适用于中国人群的隐匿性乙肝病毒感染的检测方法优化研究

隐匿性乙肝病毒感染的诊断,通常使用巢式PCR的方法,来检测血清中的HBV DNA。因中国人群感染乙肝病毒的基因型与国外人群存在差异,故本研究的目的是对现有文献已经介绍的诊断隐匿性乙肝病毒感染的PCR检测方法进行优化,从而适用于中国隐匿性乙肝病毒感染人群的诊断。本研究通过对文献报道的巢式PCR检测方法进行验证,发现其Core/pre-core区段扩增结果不理想,故根据我国乙肝病毒的基因型以及HBV C基因的保守性原则自行设计优化实验。利用临床收集的HBV阳性样本验证其灵敏度及特异度;收集父亲或/和母亲为HBV阳性患者,而孩子HBs Ag结果为阴性的样本来验证其扩增结果。本研究优化设计的检测HBV C基因的引物,具有灵敏度高特异性好的优点。本研究临床收集了100份父亲或/和母亲为HBV阳性患者,而孩子HBs Ag结果为阴性的血清样本,用本研究优化后的引物检测,可以提高隐匿性乙肝病毒的检测分辨率,提高了4倍的检测效率。本研究优化设计的隐匿性乙肝病毒感染的引物可以用于中国人群中隐匿性乙肝病毒感染的检测,具有较高的灵敏度和特异性。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中 的初步应用

目的:探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法:将已构建的含5种目的基因的表达载体(pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6),分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2+亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果:五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论:Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、Hsp16.3和ESAT6在血清学检测中的初步应用

目的：探讨结核分枝杆菌分泌蛋白Hsp16.3、Ag85B以及融合蛋白ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6用于TB病人血清学检测的意义。方法：将已构建的含5种目的基因的表达载体（pProEXHTb-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B、pProEXHTb-ESAT6-CFP10、pProEXHTa-Ag85B-Hsp16.3、pProEXHTa-Ag85B-ESAT6）,分别转入宿主菌E.coli DH5α中,诱导表达后分别获得Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6五种蛋白,采用Ni2＋亲和层析柱进行纯化,并用透析方法进行目的蛋白的复性。将经过复性的5种蛋白分别作为抗原,采用间接ELISA方法检测待测的血清样本,经OPD显色,测定各孔OD490值并判定结果。结果：五种蛋白被成功纯化并复性,通过ELISA方法共检测了22例TB病人血清、10例非结核病人血清和6例正常对照血清,Hsp16.3、Ag85B、ESAT6-CFP10、Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6这5种抗原的灵敏度分别为36.4%、90.9%、77.3%、95.5%、100%,特异性分别为100%、75%、100%、93.8%、93.8%。统计分析显示,ESAT6-CFP10和Ag85B、Ag85B-Hsp16.3、Ag85B-ESAT6这三种蛋白ELISA检测的结果无差异,而与Hsp16.3和痰涂片检测结果有显著差异。结论：Ag85B-Hsp16.3和Ag85B-ESAT6可作为结核分枝杆菌ELISA检测的初选抗原。     

血清肿瘤标志物

血清肿瘤标志物检测由于取材简便、方法易行并且在某些肿瘤发生之前就有表达,已成为人们诊断肿瘤早期的首选方法;由于单一的血清肿瘤标志物检测准确率不高,导致其在临床上的应用价值受到怀疑。近年来的研究发现,将几种血清肿瘤标志物联合使用可以提高其对肿瘤早期诊断的灵敏度和特异性。因此,寻找新的血清肿瘤标志物是目前肿瘤早期诊断的研究热点。本文综述了新发现的一些血清肿瘤标志物如CSTB、MKRN1、DKK-1、MSMB等及相关研究进展。     

应用免疫-PCR检测癌症的初步研究

探索一种简便、灵敏度高、特异性强且易推广的血清中突变型p53蛋白检测方法,用于肿瘤早期诊断.用突变型p53蛋白的单克隆抗体,与特定DNA片段连接制成基因探针,用免疫-PCR技术,对117例病人血清样品进行检测 .在117例病人血清样品中,检测总阳性率为41.88%(49/117),在临床怀疑为癌症及肿瘤病人中阳性率达52.11%(37/71).     

