氮源流加对Alcaligenes eutrophus积累聚β-羟基丁酸的影响

以真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)为 聚β羟基丁酸(PHB)的生产菌株,在分析了PHB发酵过程参数变化的基础上,进一步探讨了PHB合成期不同的硫酸铵流加速率对PHB合成的影响。研究结果表明,在PHB合成阶段,培养基中氮源的完全缺乏,导致细胞合成PHB能力的下降;在PHB合成期,不同的氮源流加速率对PHB合成过程存在着显著的影响,当流加速率较小时,尽管最终胞内PHB含量很高,但细胞干重、PHB浓度和PHB生产强度都较低。当氮源流加速率过大时,会导致最终胞内PHB含量显著下降,使PHB浓度和PHB生产强度降低。当硫酸铵流加速率在05g/h左右时,可以得到较好的发酵效果。     

真养产碱菌利用高果糖浆积累聚β-羟基丁酸的研究

真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)H16能以果糖为碳源在无机合成培养基上积累聚p-羟基丁酸(PHB)。将该菌用富含果糖的高果糖浆(HFS)培养,PHB的积累可达到果糖发酵水平,但发现高浓度的果糖和葡萄糖对菌体生长及PHB积累有抑制作用。采用补料分批培养技术可降低果糖和葡萄糖的抑制。并可大幅度提高产量,菌体干重达16—20g/L,PHB产量7.0—7.6g/L,PHB的产率达0.24g/g果糖。     

真养产碱菌由丁酸积累聚β-羟基丁酸的研究

真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)H16(ATCC 17699)能以丁酸为唯一碳源在无氮合成培养基中积累大量生物可降解的聚β-羟基丁酸(PHS)。将此菌在丰富培养基中预培养36小时后转入无氮合成培养基甲,在30℃、pH8．0条件下培养48小时,积累的PHB可达细胞干重的63％(w／w)。较高浓度的丁酸对PHB的积累有抑制作用。采用丁酸自动流加法控制pH值的工艺可降低丁酸的抑制作用。此时PHB的产率达0．4g/g丁酸,PHB比产生率60)达0．1g·g生物量-1·h—-1。     

真养产碱杆菌聚羟基烷酸合成酶基因在欧文氏菌中的表达

将含有真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)合成聚羟基烷酸(PHA)基因(phaCA3)的质粒pTZl8U—PHB改造成为具有卡那霉素抗性的质粒pJMCl．并以电击法将pJMCl引入利用碳源广泛的胡罗卜软腐欧文氏茵(Erwinia carotovora)非致病菌系(Eccl3B)中,phaCAB可获得高效表达,膨大的转基因菌[Eccl3B(pJMCl)]细胞内几乎充满PHA颗粒。以蔗糖为碳源,初步在5L发酵罐中对转基因菌进行分批补料培养35h,菌体干重达28g／L,PHA占菌体干重的68％,具有生产潜力。将该菌合成的PHA提取纯化(纯度达99％)后,进行核磁共振分析,发现它只有单一的聚-β-羟基丁酸(PHB)组分。     

真养产碱杆菌积累聚-β-羟基丁酸发酵条件的研究

对Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ培养过程的研究表明,氮源的限制或缺乏刺激细胞大量积累聚－β－羟基丁酸（ＰＨＢ）,但ＰＨＢ合成期氮源的完全缺乏,会导致细胞的ＰＨＢ合成速率迅速下降,氧的限制也可刺激Ａ．ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ合成ＰＨＢ,但胞内ＰＨＢ的积累远小于氮源控制下的情况。在细胞的不同生长期限制氮源的供应会明显影响ＰＨＢ的发酵过程,当残留菌体浓度达到２０ｇ／Ｌ至３０ｇ／Ｌ时停止流加氮水,可     

溶氧振荡对聚β羟基丁酸混合培养过程的调控作用

研究生物可降解塑料PHB(Poly β-hydroxy butyrate)生产的低成本和高产率发酵。采用廉价碳源——废食品糕点作为原料,其中同时具有葡萄糖和乳酸。培养是在同一5L发酵罐中先后接入2种细菌,先由乳酸杆菌Lactobacillus delbrueckii消耗葡萄糖产生乳酸,再由真养产碱菌Ralstonia eutrophus消耗乳酸产生PHB。本文应用混沌控制理论设计溶氧振荡来协调混生菌矛盾的生理需求,同时改变振荡节律激励细胞的代谢能。考虑真养产碱菌在乳酸里的代谢,有异养和真养两种途径,其中两种重要代谢通量,生物氧化能ATP和还原能NADPH,能够反映混生菌细胞的生理状态,二者都与供氧密切有关。实验通过取样进行细胞破碎后,由荧光分析仪监测不同发酵阶段的ATP和NADPH,发现2种代谢能随着溶氧控制的不同节律变化而起伏,溶氧节律振荡能够使混合培养的PHB的浓度比常规供氧方法提高1倍。     

