腺相关病毒的受体研究进展

腺相关病毒的安全与长效特点,使其成为基因治疗中最有前景的病毒载体之一。虽然第一个以该病毒为载体的基因药物Glybera已在欧盟获批上市,然而如何进一步提高载体的靶向性与产品纯度仍是当务之急。腺相关病毒的受体是介导病毒与靶细胞结合的分子基础,其与病毒的结合具有很强的特异性,因此相关受体的研究不仅有助于改善基因治疗的靶向性,亦能为高纯度病毒的亲和纯化带来希望。目前已有11种腺相关病毒的受体被发现,本文就其受体的发现过程、结构特点、功能应用等方面展开综述,为今后相关研究提供一些思路。     

化学修饰的重组腺相关病毒载体

重组腺相关病毒(Recombinant adenovirus-associated virus,rAAV)载体源于腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),以其无致病性、低免疫原性、可定点整合及在宿主细胞内长期表达等优势,广泛应用于肿瘤和遗传疾病等基因治疗研究,被视为最有前途的基因治疗载体之一。但是人体内广泛存在AAV中和抗体,以及rAAV对体内特定组织或细胞的靶向性欠理想,限制了其在临床上的应用。经化学修饰的rAAV可以抵御血清中和抗体,提高转导靶向性,还可实现rAAV体内动态监测,这为解决当前rAAV载体的问题提供了新的思路和方法。本文对化学修饰的rAAV展开系统阐述,并对其未来发展趋势作出展望。     

非人灵长类基因修饰模型研究进展

非人灵长类动物在生命科学基础研究和生物医药研究领域具有非常重要的地位。近年来随着慢病毒载体转染及靶向核酸酶(ZFN,TALEN,CRISPR/Cas9)等基因操作技术的出现,科学家们成功地获得了外源基因过表达的转基因猴和目的基因定点切割的基因编辑猴。文中对目前利用慢病毒载体获得转基因猴和利用靶向核酸酶获得基因编辑猴的研究进展进行了综述,并讨论了基因修饰猴的嵌合体现象、脱靶现象及非人灵长类动物较长性成熟时间这几个影响非人灵长类基因修饰模型推广应用的因素,最后展望了非人灵长类基因修饰模型构建技术的研究热点及发展趋势。     

转染腺相关病毒对骨髓间充质干细胞分化潜能的影响

目的:探讨转染腺相关病毒对骨髓间充质干细胞分化潜能的影响.方法:运用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞;将pAAV-GFP、pAAV-RC、pHelper用磷酸钙法共转染HEK-293细胞,得到rAAV-GFP,转染骨髓间充质干细胞.进行成骨诱导分化,观察rAAV-GFP对骨髓间充质干细胞分化潜能的影响.结果:与未转染rAAV-GFP的间充质干细胞相比较,转染rAAV-GFP后,骨髓间充质干细胞分化潜能未见改变,均表现为细胞浆蓝紫色,核周明显.结论:转染腺相关病毒对骨髓间充质干细胞分化潜能未见明显影响,为基因修饰腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞进行体内移植提供了实验基础.     

sgRNAcas9软件图形用户界面开发及应用

CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术是新一代功能强大的基因修饰技术。然而,脱靶效应(Off-target effects)是目前CRISPR/Cas9技术面临的最大问题。因此,设计脱靶风险低的sgRNA(single guide RNA)就成为关键。sgRNAcas9是一款专门用于sgRNA设计和评估脱靶效应的软件包。针对其核心运行程序,我们利用Java程序语言开发了其图形用户界面。此外,依据脱靶位点碱基数和sgRNA种子序列(seed sequences)的特异性,通过设置不同的风险等级对sgRNA的脱靶效应进行评估。随后,利用此软件设计了34 124条靶向人、小鼠、大鼠、猪和鸡中共4691个microRNA(miRNA)前体的sgRNAs。此外,随机挑选了一个靶向人miR-206前体的sgRNA进行脱靶效应评估和验证。结果发现,sgRNAcas9软件人机交互界面友好,大多数miRNA前体可通过该软件寻找到sgRNA,且他们的GC%含量范围集中于40%~60%。利用sgRNAcas9软件设计的靶向miR-206的sgRNA,其基因组编辑活性和脱靶位点可被实验验证。本研究表明sgRNAcas9图形用户界面软件能针对任意物种设计特异性的sgRNA,其可在BiooTools(http://www.biootools.com/)网站下载。     