基于上转磷光颗粒的AFP免疫层析定量检测

目的：建立了上转磷光免疫层析快速定量检测AFP的方法,用于原发性肝癌的诊断。方法：利用上转磷光标记的双抗夹心免疫层析技术检测血清中AFP的含量。将AFP单克隆抗体分别标记上转磷光颗粒并包被硝酸纤维膜,制成免疫层析检测试纸。评价该试纸的灵敏度、特异性和精密度。并通过临床50例血清样本,探讨上转磷光技术与化学发光检测方法的一致性。结果：该方法能在20min内完成,检测灵敏度达5ng/ml。浓度范围从5-1000ng/ml作标准曲线,呈现较好的线性。通过三组平行实验探讨其精密度,变异系数都在10%以内。应用于其它肿瘤标志物如CEA、CA199、AFU和NSE的检测,无交叉反应。与化学发光相比,决定系数R2=0.9692,一致性较好。结论：该方法简便、快速、廉价,可以实现定量,尤其适合基层门诊和体检现场使用。     

应用免疫-PCR检测癌症的初步研究

探索一种简便、灵敏度高、特异性强且易推广的血清中突变型ｐ５３蛋白检测方法,用于肿瘤早期诊断。用突变型ｐ５３蛋白的单克隆抗体,与特定ＤＮＡ片段连接制成基因探针,用免疫－ＰＣＲ技术,对１１７例病人血清样品进行检测。在１１７例病人血清样品中,检测总阳性率为４１．８８％（４９／１１７）,在临床怀疑为癌症及肿瘤病人中阳性率达５２．１１％（３７／７１）。     

胶体金渗滤方法检测乙肝患者血清中乙肝核心抗体的研究

目的:建立胶体金免疫渗滤法检测乙肝患者血清中乙肝核心抗体(anti-HBc Ig M)抗体的方法,评价其灵敏度、特异性和重复性。方法:预先在硝酸纤维素膜上包被乙肝核心抗原HBc Ag,将血清或者血浆加在硝酸纤维素膜上,血清或者血浆中的anti-HBc Ig M与HBc Ag结合。洗涤去掉非特异结合,加入胶体金标记的抗人-Ig M,洗涤去掉没有结合的抗人Ig M抗体。硝酸纤维素膜上的抗原-Ig M-抗人Ig M形成的"三明治"复合物呈现红色圆点,证实实验有效。结果:102份乙肝患者血清,anti-HBc Ig M阳性标本99份。检出率97%。50份正常血清中,有一份检测结果弱阳性,特异性98%。结论:胶体金免疫渗滤法检测anti-HBc Ig M敏感性高、特异性强、重复性好,且方便快捷,不需要特殊的仪器设备,在anti-HBc Ig M快速检测上有广阔的应用前景。     

乙型肝炎病毒感染Babl/c乳鼠动物模型的研究

目的:目前HBV感染动物模型各有局限,无法全面研究HBV。拟建立人HBV血清感染Babl/c乳鼠的动物模型,以便于研究HBV感染与乳鼠免疫力低下的相关性。方法:将20只Babl/c乳鼠随机分为实验组、对照组、PBS组及空白组,通过高压水动力尾静脉注射法将人HBV血清、正常人血清、PBS注入各组乳鼠体内,记录接种后乳鼠体温及体质量。于接种后第7、15、30 d采集血清标本,应用ELISA检测HBs Ag、HBe Ag的表达情况,实时荧光定量PCR检测HBV DNA浓度。结果:接种后各组小鼠体温及体质量均无明显变化。实验组中共4只乳鼠可检测到HBs Ag为阳性且维持时间长达30 d,但HBe Ag均为阴性,HBV DNA浓度均未达500 IU/ml;余下各组检测HBs Ag、HBe Ag均为阴性。结论:通过高压水动力尾静脉注射法接种人HBV血清,可成功使Babl/c乳鼠感染HBV。本实验证实乳鼠免疫力低下,HBV血清进入体内未能有效清除,对HBV存在易感性,为建立HBV感染动物模型提供实验依据,可用于研究HBV对免疫状态的影响。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用