富锌酵母的选育及培养条件研究

对402株不同种属的酵母菌株进行了出筛、复筛、单倍体分离、诱变,从亲株Y-6-16-18（a met）accharomyces cerevisiae）和Y378-4-15（α-leu）（Sacharomyces kluyveri）的杂交菌株中选育到一株富锌酵母菌株（编号为ZGH374）。并初步优化了发酵条件：培养基为80g/L糖浓度的麦芽汁、10g/L蛋白胨、锌添加量400μg/mL,pH 6.0,装液量40mL/250mL三角瓶,接种量10%（V/V）,培养起始添加锌盐,培养时间30h。在优化的条件下,杂交菌株ZGH374的生物量（细胞干重）达到14.3g/L,细胞锌含量可达到9.3mg/g,锌总含量达到了133mg/L。     

青霉PT95菌株固态发酵产生类胡萝卜素的研究

本文对青霉Penicillium sp. PT95菌株在固态发酵条件下菌核内产生类胡萝卜素进行了初步研究。结果表明,在3种固态发酵培养基中,玉米粉培养基(SMA)比麸皮培养基和棉籽壳培养基更适合于PT95菌株固态发酵产生类胡萝卜素。为了增加菌核干重和提高类胡萝卜素产率,SMA中需要添加氮源、碳源和植物油。在所试的各种氮、碳源中,以硝酸钠和麦芽糖效果最佳。通过正交试验确定了在培养基盐溶液中添加硝酸钠3g/L,麦芽糖10g/L,豆油2.5g/L能使菌核干重由536g/100g提高到970g/100g(干料);类胡萝卜素产率由2149μg/100g提高到5260μg/100g(干料);β-胡萝卜素在类胡萝卜素中的含量由614%提高到71.3%。     

碳源和氮源对水母雪莲悬浮培养细胞生长和黄酮合成的影响

在MS培养基上进行水母雪莲(Saussurea medusa Maxim)细胞悬浮培养时研究了碳源和氮源的影响。结果表明碳源以蔗糖最适合,蔗糖浓度则以40g/L较好,细胞生长量干重为18.12g/L,总黄酮合成量达到1423.25mg/L。在培养过程中,水母雪莲细胞能够快速将蔗糖水解为葡萄糖和果糖,并首先利用葡萄糖。氮源总浓度(包括NH⁺₄和NO^-₃)为60～120mmol/L,NH⁺₄/NO^-₃比例为20/40有利于雪莲细胞生长和黄酮合成。用HPLC检测显示4′,5,7-三羟基3′,6-二甲氧基黄酮(Jaceosidin)和4′,5,7-三羟基-6-甲氧基黄酮(Hispidulin)2种黄酮的含量分别达到细胞干重的1.46%和0.010%     

积累PHB菌种隐藏嗜酸菌DX1-1的诱变改良

采用紫外线照射和放射性元素钴60辐射诱变方法,对分离纯化的一株可积累聚β-羟基丁酸酯(PHB)的Acidiphilium cryptumDX1-1进行了诱变改良,以获得PHB高产菌.结果显示钴60诱变最佳诱变剂量为100 Gy,紫外诱变的最佳剂量为15 W、30 cm、60 s,紫外诱变的效果比钴60诱变的效果好.诱变后筛选得到的一株菌UV60-3,PHB含量达到28.56 g/L,是原菌株的1.45倍,并且可稳定遗传.对菌株UV60-3积累PHB的碳氮比进行了探索,结果显示在碳源浓度60 g/L,氮源浓度30 g/L,C/N为3.76时PHB含量最高,PHB含量达到30.57 g/L.     

氮源NH4Cl浓度对粪产碱杆菌发酵生产热凝胶的影响

研究了利用粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis)发酵生产热凝胶的发酵条件 ,氮源是菌体生长的限制性底物 ,单纯地提高初始底物 (氮源 )浓度并不一定能促进细菌的生长和产物的合成。在分批发酵过程中 ,底物消耗导致培养环境pH的改变也是影响细菌进一步生长和产物合成的重要因素。通过增加培养基中初始氯化铵的浓度并同时控制发酵过程的pH条件 ,得到了较高的菌体浓度 ,热凝胶的合成水平也得到了显著提高。当培养基中NH₄Cl浓度提高到3.6g/L时 ,菌体浓度达到72g/L ,热凝胶合成的产量可达 30.5g L ,比原来NH₄Cl浓度为11g L时提高了51.7%。提高菌体浓度意味着需要提高溶氧水平来满足细菌的生长和代谢。初始氮源NH₄Cl浓度的增加虽然能使菌体浓度得到提高 ,但发酵过程对溶氧的需求也相应增加 ,需要提高搅拌转速和通风以增加供氧水平。但高搅拌速率产生的高剪切力对热凝胶的凝胶性能将产生破坏作用 ,因此在发酵过程中需要综合考虑细菌培养密度对合成热凝胶产量和质量的影响。     