基于CRISPR/Cas9系统建立SNX11基因敲除A549细胞系

为了建立SNX11基因稳定敲除A549细胞系,本研究通过构建针对人SNX11基因的特异性打靶慢病毒载体,将该慢病毒感染A549细胞系,使用嘌呤霉素对慢病毒感染阳性的A549细胞进行筛选,利用梯度稀释法获得单细胞并扩增培养,提取细胞基因组DNA,PCR扩增后进行测序验证,同时提取细胞蛋白后利用Western Blot方法进行蛋白敲除验证,最后进行细胞活性检测和脱靶效应评估。最后,本研究获得了一株SNX11基因敲除A549细胞系;通过脱靶效应评估,结果显示最可能的20个脱靶位点均不存在脱靶现象;该基因敲除对细胞增殖活性没有影响。本研究成功构建了一株SNX11基因敲除A549细胞系,为SNX11蛋白的功能研究建立了细胞模型。     

靶向肿瘤治疗的腺相关病毒载体

靶向性是肿瘤治疗取得成功的关键因素。病毒载体用于治疗肿瘤的过程中必须要求特异性作用于肿瘤细胞的同时降低对正常细胞的毒性。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体具有免疫原性小、宿主范围广和介导基因可长期表达等优点,因此得到了广泛的应用。然而,AAV载体针对肿瘤的靶向性一直是近年研究的热点和难点。现就AAV载体治疗肿瘤的概况和靶向策略以及其安全性等方面作一综述。     

叶酸受体靶向的金纳米棒用于细胞内光声成像

目的 分子成像技术具有“早期检测”的特点,由于分子水平上的畸变早于解剖水平上的变化。本研究采用细胞内光声分子成像（PMI）方法,对靶向到癌细胞上的叶酸-金纳米棒（FA-AuNRs）精确定位成像。方法 本文合成了FA-AuNRs,并对其性质包括形貌、吸收光谱和生物相容性进行了研究。修饰叶酸赋予FA-AuNRs特异性靶向到叶酸受体高表达癌细胞的能力。然后,通过PMI实验研究FA-AuNRs对癌细胞的靶向特异性。结果 FA-AuNRs呈棒状,在~800 nm处有一近红外吸收峰。在癌细胞的细胞质中观察到强光声信号,而在正常细胞中只有弱光声信号,表明FA-AuNRs通过叶酸受体介导的内吞作用被癌细胞选择性摄取。这项研究证明了PMI能够实现对靶向到癌细胞上的FA-AuNRs精确定位成像。结论 借助特异性靶向作用,可以通过PMI获得癌细胞表面分子信息。该方法有望实现在细胞和分子水平上对生物过程进行可视化、表征和量化。     

AAV介导的RNAi对SARS-CoV-2 S基因表达的抑制作用

旨在研究AAV介导shRNA在体内、体外特异性抑制SARS-CoV-2 S基因的表达,为抑制SARS-CoV-2感染提供参考。设计了7条靶向SARS-CoV-2 S基因的shRNA,分别构建了shRNA1-7的质粒表达载体,与S基因表达载体共同转染体外培养细胞,通过qRT-PCR和Western blot分析其对S基因表达的抑制作用,筛选出抑制效率最高的shRNA1;构建包装表达shRNA1的重组腺相关病毒(rAAV)载体,将rAAV-shRNA1与S基因表达质粒共同转导293T细胞,S基因表达的抑制率为65.6%;两者通过滴鼻或肌肉注射方式共同转导小鼠,qRT-PCR检测其在体内对S基因表达的抑制率分别为36.8%和90.3%。     

重组腺相关病毒：很有潜力的基因治疗载体

腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员,为无包膜的线性单链DNA病毒.由于AAV具有长期潜伏于人体而不具有任何明显致病性等优点,人们对AAV作为一种理想的基因治疗载体给予了很大期望.但是,近来发现,这类载体在应用上有许多明显的缺陷,包括某些细胞膜上病毒受体数量极少,重组AAV载体位点特异性整合不足,AAV衣壳成分和转基因产物引起宿主的免疫反应等等.这些缺陷促使人们加大对AAV生物学特性和转染过程的研究,从而更好地对AAV载体进行改进,使新一代重组AAV载体具备基因治疗所必需的安全性、高效性和靶向性,以期更广泛地应用于临床.     