目的:建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法:用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值(均值+3标准差)。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果:在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72.14%(51/70);69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98.6%(1/69)。结论:建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

量子点免疫层析快速定量检测HCG

近年来,量子点以其独特的光学性质被广泛应用到医学检测上.血清中人绒毛膜促性腺激素(HCG)的含量是诊断早期妊娠的常用指标,也可用于异常妊娠性疾病的早期发现和鉴别诊断.本文采用超声乳化法制备了高质量的亲水性量子点,并将其与免疫层析试纸条技术相结合,在此基础上自主研发了用于试纸条检测的量子点免疫荧光检测仪,对血清中HCG的含量进行了高灵敏度的快速定量检测.结果表明,对于血清中的HCG含量检测,最优检测条件为加样体积50μl,反应时间15 min,检测的灵敏度达到0.85 U/L,高于商品化的胶体金试纸条.这种检测技术简单、快速、灵敏,有望在其他蛋白质类标志物的检测中得到广泛应用.     

抗乙型肝炎病毒表面抗原单克隆抗体的研究Ⅱ．抗HBsAg单克隆抗体的实际应用

本文用抗HBs／a McAb腹水用亲和层析法有效地提纯了HBsAg,回收率较高,并进行了CIEP检测临床血清标本,沉淀线清晰,检测灵敏度高于抗HBsAg血清。将抗HBs／a和抗HBs／d二种McAb提纯后制备诊断血球,进行RPHA检测临床血清标本千余例,并经美国Abbott实验室RIA试剂盒验证,表明其阳性检出率与中和试验符合率较国内目前以PcAb制备的诊断血球为优,显示了良好的特异性、灵敏度和准确性。抗HBsAgMcAb可作为新一代的HBsAg检测试剂。     

新型布尼亚病毒抗体检测方法的建立及初步应用简

目的：建立新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法。方法：用基因工程重组表达的新型布尼亚病毒NP抗原包被酶联板,建立间接ELISA法检测新型布尼亚病毒IgG抗体,并进行特异性和灵敏度评价,健康人群中检测结果计算临界值（均值＋3标准差）。检测70例发热伴血小板减少综合征患者恢复血清和69份健康人血清样品。结果：在70份患者血清样品中,检测出新型布尼亚病毒IgG抗体阳性51例,阳性率为72．14％（51/70）;69份健康人血清样品中,检测出1份阳性,特异性为98．6％（1/69）。结论：建立的新型布尼亚病毒IgG抗体ELISA检测方法特异性强、灵敏度高,可用于新型布尼亚病毒感染的检测及流行病学调查。     

应用双向热循环消减SELEX技术筛选肺癌血清核酸适配体

肺癌是发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。现阶段,用于肺癌早期诊断的血清肿瘤标志物因其特异性与敏感性均较低,严重影响肺癌的临床诊断和治疗。本文用双向热循环消减指数富集的配基进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)技术,筛选肺癌和非癌血清标志物的核酸适配体,建立肺癌的检测方法,提高诊断和治疗效率。实验用环氧基琼脂磁珠为筛选介质,以非癌混合血清、肺癌混合血清作为双向靶标。应用热循环消减SELEX技术,经19轮筛选分别获得非癌和肺癌血清的特异性核酸适配体。通过高通量测序,得到 40条非癌核酸适配体序列和 41条肺癌核酸适配体序列。从肺癌与非癌血清特异性核酸适配体序列中分别挑选出高丰度的 4条序列,合成后制成检测试剂,经临床血清验证,阳性率为 90%。该检测方法检测灵敏度高,为肺癌的早期诊断和治疗提供了新的分子识别元件。     