营养条件和流加发酵对放射型根瘤菌（Rhizobium radiobacter）产辅酶Q10的影响

利用放射型根瘤菌WSH2601（Rhizobium radiobacter WSH2601）重点考察了葡萄糖、蔗糖、玉米浆和蛋白胨、添加物以及流加发酵对细胞生长和产辅酶Q₁₀的影响,结果表明, 葡萄糖和蔗糖适合于生产辅酶Q₁₀的最佳浓度分别为30 g/L和40 g/L;辅酶Q₁₀发酵时玉米浆和蛋白胨的最适浓度分别为11g/L和16g/L;添加蕃茄汁、玉米浆能提高发酵液的生物量,玉米浆、异戊醇、L-甲硫氨基酸等能促进辅酶Q₁₀的积累;与分批发酵相比,在7L罐上流加蔗糖其细胞生物量（DCW）和辅酶Q₁₀积累量增加,若在流加蔗糖的同时流加适当浓度的玉米浆能显著提高辅酶Q₁₀的产量,最大产量达到52.4 mg/L;最大生物量（DCW）和胞内辅酶Q₁₀含量（C/B值）分别达到26.4 g/L和2.38 mg/g-DCW,比不流加的分批发酵分别提高53%和33%,比只流加蔗糖分别提高24%和26%。     

碳酸钙促进丙酮酸发酵过程中α-酮戊二酸的形成

在多重维生素营养缺陷型菌株光滑球拟酵母CCTCC M202019发酵生产丙酮酸的摇瓶和发酵罐实验中发现,CaCO₃的添加对发酵液中α-酮戊二酸（α-KG）的积累有重要影响。在维生素浓度不变且供氧充分的前提下,延迟CaCO₃添加时间可明显抑制α-KG的产生,并提高丙酮酸与α-KG的碳摩尔比(C_PYR/C_αKG);而增加培养基中的CaCO₃浓度会导致αKG积累的增加。用不同物质调节发酵液中pH的实验证实：在丙酮酸发酵过程中, Ca²⁺对αKG的积累起主要作用,CO₃^2-起辅助作用,两者对α-KG的积累具有协同效应。维持培养基中CaCO₃浓度不变,改变培养基中硫胺素的浓度,对αKG的积累,特别是对C_PYR/C_α-KG值没有影响;而增加培养基中生物素的浓度,则导致αKG的浓度不断上升且C_PYR/C_α-KG值不断下降。当有Ca2+存在时,胞内丙酮酸羧化酶的活性最高可提高40%,而丙酮酸脱氢酶系的活性没有明显变化。结果表明,丙酮酸发酵过程中α-KG的形成是由于CaCO₃促进了丙酮酸羧化反应,其中Ca²⁺可显著提高丙酮酸羧化酶的活性,而CO₃^2-则有可能作为丙酮酸羧化反应的底物。     

重组嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila 4AK4中3-羟基丁酸3-羟基己酸共聚酯PHBHHx的发酵生产

3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚酯（PHBHHx）是一种性能优良的新型生物可降解材料,其机械和加工性能与3-羟基己酸（3HHx）在共聚物中的含量密切相关。在嗜水气单孢菌Aeromonas hydrophila 4AK4中引入了编码β酮基硫解酶 (β-ketothiolase)的phbA基因和编码乙酰乙酰辅酶A还原酶(AcetoacetylCoA reductase)的phbB基因,使重组菌增加了一条利用乙酰辅酶A合成3羟基丁酸-CoA的代谢途径,这使得利用非相关性碳源调控PHBHHx的单体组成比例成为可能。利用葡萄糖酸钠和月桂酸作为碳源,对重组Aeromonas hydrophila 4AK4进行了摇瓶培养及5 L发酵罐培养的研究。在摇瓶实验中,通过改变碳源中两种组分的比例,可以使A. hydrophila 4AK4合成的PHBHHx中的3HHx摩尔含量由原来的15%左右降低到3%～12 %,成功地实现了对PHBHHx单体组成的调控;当以月桂酸为唯一碳源时,在5 L发酵罐中,经过56 h的培养,获得了51.5 g/L的细胞干重（CDW）,其中62 %为PHBHHx,3HHx在PHBHHx中的摩尔含量为9.7 %;当以1:1的葡萄糖酸钠和月桂酸为碳源时,48 h的5 L发酵罐培养获得了32.8 g/L的CDW和52 %的PHBHHx含量,其中3HHx在PHBHHx中的摩尔含量为6.7 %。结果证明了该重组菌在大规模生产单体组成可控PHBHHx方面具有很大的应用潜力。     

