肝细胞生长因子诱导人肝癌细胞上皮间质化

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）与肿瘤侵袭转移密切相关.虽然肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor,HGF）已被证实为肿瘤EMT的主要诱导剂,但是HGF诱导肿瘤EMT发生的分子机制尚不完全清楚.本研究旨在探讨Snail在HGF诱导肝癌细胞上皮间质转化中的作用.用HGF处理肝癌HepG2和Hep3B细胞,显微镜观察细胞形态变化,划痕试验及Transwell试验检测细胞迁移能力,Western印迹检测Met,AKT的磷酸化及蛋白质表达的变化,Western印迹与real-time RT-PCR检测上皮细胞表面标志E-Cadherin和间质细胞表面标志N-Cadherin、Fibronectin的表达变化,以及EMT相关转录因子的表达变化.经HGF处理的HepG2、Hep3B细胞,Met和AKT的磷酸化水平显著增强;相差倒置显微镜下观察细胞形态向间质型细胞形态转化;细胞划痕和Transwell试验检测细胞的迁移能力较对照组显著增强;Real-time RT-PCR和Western印迹实验显示HGF的诱导能上调间质标记蛋白的表达及下调上皮型标志蛋白的表达.进一步发现,HGF能上调转录因子Snail的表达,干扰Snail能逆转HGF对HepG2和Hep 3B细胞EMT发生的诱导作用.由此可见,HGF可能通过诱导Snail的表达促进肝癌细胞EMT的发生.这为阐明肝癌细胞侵袭转移机制,以及肝癌的防治提供新线索.     

肝星形细胞分泌的趋化因子CXCL1在肝癌转归中的作用

该文探讨了人肝星形细胞(hepatic stellate cells,HSC)对肝癌细胞(Hep G2、SMMC-7721)的迁移、侵袭能力和上皮–间质转化(epithelial-msenchymal transition,EMT)的影响及其机制。采用条件培养法培养肝癌细胞,利用细胞划痕和Transwell实验分析肝星形细胞对肝癌细胞的迁移和侵袭作用。Western blot分析肝星形细胞自身及其分泌到培养液中趋化因子CXCL1[chemokine(C-X-C motif)ligand 1]和肝癌细胞的CXCL1受体2—CXCR2(CXCL1 receptor 2)的表达量,以及条件培养下肝癌细胞中p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β和Snail的表达变化。激光共聚焦显微术和Western blot检测肝癌细胞上皮标志物E-cadherin、间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达变化。结果显示,在HSC中大量表达并分泌趋化因子CXCL1,而肝癌细胞Hep G2、SMMC-7721中高表达CXCR2。肝癌细胞通过条件培养后,细胞形态改变,细胞黏附下降,细胞迁移和侵袭能力增强,上皮标志物E-cadherin蛋白表达下调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达上调,PI3K/AKT信号通路中的关键成员PI3K和AKT磷酸化水平上调,p-GSK-3β和转录因子Snail表达上调。在肝癌细胞条件培养下加入CXCR2受体的特异性抑制剂(SB265610)后,肝癌细胞上皮标志物E-cadherin蛋白表达上调、间质标志物N-cadherin蛋白和Vimentin蛋白表达下调,p-PI3K、p-AKT、p-GSK-3β和Snail的表达下调。以上结果说明,肝星形细胞可能通过CXCL1/CXCR2轴活化PI3K/AKT信号通路并最终促进肝癌细胞上皮–间质转化。     