结核分枝杆菌多表位诊断抗原的制备

将结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)多个B细胞预测表位串联表达(命名为B102),并初步评价其作为诊断抗原的血清学诊断价值。将MtbPstS1、ESAT6、CFP10、Ag85B、Ag85A及PPE54等6个蛋白的11个B细胞预测表位串联,加入合适的连接臂后全基因合成;将多表位片段插入带有TRX标签的表达质粒中,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并利用Ni~(2+)-Chelating亲和层析和DEAE阴离子交换层析纯化目的蛋白;利用Western blotting (WB)技术对目的蛋白抗原性进行鉴定,并建立Mtb抗体检测竞争法ELISA技术,初步评价此方法对阴阳血清样本的鉴别能力。目的蛋白以包涵体形式存在,其表达量约占菌体总蛋白的31.25%,经纯化及复性后蛋白B102可溶性存在,浓度为3.124mg/mL,纯度为96.71%;WB实验表明目的蛋白能与Mtb阳性血清相应抗体发生反应。对60份Mtb阳性血清及60份Mtb阴性血清进行检测得出其灵敏度为90.00%,特异性为93.33%,阳性预测值为93.10%,阴性预测值为90.32%,符合率为91.67%,McNemer检验的结果提示与"金标准"诊断结果无差异,Kappa=0.833,提示两种方法诊断结果一致性优异。原核表达与层析纯化可以获取抗原性优异的Mtb多表位诊断抗原,作为诊断抗原可以应用于Mtb的血清学检测中。     

乙肝患者HBsAg定量与乙肝病毒DNA定量及谷丙转氨酶水平的相关性研究

目的:探讨乙型肝炎患者血清中乙肝表面抗原(HBs Ag)定量与乙肝病毒(HBV)DNA定量及谷丙转氨酶(ALT)水平的相关性。方法:收集124例乙肝患者血清,采用化学发光法检测HBs Ag水平,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA水平,采用全自动生化分析仪检测ALT水平,分析三者之间的相关性。结果:HBs Ag水平与HBV-DNA含量存在正相关性,HBV-DNA含量与ALT水平存在正相关性,而HBs Ag水平与ALT水平无明显相关性。结论:联合检测3项指标可对乙肝患者HBV感染、复制、传染性以及机体的免疫性做出准确判断。     

实时定量RT-PCR对乙型肝炎病毒全长RNA(fRNA)的定量检测

目的:建立一种简便的定量检测慢性乙型肝炎患者血清中终止于聚腺苷酸化位点的乙型肝炎病毒全长RNA(f RNA)的方法。方法:选取53例未治疗的乙型肝炎患者及22例HBs Ag阴性的健康者为研究对象,使用锚定oligo-d T的引物对其血清中f RNA进行实时定量反转录PCR检测,统计分析其与HBV DNA、HBcr Ag和HBe Ag的相关性。结果:对f RNA进行实时荧光定量RT-PCR检测的下线为2.3 log copies/ml,标准曲线的相关系数为0.99(P0.0001)。53例乙型肝炎患者中,29例(54.7%)可以检测到f RNA,22例正常对照中没有检测到f RNA。27例HBe Ag阳性和/或高水平HBV DNA的患者全部检测到f RNA,26例HBe Ag阴性并且低水平HBV DNA的乙型肝炎患者中有2例(7.7%)检测到f RNA(P0.0001)。HBe Ag阳性患者血清中f RNA水平高于HBe Ag阴性患者(5.0±0.3 vs.2.9±0.4 log copies/ml,P0.001)。f RNA与HBV DNA/HBcr Ag具有显著相关性(r=0.905、0.881,P0.0001)。Hayashi's定量分析法I显示f RNA与HBV DNA相关性强于其与HBcr Ag的相关性。结论:与HBV DNA和HBe Ag一样,f RNA可作为常规检测判断HBV的复制水平并指导用药。     