重组腺相关病毒2型/人肿瘤坏死因子受体:Fc(rAAV2/hTNFR:Fc)的构建和生物学活性研究

为研究腺相关病毒2型载体应用于类风湿性关节炎进行基因治疗的可行性,首先构建携带人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段融合基因的重组2型腺相关病毒(rAAV2／hTNFR：Fc),并对其生物学活性进行研究。以RT—PCR分别从U937和人淋巴细胞总RNA中扩增人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体胞外区和人免疫球蛋白IgG1Fc段基因,并以重叠延伸PCR的方法将二者融合后克隆入pSNAV1载体质粒进行重组病毒生产,在进行重组病毒理化分析后,以TNFa细胞毒中和试验来研究该重组病毒的生物学活性。结果显示：所构建的重组病毒rAAV2／hTNFR：Fc基因结构与预期一致;病毒在体外感染BHK-21细胞后,含TNFR：Fc融合蛋白的表达上清可以有效中和人、大鼠、小鼠TNFα对L929的细胞毒性。所研究构建的重组腺相关病毒可以用来作为阻断TNFα的手段,进行类风湿性关节炎的基因治疗研究。     

构建溶瘤腺病毒的策略

溶瘤腺病毒是通过遗传工程改造的腺病毒,具有溶细胞复制周期的特性和特异靶向肿瘤细胞和裂解肿瘤细胞的功能。溶瘤腺病毒通过复制、释放子代病毒感染邻近肿瘤细胞。现在对腺病毒生活周期的认识水平,可以对其基因组进行改造从而使其特异性裂解肿瘤细胞而不杀伤正常细胞,并且构建了多种溶瘤腺病毒。本文主要概述了溶瘤腺病毒的三种构建策略:剔除腺病毒在正常细胞中复制所必需而在肿瘤细胞中不需要的某些基因;利用肿瘤特异性启动子控制病毒复制所必需的基因;对腺病毒衣壳蛋白进行基因修饰,达到特异性结合肿瘤细胞的目的。     

病毒受体及其研究方法进展

病毒性感染具有宿主种属特异性和组织嗜性,这主要由病毒受体决定。受体是介导病毒入侵的决定因素,研究病毒受体对了解病毒与细胞的相互作用至关重要。近年来,研究受体的方法除了传统的病毒覆盖蛋白结合法、单克隆抗体法、免疫共沉淀、亲和层析等外,出现了许多如噬菌体表面展示技术、酵母双杂交技术、cDNA文库等分子生物学新方法。简要综述了病毒受体及其研究方法的相关进展。     

细胞移植中的基因修饰技术

基因治疗的发展已经取得了可喜的成果——将实验研究成果转化为临床治疗。基因修饰技术已被大量运用于细胞移植,但瓶颈是有效的基因传递系统。几种病毒载体已被用于转导终末期的分化细胞,近来的大部分成功的案例都是应用腺病毒相关载体。作为一种替代方法,人类胚胎干细胞和干细胞样体系已被建立用来产生组织特异性的基因修饰细胞。     

溶瘤病毒靶向治疗肿瘤的策略

近年来,随着国内外几款溶瘤病毒制剂的相继上市,溶瘤病毒疗法成为肿瘤免疫治疗的焦点。溶瘤病毒可选择性感染并裂解肿瘤细胞,同时释放肿瘤相关抗原激活机体的抗肿瘤免疫反应,达到杀伤肿瘤细胞和抑制肿瘤生长的目的。溶瘤病毒对肿瘤的靶向杀伤作用决定了其安全性和溶瘤效果。为了开发出安全高效的溶瘤病毒,目前主要采用以下策略：利用某些病毒载体对肿瘤细胞的天然靶向性,使溶瘤病毒选择性地在肿瘤细胞内复制并杀伤肿瘤细胞;或者对病毒基因组进行缺失和插入等修饰,通过靶向肿瘤细胞特异性表面受体、胞内信号通路或者肿瘤微环境等提高溶瘤病毒的肿瘤靶向性。其中,肿瘤微环境中的低氧状态、新血管生成以及免疫抑制状态等都可成为溶瘤病毒的靶点。而溶瘤病毒通过表达细胞因子和免疫检查点抑制剂,或者与CAR-T细胞联合作用,靶向调节肿瘤微环境中免疫抑制状态,成为提高溶瘤病毒肿瘤靶向性的常用方法。本文将对以上溶瘤病毒靶向治疗肿瘤策略的研究进展进行综述。     