TGF-β_1通过PI3K/AKT/ARK5/Snail信号通路促进非小细胞肺癌SPC-A1细胞的上皮-间质转化

上皮-间质转化(EMT)在肿瘤侵袭转移发展进程中起着重要的作用.转化生长因子-β(TGF-β)已被证实为肿瘤EMT的主要诱导剂.然而,其分子机制仍有待深入研究.该研究旨在探讨TGF-β1促进非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系SPC-A1上皮-间质转化过程中的分子机制.细胞的形态学检查结果显示,TGF-β1刺激SPC-A1细胞后细胞形态变成梭形.Transwell侵袭实验揭示,TGF-β1刺激后细胞侵袭能力明显增强.Western印迹结果证明,与未经TGF-β1刺激的SPC-A1细胞比较,EMT上皮标志物上皮-钙粘蛋白(E-cadherin)表达明显下调,而间质标志物波形蛋白(vimentin)明显上调,p-AKT、p-ARK5的表达也明显增强.此外,转录因子Snail在细胞核内的表达水平明显增强.TGF-β1和PI3K抑制剂LY294002同时刺激SPC-A1细胞后,p-AKT、p-ARK5较只加TGF-β1时表达明显降低,Snail在核内的表达水平也明显降低.结果提示,TGF-β1通过激活AKT、ARK5磷酸化,促进转录因子Snail入核,进而导致SPC-A1细胞EMT.     

miR-145通过下调PLCε抑制膀胱癌EMT和迁移及其机制研究

目的:探讨miR-145调控PLCε对膀胱癌细胞T24上皮间质转化(EMT)和迁移的影响及可能的分子机制。方法:(1)腺病毒感染T24细胞,划痕实验和Transwell检测细胞的迁移能力;RTPCR、Western blot分别检测PLCε及EMT相关分子的表达;为探究其分子机制,Western blot检测GSK-3β磷酸化(Ser9位点)和Snail的表达情况。(2)利用生物信息学技术预测可能调控PLCε的miRNA,结合文献报道的膀胱癌microRNA表达谱结果筛选出miR-145;转染miR-145 mimics至T24,q PCR检测miR-145、PLCε的表达,Western blot检测PLCε的表达。(3)转染miR-145 mimics,Western blot检测EMT相关分子及p-GSK-3β、Snail;划痕实验、Transwell检测过表达miR-145后细胞的迁移能力。结果:(1)干扰PLCε表达能显著抑制细胞的迁移,同时,使T24细胞中E-cadherin表达上调,N-cadherin和Vimentin表达下调;干扰PLCε后,GSK-3β磷酸化(Ser9位点)水平下降,Snail表达降低。(2)转染miR-145 mimics可使T24细胞中miR-145表达增高,且明显抑制T24细胞中PLCε的表达。(3)在T24中过表达miR-145,细胞迁移能力显著下降,EMT标志分子的表达情况与沉默PLCε结果一致。同时,与阴性对照组相比,转染miR-145 mimics组p-GSK-3β和Snail表达显著减少。结论:PLCε通过GSK-3β/Snail信号通路促进膀胱癌细胞T24发生EMT及迁移,miR-145可以逆转PLCε诱导膀胱癌EMT的发生,从而阻止膀胱癌细胞的迁移。     

过表达Snail增强肺癌细胞A549的体外侵袭能力

用锌指转录因子Snail诱导肺癌细胞A549发生上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),检测肺癌发生EMT后细胞侵袭能力的变化,为临床筛选分子靶向药物提供依据.构建pcDNA3.1-snail载体,用pcDNA3.1-snail及空pcDNA3.1载体转染肺癌A549细胞后,进行G418筛选;光镜观察培养后细胞形态学的改变、免疫细胞化学与免疫荧光检测细胞表达E-钙黏着蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)的改变,Western印迹检测细胞中E-钙黏着蛋白和波形蛋白的改变,Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测.采用pcDNA3.1-snail转染细胞后,A549细胞变得细长,细胞融合度降低.免疫细胞化学、免疫荧光、Western印迹结果显示,E-钙黏着蛋白表达降低,波形蛋白表达升高;transwell侵袭小室法结果显示,过表达Snail的A549细胞穿透matrigel胶的细胞数明显增多.结果提示,Snail能有效诱导肺癌发生EMT,并且能增强肺癌的体外侵袭能力.     