乙型肝炎病毒核心抗体IgM的蛋白芯片检测法研究

目的:探索蛋白芯片技术检测乙型肝炎病毒(HBV)抗HBc-IgM的可行性。方法:应用Nano-Plotter TM-压电式微量喷墨点阵制备系统自制的核心抗原蛋白芯片在经10%山羊血清封闭后加入待测血清37℃孵育,PBST清洗晾干后后再次加入检测抗体即HRP-抗人Ig M抗体,芯片用伯乐成像仪检测有无信号。结果:24份HBs Ag和抗HBc阳性血清中经蛋白芯片检测抗HBc-IgM阳性率为83.3%(20/24);24份健康志愿者血清中经蛋白芯片检测抗HBc-IgM阳性率为4.1%(1/24)。乙肝血清与健康志愿者血清化学发光信号差异明显。结论:蛋白芯片技术可较好地应用于定性检测HBV抗HBc-IgM,为临床快速判断是否存在HBV感染和监测慢性肝炎HBV活动性提供新的辅助诊断方法。     

化学发光蛋白芯片用于检测肝癌患者血清CA19-9水平的方法研究

目的:探讨一种简单、有效、低成本、低耗时的化学发光蛋白芯片方法用于检测血清中的糖链抗原19-9(Carbohydrate Antigen19-9,CA19-9),以有助于对原发性肝癌的早期辅助诊断。方法:预先在醛基芯片上包被鼠源CA19-9单克隆抗体,建立CA19-9抗体蛋白芯片,共筛选出46份肝癌血清和32份正常健康人血清,然后用蛋白芯片方法进行检测,并以化学发光成像对检测结果进行判定。结果:24份肝癌血清的CA19-9水平高于37 U/m L,22份肝癌血清的CA19-9水平低于37 U/m L;30份正常人血清CA19-9含量低于37 U/m L,2份正常人血清的CA19-9含量为37 U/m L;灵敏度为52.17%,特异性为93.75%,ROC曲线下面积0.688[95%CI:0.566,0.811]。结论:本研究成功的建立了血清CA19-9的化学发光蛋白芯片检测方法。     

结核分枝杆菌CysA2抗原的基因克隆、表达及在血清诊断中的应用

目的 克隆并构建结核分枝杆菌CysA2基因原核表达系统,建立基于rCysA2的ELISA并检测rCys A2-ELISA在肺结核患者血清学诊断中的敏感性和特异性.方法 采用PCR扩增CysA2基因,构建CysA2基因原核表达系统.采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白rCysA2表达情况,Ni-NTA亲和层析法提纯rCysA2,免疫印迹鉴定rCysA2的免疫反应性.以rCysA2为包被抗原,建立rCysA2-ELISA并用于检测132例血清抗体,其中涂片阳性和阴性肺结核患者血清分别占96例和36例,非肺结核肺部疾病病人血清抗体30例,健康对照血清50例.结果 克隆的CysA2基因与GenBank中相关序列相似性为100％.rCysA2表达量为细菌总蛋白的25.4％.提纯的rCysA2在SDS-PAGE后显示为单一的蛋白条带.rCysA2-ELISA检测涂片阳性和涂片阴性的肺结核患者血清抗体检出率分别为63.5％和61.1％,50例健康对照全部阴性、30例非肺结核肺部疾病患者1例呈现阳性,此方法的灵敏度为62.9％(83/132),特异性为98.8％ (79/80).结论 本研究成功地克隆并构建了结核分枝杆菌CysA2基因及其原核表达系统.以rCysA2为包被抗原的rCysA2-ELISA方法有较高的灵敏度和很好的特异性,能有效检测涂片阴性患者血清抗体,rCysA2有望成为结核病血清诊断的有效候选抗原之一.