真养产碱菌利用高果糖浆积累聚β-羟基丁酸的研究

真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus)H16能以果糖为碳源在无机合成培养基上积累聚p-羟基丁酸(PHB)。将该菌用富含果糖的高果糖浆(HFS)培养,PHB的积累可达到果糖发酵水平,但发现高浓度的果糖和葡萄糖对菌体生长及PHB积累有抑制作用。采用补料分批培养技术可降低果糖和葡萄糖的抑制。并可大幅度提高产量,菌体干重达16—20g/L,PHB产量7.0—7.6g/L,PHB的产率达0.24g/g果糖。     

E.aero高产1.3-丙二醇菌株发酵条件的研究(Ⅱ)

建立了1.3-丙二醇高产菌株(Enterobacter aerogenes简写为E.aero-N-56)1.3-PD厌氧发酵最适pH值、温度、时间、接种量分别为7.0、30℃、48h、9％;在最适发酵条件下,30L发酵罐中E.aero-N-56菌株1.3-PD产量为47.36g/L,生产率为23.68g/L·d。     

一株新型高产PHB假单胞菌SCH17的分离和特征分析

通过丁醇富集筛选,从土壤样品中筛选到一株菌株SCH17。经过生理特性和16S rRNA分析,鉴定菌株SCH17属于假单胞菌属。透射电镜显示该菌细胞内聚集了大量颗粒状物质,经过氯仿抽提和核磁共振分析,确认这些颗粒物质是聚β-羟基丁酸(PHB)。通过对碳源和氮源的优化,得到最佳积累PHB的碳源是果糖,氮源是蛋白胨。在该培养基中仅需发酵14 h,菌体干重和PHB含量均达到最大,分别为3.52 g/L和2.69 g/L,PHB含量高达细胞干重的76%。     

用重组大肠杆菌JM109(pKST11)转化苯生产顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯

顺-1,2-二羟基-3,5-环己二烯（简称DHCD）是航天业、电子工业、医药业以及精细化工业上重要的手性化合物。利用重组E. coli JM109 (pKST11),采用适时监测发酵过程中全细胞甲苯双加氧酶（Toluene dioxygenase,TDO）活性的方法,研究了发酵生产DHCD工艺中的重要影响因子IPTG以及底物苯的供给方式对DHCD产量的影响。研究结果表明：（1）发酵初期利用IPTG诱导TDO的表达,不利于细胞生长,在对数生长中期（6或8h）,采用0.5mmol/L IPTG即可诱导出TDO的最高表达。（2）发酵液中的苯对全细胞甲苯双加氧酶(TDO)的活性有抑制作用,而利用液体石蜡作为缓释剂进行两相法发酵则降低了苯的毒害,明显提高了DHCD的产量。当采用传统的通气供苯方法,DHCD的产量仅有75 g/L;批式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量提高到226 g/L,是通气供苯法的3倍;而采用流加的方式添加液体石蜡与苯的混溶物使DHCD的产量进一步提高到368 g/L,是通气供苯法的5倍。证明通过发酵工艺的优化可以解决苯的毒害与苯作为反应底物在水相中需要有一定浓度之间的矛盾,获得较好的转化结果。     

补料培养提高真养产碱杆菌产3-羟基丁酸和3-羟基戊酸共聚物生产强度的研究

对Alcaligeneseutrophus进行高密度培养 ,研究表明在发酵过程中进行有效控制 ,可以较大幅度地提高 3-羟基丁酸和 3 羟基戊酸共聚物 [P(3HB-co-3HV) ]的生产强度。实验中选择使用限氮的方法积累P(3HB-co-3HV) ,分别采用丙酸和戊酸为 3HV前体 ,对摇瓶种子生长状态 ,停氮时机对菌体生产P(3HB-co-3HV)的影响以及补酸 (3HV前体 )策略进行了研究 ,在 6.6L罐中 ,以葡萄糖为碳源 ,以丙酸为 3HV前体培养 5 0h ,细胞干重 ,PHA产量 ,PHA含量分别达到 149.9g L ,12.49g L ,83.3% (其中 3HV组分占PHA的 12 4mol% ) ,生产强度达到 2.50 (g·h^-1·L^-1) ;以戊酸为3HV前体培养 45h ,细胞干重 ,PHA产量 ,PHA含量分别达到 16.02g L、119 0g L、74.2 % (其中 3HV组分占PHA的17.7mol% ) ,生产强度达到 2.64(g·h^-1·L^-1)     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一