TGF-β1对乳腺癌细胞系Snail表达的影响

目的通过TGF-β1诱导乳腺癌MCF-7发生上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)后检测锌指转录因子Snail表达的改变,探讨Snail在EMT及乳腺癌发生发展中的作用。方法常规培养乳腺癌细胞株MCF-7后,用TGF-β1诱导其发生EMT,用Transwell侵袭小室法进行细胞体外侵袭能力检测;用免疫组织化学方法及免疫荧光检测E-cadherin、Vi mentin、Snail的表达;用real ti me PCR检测E-cadherin、Vi mentin、Snail mRNA的表达。结果TGF-β1处理72h后的MCF-7细胞穿透能力明显增强。E-cadherin蛋白及mRNA表达减少,Vi mentin、Snail蛋白及mRNA表达增加。结论E-cadherin、Vi mentin是细胞发生EMT的重要生物学标志,Snail可能在转录水平上调控E-cadherin、Vi mentin蛋白的表达,Snail在EMT和乳腺癌的发生发展中起着重要的作用。     

TRPM3通过Wnt/β-catenin信号通路诱导上皮性卵巢癌细胞上皮间质转化的作用研究

目的:探讨瞬时受体电位离子通道3(Transient receptor potential melastatin 3,TRPM3)对卵巢癌侵袭转移和上皮细胞间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)的影响及其分子作用机制。方法:采用小干扰RNA沉默上皮性卵巢癌细胞株中HEY及SKOV3中TRPM3的表达,通过Transwell实验和划痕实验检测上皮性卵巢癌细胞的侵袭和迁移能力的变化,Western Blot检测EMT相关蛋白、Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达情况。结果:与对照组细胞相比,干扰组的上皮性卵巢癌细胞迁移和侵袭能力均明显减弱,EMT相关蛋白的上皮细胞标志分子E-cadherin的表达上调,间质细胞标志分子N-cadherin和EMT相关转录调控因子Snail的表达下调,Wnt/β-catenin通路相关蛋白CyclinD1、β-catenin的表达下调。结论:TRPM3可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进卵巢癌细胞的上皮间质转化过程,进而增强其侵袭转移的能力。     

野鸦椿酸对人肝癌细胞的抑制作用及机理研究

探讨圆齿野鸦椿中野鸦椿酸(EA)对人肝癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其机制研究。从圆齿野鸦椿果皮中提取得到EA,通过培养人肝癌细胞Hep G2细胞,以MTT法分析EA对Hep G2细胞增殖的影响,流式细胞术评价不同浓度(20、40、80μmol/L)的EA对Hep G2细胞的凋亡状态和周期分布情况,细胞划痕、Transwell小室实验考察对Hep G2细胞侵袭转移能力的变化,用Western blot法和荧光定量PCR法检测野鸦椿酸对上皮-间质转化(EMT)相关标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达的影响。结果显示,EA抑制人肝癌细胞Hep G2细胞的增殖,24、48、72 h的IC50分别为32. 16±4. 58、26. 45±3. 79、和16. 76±4. 01μmol/L。随EA浓度的增大,细胞的凋亡率逐渐升高,且发生显著的G0/G1期阻滞。EA可降低Hep G2细胞的侵袭和迁移能力,上调E-Cadherin的蛋白和mRNA的水平,下调N-Cadherin、Vimentin、MMP-2和MMP-9的蛋白和mRNA表达。EA抑制人肝癌细胞增殖和侵袭转移能力,可能与其调控EMT相关信号通路有关。     

下咽癌放疗抵抗细胞放疗抗性与上皮–间质转化的关系

该文探讨了下咽鳞癌放疗抵抗细胞FaduRR发生放疗抵抗与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的关系及可能的机制。课题组前期成功构建了放疗抵抗细胞株FaduRR。平板克隆形成实验、CCK8实验检测放疗抵抗性,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞划痕和Transwell侵袭迁移实验检测迁移侵袭能力,Western blot和qRT-PCR实验检测蛋白和mRNA的表达。与亲本细胞Fadu相比,FaduRR细胞的放疗敏感性明显降低,X线照射后第4天的存活率明显增高、细胞凋亡率降低、细胞形态呈现上皮间质化的改变、细胞迁移侵袭能力增强、E-cadherin的蛋白和mRNA表达水平显著下调,而N-cadherin、Vimentin、p-Akt、p-GSK-3β、Snail的蛋白和mRNA表达水平显著上调,但Akt和GSK-3β的表达无明显变化。以上结果提示,下咽鳞癌放疗抵抗细胞株FaduRR发生了EMT改变,其机制可能与Akt/GSK-3β/Snail信号通路的激活有关。     

