇＧ和ＩｇＭ,有很好的特异性和敏感性。有生物活性的汉坦病毒Ｈ８２０５ＮＰ的体外表达成功,为汉坦病毒基因工程抗原的大量制备奠定了基础,也为汉坦病毒的临床检测和流行病学调查提供了一种廉价、安全、可靠的抗原。     

E.coli tRNA~(Leu)的提纯

本文报道一种E.coli tRNA~(Leu)简便而稳定的纯化方法。粗tRNA经过BD-Cellulose柱层析和聚丙烯酰胺凝胶电泳两个步骤即可得到亮氨酸接受能力为1400pmol/A_(260)单位的tRNA~(Leu)。     

产肠毒素原性E.coli菌苗的研究进展

<正> 产肠毒素原性大肠杆菌(ETEC)是当前世界上的一个重要病原,虽然确切的调查资料尚难以得到,但据近来的研究估计,全世界每年大约有4亿腹泻病例,五岁以下儿童因之死亡的有70万。ETEC也是旅游者腹泻的一个重要病因。由于人们对这种病原的认识相当晚,因而近十年来才注意其菌苗的研制。 关于ETEC腹泻的致病机理常有评述,但简要说来,ETEC引起腹泻需要有两类毒力因子,即定居因子和肠毒素。病原体必须首先粘附到小肠的近测,这一过程是由称为定居因子抗原(CFA)的纤毛蛋白粘附素(adhesins)介导的。已经识别出许多这样的因子如CFA/I,CS1,CS2,CS3,CS4,CS5,CS6以及PCFO159:H4。早期的报     

E.coli Rho因子的结构与功能

Ｅ．ｃｏｌｉＲｈｏ因子的结构与功能赖兵张海（北京大学生命科学学院生物化学与分子生物学系,北京１００８７１）关键词Ｒｈｏ因子ＡＴＰａｓｅ转录过程中起决定作用的序列,蛋白质因子及它们之间的相互作用,一直是生物化学家和分子生物学家关注的焦点之一。由于真核生...     

Roasting coffee beans produces compounds that induce prophage λ in E. coli and are mutagenic in E. coli and S. typhimurium

Freshly brewed blended coffee, instant coffee and instant caffeine-free coffee induced prophage λ in lysogenic E. coli K12, strain GY5027. Because coffee prepared from green beans by the same extraction method as used for freshly brewed blended coffee had no prophage-inducing activity, this activity may be attributed to compounds produced in the roasting process. Roasting also produced compounds that were mutagenic in S. typhimurium TA100 and E. coli WP2 uvrA/pKM101.     

融合蛋白pIL6-IL2在E.coli中的表达及活性鉴定

白细胞介素 2 (interleukin 2 ,IL-2 )与白细胞介素 6(interleukin 6,IL-6)能分别刺激T淋巴细胞增殖与B淋巴细胞分泌免疫球蛋白 ,从而促进动物机体的细胞免疫与体液免疫 ;另外IL2与IL6在发挥生物学活性时还有相互协同作用。因此 ,将去除信号肽的猪白细胞介素 6(pIL-6)与猪白细胞介素 2 (pIL-2 )cDNAs序列通过一段Linker相连 ,克隆到E .coli表达载体pPET-2 8a中。该融合蛋白IL6-IL2在E .coli表达菌BL2 1 (DE3)中获得成功表达 ,SDS-PAGE分析分子量约为40kDa ,表达量达到总菌体的 66.26%。用IL6依赖的B9细胞与IL2依赖的CTLL细胞增殖试验进行融合蛋白IL6 IL2的生物活性检测 ,其活性可分别达到 0.8× 10³U /mg和 6.4× 10³ U/mg。     

提高免疫毒素DT386-GMCSF在E.coli中表达量的研究

以人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）受体（GM-CSFR）为靶向的白喉毒素（DT）与GM-CSF免疫毒素DT386-GMCSF为急性髓系白血病提供了一种新的替代治疗途径,但该蛋白在E.coli中的表达量很低,难以进行工业化生产。为探索造成其低表达的关键影响因素,对DT386-GMCSF中的GM-CSF进行了C端的截短表达,发现GM-CSF中L114编码序列可明显影响融合蛋白的表达量。在此基础上,构建了一系列突变体,发现保留1-123位氨基酸且将L114L115V116突变为G114V115T116的突变体DF123GVT的表达量高于DT386-GMCSF,且对来源于高表达GM-CSF受体的HL60细胞的肿瘤单细胞具有相似的细胞毒作用。DF123GVT突变体的获得为GM-CSFR靶向的免疫毒素的开发应用打下了基础。     

Predicting the strength of UP-elements and full-length E. coli σE promoters

Predicting the location and strength of promoters from genomic sequence requires accurate sequenced-based promoter models. We present the first model of a full-length bacterial promoter, encompassing both upstream sequences (UP-elements) and core promoter modules, based on a set of 60 promoters dependent on σ(E), an alternative ECF-type σ factor. UP-element contribution, best described by the length and frequency of A- and T-tracts, in combination with a PWM-based core promoter model, accurately predicted promoter strength both in vivo and in vitro. This model also distinguished active from weak/inactive promoters. Systematic examination of promoter strength as a function of RNA polymerase (RNAP) concentration revealed that UP-element contribution varied with RNAP availability and that the σ(E) regulon is comprised of two promoter types, one of which is active only at high concentrations of RNAP. Distinct promoter types may be a general mechanism for increasing the regulatory capacity of the ECF group of alternative σ's. Our findings provide important insights into the sequence requirements for the strength and function of full-length promoters and establish guidelines for promoter prediction and for forward engineering promoters of specific strengths.     

E.coli外切核酸酶Ⅲ的提取和纯化

E.coli外切核酸酶Ⅲ(EXOⅢ)有四种功能。第一,从双链DNA 3’端向5’端逐个水解磷酸二酯键,释放出5’-单核苷酸,因此是3’→5’的外切核酸酶。第二,水解DNA的3’末端磷酸单酯键,释放出无机磷酸。第三,它可以在DNA无嘌呤区段上水解磷酸二酯键,因而又是无嘌呤或无嘧啶内切核酸酶。最后,对