逆转录病毒载体表达的膜型免疫球蛋白介导B细胞受体细胞信号传导

B细胞的激活是通过B细胞受体与其特异性抗原的结合引起,并引发后续的信号级联反应.深入了解这一重要事件的分子机制是免疫学研究的重要目标.嵌合B细胞受体是B细胞信号功能研究的有效工具.然而,这一方法仅适用于工具细胞,不能被用于体内研究.本研究构建了能同时表达针对特异性抗原的膜型免疫球蛋白的重链和轻链的逆转录病毒载体,通过逆转录病毒载体将这一膜型免疫球蛋白表达在原始B淋巴细胞膜上.结果证实,通过逆转录病毒载体表达的膜型免疫球蛋白能引发B细胞受体的信号转导,可引发B细胞受体下游Syk和Erk1/2蛋白的磷酸化.本研究进一步表明,B淋巴细胞表达的膜型免疫球蛋白在体外和体内均能与特异性抗原结合并导致细胞增殖.因此,本研究提供了一个能在体外和体内快速方便地分析B细胞受体下游信号级联反应的方法,这一方法将有助于更深入地研究与B细胞功能相关的各种蛋白.     

一种高效快速浓缩腺相关病毒载体的方法

腺相关病毒载体(adeno associatedviralvector,AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。研究中往往需要高滴度的重组AAV病毒(>105v g /细胞),为此利用完整的腺相关病毒颗粒具有耐受有机溶剂的特点,创造性地采用了一种用乙醇沉淀重组AAV病毒的方法,达到了高效、快速浓缩AAV载体的目的。结果表明,乙醇沉淀法可以高效浓缩AAV载体,并且对病毒的结构和活性没有明显影响。用这种方法可以方便地将低滴度的AAV病毒变成高滴度,解决动物体内实验中每点注射体积受到限制的问题。     

研究发现新技术可显著提高基因编辑准确性

<正>近日,研究人员开发了一种新技术可以显著提高科学家们靶向特定错误基因,对其进行"编辑",用健康DNA替换损伤的遗传密码。在这项研究中,研究人员开发了一种方法能够降低基因编辑工具酶的脱靶效应,他们将这种方法命名为DB-PACE(DNA-binding phage-assisted continuous evolution),利用这种方法能够大大提高核酸酶的DNA结合能力和切割特异性。研究人员将这一系统应用于TALEN技术,大大提高了TALEN技术的DNA切割特异性,这表明DB-PACE系统可作为提高基因编辑精准性的多用途方法在基因组工程领域发挥重要功能。     

T细胞受体工程T细胞疗法:战略和挑战

T细胞受体工程T细胞疗法(TCR-T)是肿瘤治疗中很有希望的一种特异性过继性细胞免疫疗法,该方法主要是将肿瘤抗原特异的TCR基因通过载体转入自体的淋巴细胞中,再回输至病人体内以达到杀伤肿瘤细胞的目的。目前对TCR-T的挑战是肿瘤抗原特异的高亲和性的TCR基因的获取和高度表达以及TCR双链α和β的正确配对。除此之外,通过临床试验已经发现,由于TCR的高反应性,TCR-T会在靶向肿瘤细胞表面抗原的同时作用于正常组织而产生强的脱靶效应,因此,选择合适的靶抗原也是TCR-T细胞治疗能够发挥其优越效果的关键因素。对TCR基因的表达和调节机制、TCR配对的优化战略等TCR-T在肿瘤治疗中面临的挑战,以及TCR-T的临床转化和应用价值进行了探讨。     

重组HIV-AEgp145和SIV-envT基因的rAAV8在小鼠体内的免疫原性研究

病毒性载体疫苗是一种有前途的艾滋病疫苗.为了构建以重组腺相关病毒8型(recombinant adeno associated virus type 8,rAAV8)为载体,表达HIV或SIV包膜蛋白的艾滋病疫苗.同时在小鼠体内对其免疫原性进行评价,为下一步研究奠定基础.本研究分别构建了表达HIVAE亚型和SIVmac239株包膜蛋白(不含胞内区)的rAAV8-AEgp145和rAAV8-SIVenvT两种重组病毒,并通过PCR和WesternBlot方法对重组病毒进行了体外鉴定.将两种重组病毒分别接种BALB/c小鼠,应用ELISA和ELISPOT方法检测小鼠的HIV/SIV特异性抗体滴度和细胞免疫应答强度.结果显示,rAAV8能够在293T细胞中高效表达HIV AEgp145和SIVenvT基因.小鼠接种两种重组病毒3-5W后,均能检测到gp120特异性抗体和env特异性细胞免疫应答,并且在16-20W后反应强度仍显著高于对照组.以上结果提示,携带HIVAEgp145和SIVenvT基因的rAAV8载体能够在小鼠体内诱导中等强度并且持续时间较长的特异性体液和细胞免疫应答.