高表达Snail蛋白诱导黑色素瘤EMT细胞模型的构建及鉴定

目的:构建稳定表达Snail蛋白的可用于肿瘤上皮-间质化研究的肿瘤细胞模型.方法:采用亚克隆方法从质粒pCMV6-mSnail中PCR扩增小鼠Snail基因,连接至表达质粒pL-tdTomato-Neo,筛选重组质粒并经双酶切及测序鉴定.构建成功的重组质粒pL-tdTomato-mSnail转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选稳定细胞株.采用荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Snail及上皮/间质标志物的变化.建立裸小鼠皮下移植瘤模型,活体成像系统观测移植瘤.结果:重组质粒pL-tdTomato-mSnail成功构建,其稳定转染株B16/dT-mSN胞体发出强烈红色荧光.胞内Snaill水平显著上调,E-钙粘蛋白下调,波形蛋白表达上调,呈现典型的上皮-间质化表型.结论:成功获得稳定高表达小鼠Snail蛋白的EMT细胞模型,且可用于体内外荧光成像观测,为研究Snail蛋白在介导肿瘤EMT过程中的生物作用提供了重要的实验工具.     

Snail真核表达载体的构建及功能鉴定

目的:构建Snail的慢病毒真核表达载体,并研究Snail在肿瘤发生和发展过程中对上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:以乳腺文库为模板,PCR扩增Snail的全长编码序列,将其克隆到p CDH表达载体上,构建成p CDH-Snail真核表达载体,转染293T细胞,Western印迹检测p CDH载体介导的Snail的表达;与包装质粒共转染293T细胞,包装病毒后感染ZR75-1细胞,经嘌呤霉素筛选2周,得到稳定表达Snail的ZR75-1细胞株,检测ZR75-1细胞对EMT的影响,同时用倒置荧光显微镜观察ZR75-1稳定细胞株中上皮钙粘蛋白分布的变化。结果:Bam HⅠ、XbaⅠ双酶切及测序证实得到p CDH-Snail表达载体,Western印迹表明Snail在293T细胞内得到成功;经嘌呤霉素筛选,获得稳定表达Snail的ZR75-1细胞株;在倒置荧光显微镜下观察,ZR75-1稳定细胞株中的上皮钙粘蛋白绿色荧光明显减弱。结论:构建了p CDH-Snail的慢病毒真核表达载体,建立了稳定表达Snail的ZR75-1细胞,为进一步研究Snail在EMT过程中的机制奠定了基础。     

薯蓣皂苷激活p38MAPK/FOXO3a信号抑制三阴性乳腺癌细胞上皮–间质转化及侵袭

该研究探讨了薯蓣皂苷(Dioscin)对三阴性乳腺癌MDA-MB-231、BT549细胞体外侵袭及上皮–间质转化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)的影响及其作用机制。以正常人乳腺上皮MCF-10A细胞为对照,通过MTS法、克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力;Western blot法检测p38MAPK、p-p38MAPK、FOXO3a及上皮–间质转化(epithelial to mensenchymal transition,EMT)相关标志物的表达。结果显示,Dioscin能明显抑制MDA-MB-231、BT549细胞的增殖,且具有浓度依赖性,对MCF-10A细胞抑制作用较弱;Dioscin处理后肿瘤细胞的侵袭、迁移能力明显降低,Dioscin可显著下调细胞间质样标志物波形蛋白(vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)并促进上皮样标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达,EMT关键转录因子Snail的表达也受到抑制。进一步研究发现,Dioscin能够上调p38MAPK磷酸化水平并促进转录因子FOXO3a的表达,而干扰FOXO3a能够逆转Dioscin对细胞EMT及侵袭的抑制作用。以上研究表明,Dioscin能够抑制三阴性乳腺癌细胞EMT及体外侵袭、迁移能力,其机制可能与Dioscin调控p38MAPK/FOXO3a信号有关。     

靶向沉默HIF-1α信号通路抑制百草枯中毒诱导的肺泡上皮细胞上皮间质转化

目的:探讨HIF-1α信号通路在百草枯(paraquat,PQ)诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用机制。方法:使用20μmol/L浓度的百草枯溶剂对大鼠Ⅱ型肺泡上皮RLE-6TN细胞干预24 h,随后在倒置光学显微镜观察各组细胞形态学变化;用real-time PCR与Western blot法检测RLE-6TN细胞中HIF-1α、上皮表型标记蛋白E-cadherin及间质表型标记蛋白Vimentin的表达,Transwell侵袭实验检测各处理组细胞侵袭能力的改变;使用HIF-1α靶向si RNA抑制其表达后,进一步采用RT-PCR和Western blot检测HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表达水平,Transwell法检测细胞侵袭能力变化。结果:体外百草枯溶液可显著诱导大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞RLE-6TN细胞HIF-1α表达升高和上皮间质转化的发生,同时细胞的体外侵袭能力也增强。靶向沉默HIF-1α基因后,百草枯诱导的上皮间质转化过程被逆转,同时细胞侵袭能力显著减弱。结论:百草枯通过调控HIF-1α信号通路来诱导RLE-6TN细胞上皮间质转化的发生,进而促进肺纤维化的形成。     

FBW7泛素化修饰Snail促进上皮间质转化的实验研究

目的:探讨FBW7(F-box/WD repeat-containing protein 7)是否参与转录抑制因子Snail的泛素化修饰,通过调节上皮间质转化(EMT)进而导致非小细胞肺癌的侵袭和转移,为治疗非小细胞肺癌(NSCLC)患者晚期转移提供新的思路。方法:首先,通过Western Blot方法检测多种人肺细胞系中Snail的表达水平。上调(药物处理)及下调(设计并合成特异性sh RNA转染)H460细胞中FBW7的表达后,检测Snail的表达水平。采用平板克隆及Transwell方法检测下调FBW7的H460细胞形态改变和侵袭转移能力变化。结果:人非小细胞肺癌H460细胞中Snail表达水平较高。上调FBW7表达可使Snail表达下降,经蛋白酶抑制剂MG132处理后Snail表达升高;而下调FBW7表达后Snail表达增加。下调FBW7表达细胞后,细胞形态改变,侵袭转移能力增强。结论:FBW7参与了Snail泛素化修饰,进而经蛋白酶体途径将其降解引起EMT,导致肿瘤转移和进展的发生。     

Tim-3对宫颈癌细胞侵袭迁移的影响及机制研究

该文主要研究慢病毒介导的T细胞免疫球蛋白黏液素3(T-cell immunoglobulin mucin-3,Tim-3)对宫颈癌细胞的促肿瘤作用及其相关作用机制。首先,采用PCR方法获取Tim-3片段,将其克隆入pCDH载体中,并通过酶切和测序进行鉴定;将三个表达载体,即重组阳性表达载体(pCDH-Tim-3)、空载体(pCDH-NC)和绿色荧光蛋白载体(pCDH-GFP),分别与psPAX2和pMD2.G共转染至293T细胞中,最后形成相应的慢病毒组。然后,将三组慢病毒分别感染HeLa细胞,获得稳定细胞株(HeLa-Tim-3、HeLa-NC、HeLa-GFP),其中设置HeLa-NC为空载病毒阴性对照组;最后,通过观察HeLa-GFP组,初步获取慢病毒感染效率;运用流式细胞术、Western blot和细胞免疫荧光检测Tim-3的相对表达水平;细胞划痕和Transwell检测细胞的迁移及侵袭能力;Western blot检测上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal,EMT)相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、Snail)的表达变化;流式细胞术检测细胞凋亡率变化。该文成功构建了pCDH-Tim-3慢病毒表达载体并将其包装成慢病毒,获得对应的稳定细胞株;在HeLa-GFP中可以观察到大量的绿色荧光;与HeLa-NC组相比,Western blot、流式细胞术和细胞免疫荧光检测结果均表明,HeLa-Tim-3组的Tim-3蛋白表达水平显著升高(P0.05);细胞划痕实验和Transwell检测结果均表明,HeLa-Tim-3组的迁移侵袭能力明显提高(P0.01);另外,Western blot检测结果表明,与HeLa-NC组相比,HeLa-Tim-3组N-cadherin和Snail显著增多但E-cadherin明显减少(P0.05),而流式细胞术检测结果表明,HeLa-Tim-3组凋亡率显著减少(P0.001)。因此,高表达Tim-3宫颈癌细胞可以通过EMT转化和抑制细胞凋亡等相关作用机制来加强肿瘤的恶性进展。     

稳定干扰ITGB1抑制人乳腺癌BT549细胞迁移和侵袭

在人乳腺癌细胞系BT549中稳定干扰整合素β1(integrinβ1,ITGB1),研究其对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。构建靶向干扰ITGB1基因的sh RNA慢病毒,感染BT549细胞,通过筛选成功获得稳定干扰ITGB1蛋白的BT-549细胞系,实验设空白对照组(Blank)、病毒感染阴性对照组(shNC)、ITGB1-shRNA慢病毒感染组(shITGB1);Real-time PCR和Western blotting法检测稳定干扰后ITGB1 mRNA和蛋白的表达情况;Western blotting法检测稳定干扰ITGB1后上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关标志蛋白(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Fibronectin)的表达情况;利用划痕试实验和Transwell侵袭试实验分别检测稳定干扰ITGB1后细胞的迁移及侵袭能力。Real-time PCR和Western blotting结果显示,shITGB1组细胞ITGB1 mRNA和蛋白的表达水平显著低于Blank组和shNC组细胞(p0.01,p0.01)。Western blotting结果显示,稳定干扰ITGB1可部分逆转乳腺癌细胞BT549的EMT化;稳定干扰ITGB1后,上皮标志蛋白E-cadherin表达显著上调(p0.01),间质标志蛋白Vimentin(p0.05)、N-cadherin(p0.01)和Fibronectin(p0.01)的表达显著降低。划痕和Transwell侵袭试验实验结果显示,稳定干扰ITGB1后可显著降低乳腺癌细胞的迁移及侵袭能力(p0.05,p0.05)。在乳腺癌BT549细胞中稳定干扰ITGB1后,通过逆转EMT化抑制细胞迁移和侵袭。     

线粒体分裂蛋白FIS1通过诱导上皮间质转化促进肝癌侵袭与迁移

目的:研究线粒体分裂蛋白1(Mitochondrial fission protein 1,FIS1)介导的线粒体分裂对肝癌细胞侵袭与迁移的调控作用与机制。方法:采用免疫组化实验比较10对肝癌原发灶与转移灶组织中FIS1表达,以明确FIS1与肝癌转移的关系。通过si RNA干扰FIS1的表达后,用Transwell实验检测肝癌细胞迁移与侵袭能力的变化,q PCR与Western Blot检测上皮间质转化标志分子上皮型钙黏蛋白(epithelia cadherin,E-cadherin)、紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)、神经型钙黏蛋白(neural cadherin,N-cadherin)、波形蛋白Vimentin的表达。结果:肝癌转移灶组织中FIS1的表达显著高于原发灶组织。干扰FIS1表达后,肝癌细胞迁移和侵袭能力均明显下降,细胞上皮间质转化标志蛋白E-cadherin和ZO-1的表达上调,而N-cadherin和Vimentin的表达下调。结论:线粒体分裂蛋白FIS1在肝癌转移灶组织中高表达,并可能通过调节细胞上皮间质转化促进肝癌细胞转移。     

FOXG1在结直肠癌侵袭及转移中的作用及机制

构建叉头框G1(Forkhead box G1,FOXG1)的慢病毒干扰(shRNA)质粒及表达质粒,通过敲低和过表达FOXG1探讨其对结直肠癌细胞上皮-间质转化EMT的作用及其机制。应用Western blotting检测FOXG1在RKO、SW480、SW620、LOVO、DLD-1五种结直肠癌细胞中蛋白的表达水平,设计并合成FOXG1的shRNA片段(shFOXG1),运用DNA重组技术获得重组质粒,经双酶切技术及测序方法鉴定后进行慢病毒的包装、纯化及稳定转染,经筛选后获得稳定的结直肠癌细胞株,通过Western blotting和qRT-PCR技术检测FOXG1敲低和过表达效率及EMT关键因子E-cadherin、Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist mRNA和蛋白的变化,光学显微镜观察敲低后细胞形态学变化,通过划痕实验检测迁移能力变化,Transwell检测侵袭迁移能力的变化。5种结直肠癌细胞中,FOXG1在RKO细胞中蛋白表达量最高,而在DLD-1细胞中表达量最低,与对照组相比较,在RKO细胞中敲低FOXG1,细胞形态由长梭型变成了类圆形或者多边形,细胞极性和紧密连接增加,细胞迁移距离明显降低,侵袭转移穿过小室的细胞数也明显减少,EMT关键因子E-cadherin表达增高,Vimentin、Fibronectin、Snail、Twist表达降低,过表达FOXG1组则相反。FOXG1在结直肠癌中高表达,这种基因的高表达能够促进结直肠癌细胞的侵袭和转移,对结直肠癌细胞的EMT起着重要的调控作用。     

单宁酸协同顺铂增强肝癌HepG2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的激活水平

本文主要研究单宁酸(TA)联合顺铂(CDDP)对肝癌Hep G2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的影响,以探究TA协同CDDP抗肝癌的分子机制。用180μM TA、0.9μg/m L CDDP单独用药或者联合用药处理肝癌Hep G2细胞24 h和48 h后,利用实时荧光定量PCR技术(q-RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术检测细胞PERK、p-PERK、ATF4、CHOP、Procaspase3与Cleaved caspase3分子的表达水平。q-RT-PCR及Western Blot结果显示,TA与CDDP联合用药能显著上调细胞PERK、ATF4、CHOP的表达水平和Caspase3的剪切活化水平,下调PERK的磷酸化水平(P0.01或P0.05)。TA协同CDDP增强了肝癌Hep G2细胞内质网应激PERK-ATF4通路的激活水平,其可能是通过激活细胞ERS,促进PERK-ATF4通路相关分子和ERS标志性分子CHOP的表达,抑制PERK的磷酸化,从而促进Caspase3的剪切活化来诱导细胞凋亡的发生。     

NID1促进人卵巢癌细胞OVCAR-3侵袭转移及分子机制的研究

Nidogen-1(NID1)是新发现的一个候选卵巢癌诊断标志物,该研究旨在初探其在卵巢癌细胞中的生物学功能。首先构建稳定过表达外源NID1的人卵巢癌细胞系OVCAR-3,然后采用划痕实验和Transwell迁移和侵袭实验检测细胞的迁移侵袭能力,并通过荧光定量PCR和Western blot检测细胞中上皮–间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白和ERK/MAPK通路蛋白的表达情况。结果显示,与空载细胞相比,稳定过表达NID1的OVCAR-3细胞其划痕愈合能力、细胞迁移和侵袭能力均明显增强。较之空载细胞的上皮细胞样外形,稳定过表达NID1的OVCAR-3细胞呈间质细胞样外形,其上皮细胞标志分子E-cadherin表达下调,间质细胞标志分子(包括Vimentin和N-cadherin)和EMT相关转录因子Twist-2表达上调。此外,稳定过表达NID1的OVCAR-3细胞中ERK1/2的磷酸化水平升高,经ERK/MAPK通路的抑制剂U0126下调ERK1/2的磷酸化水平后其Ecadherin、Vimentin、N-cadherin和Twist-2表达水平出现逆转。这些结果提示,NID1可能通过激活ERK/MAPK通路促进卵巢癌细胞的EMT过程,进而增强其侵袭转移的能力。