GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11进行全基因组序列测定与分析

为了对GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11进行全基因组序列测定,了解其分子特征及基因类型。方法是根据GenBank上下载的GI型诺如病毒各基因型代表株保守序列设计特异性引物对2008/Huzhou/N11进行全基因组测序,并与GI型诺如病毒各基因型的原型株进行全序列的比对,使用MEGA 4.0软件绘制系统进化树。利用Simplot3.5.1软件进行相似性分析,对基因重组加以验证。结果表明,诺如病毒2008/Huzhou/N11基因组全长7 691bp,有3个开放阅读框(ORF)。ORF1长5 367bp(5~5 371nt),ORF2长1 623bp(5 355~6 977nt),ORF3长630bp(6 977~7 606nt)。RNA聚合酶区(4 320~5 091bp)系统进化分析显示2008/Huzhou/N11属于GI.2基因型,VP1区(5 355~6 977bp)和VP2区(6 977~7 606bp)的系统进化分析显示2008/Huzhou/N11属于GI.6基因型。进一步的Simplot分析提示2008/Huzhou/N11为GI.2/GI.6重组株,重组位点位于ORF1和ORF2重叠区的上游。本文确定了我国GI型诺如病毒湖州株2008/Huzhou/N11为GI.2/GI.6重组株,可为国内诺如病毒的遗传进化研究提供序列参考。     

2019-2022年南京市急性胃肠炎暴发疫情中诺如病毒分子流行病学分析

诺如病毒是引起急性胃肠炎的主要病原体之一，本研究通过分析2019-2022年南京市诺如病毒急性胃肠炎暴发的流行特征和主要基因型变化，为疫情防控提供依据。收集2019年9月至2022年8月南京市疑似诺如病毒急性胃肠炎暴发样本，通过荧光定量PCR和一步法RT-PCR检测，对阳性样本进行序列测定并分型，挑选48株南京代表株与国内外参考株进行同源性分析。2019-2022年南京市诺如病毒急性胃肠炎暴发的高峰为冬春季，场所主要分布在小学和幼儿园，暴发以诺如病毒GII为主，共检测到11种基因型，包括4种GI和7种GII。主要流行株在三个流行季间有所变化，GII.2[P16]为2019-2021年的优势流行株，2021/2022流行季中GII.4 Sydney 2012[P16]亚型、GII.17[P17]亚型占比最大，多种亚型毒株共存。同源分析发现，2021年2株GII.6[P7]南京株分属于两类不同来源的GII.6衣壳基因型，2019-2022年的GII.2[P16]和GII.4 Sydney 2012[P16]南京株的部分聚合酶区序列变化较衣壳蛋白区大。2019-2022年间南京市诺如病毒急性...     

急性胃肠炎暴发中GI.5[P4]型诺如病毒的遗传进化分析

近年来,南京市急性胃肠炎暴发呈上升趋势,主要是由GII型诺如病毒(norovirus,NoV)引起,GI型较为少见。本研究通过对南京市输入性病例和本地性暴发急性胃肠炎疫情中GI.5[P4]型NoV进行遗传进化分析,为本地疫情控制和处置提供科学依据。对两起暴发疫情采集的18份样本进行荧光定量RT-PCR检测,并对NoV阳性样本部分聚合酶区和衣壳蛋白区进行一步法RT-PCR扩增、测序,结合参考株进行序列比对和进化树分析。18份样本中,GI型NoV阳性5份,其中4份扩增出条带,其N/S区域序列与2016-2018年已公布的GI.5[P4]同源性高达99.0%以上。其部分聚合酶区同1987年之后检出的GI.P4进化距离较近,变异不大。部分衣壳蛋白区在2003-2013年发生较为明显的进化,形成新的簇,期间在2008年又继续进化,慢慢趋于稳定。这是南京市首次在输入性病例和本地暴发疫情中均检出同源性极高的GI.5[P4],该NoV虽然在聚合酶区和衣壳蛋白区并没有发生较大进化,但是通过重组已在亚洲地区人群特别是中国多个城市导致了急性胃肠炎流行。因此,该型病毒株将是本市今后监测的重点。     

西安市4起急性胃肠炎疫情中诺如病毒的分子特征分析

诺如病毒（Norovirus,NoV）属于杯状病毒科诺如病毒属,能造成急性肠胃炎暴发,在全球流行广泛,但其在西安市的流行情况不明。为明确2018年10月西安市4起幼儿园急性肠胃炎疫情的病原及其基因特征,本研究采集了患者肛拭子,用实时定量PCR检出诺如病毒阳性核酸,对其扩增部分多聚酶区和衣壳区基因并测序。将所得序列上传分型网站以明确基因型,并用软件分析系统进化、重组位点和正选择位点。共检出GII组阳性核酸31份,测序成功25份。4起疫情均由GII.2[P16]型诺如病毒引起。疫情株扩增序列全长、部分多聚酶区和衣壳区的序列与2018年美国流行株（MK773571）的核苷酸同源性分别为99.8%、99.5%和100%。疫情株与GII.2[P16]型中国参考序列（KY421122、KY806296和MG763377）的核苷酸同源性为99.6%,氨基酸同源性为100%。重组位点约在基因组的5 075bp。疫情株基因组的1 613～1 790aa没有正选择位点。及时的流行病学、分子流行病学研究和全基因组测序对控制诺如病毒相关疫情是必要的。     

2010年深圳地区诺如病毒的基因分型

了解2010年深圳地区诺如病毒的基因型别及分子流行病学特点。 用诺如病毒特异性引物（GI-SKF/GI-SKR、COG2F/G2-SKR）,通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法进行诺如病毒核酸扩增,阳性产物回收纯化并测序,用Clustal W和MEGA4.0生物软件对诺如病毒序列进行序列比对和系统进化分析。 85份阳性标本中有79株诺如GⅡ型和6株诺如GⅠ型,其中55株为GⅡ/4(2006b)型,16株为GⅡ/4(2008variant)型,2株为GⅡ/1型,4株为GⅡ/5型,2株为GⅡ/11型,1株为GI/4型,2株为GI/5型,3株为GI/6型。 2010年深圳地区诺如病毒的主要型别是GI和GⅡ,并且以GⅡ/4型为主,流行优势株为GⅡ/4（2006b）。     

一株GⅠ.3[P13]型诺如病毒的全基因组序列分析

诺如病毒(Norovirus,NoV)是人类非菌性急性肠胃炎的主要病原,GⅠ和GⅡ基因群在人类中流行较广,但对GⅠ群少有研究。为分析西安市2018年一株GⅠ型诺如病毒CHN/Xian/18N239的全基因组基因特征,本研究对某幼儿园急性肠胃炎病例肛拭子检出的一株GⅠ型诺如病毒,使用下一代测序方法对其全基因组测序,用Blastn比对和诺如病毒在线定型工具分析CHN/Xian/18N239的基因型,用MEGA-X对其进化分析,用Bioedit对其同源性、氨基酸变异和熵值进行计算,并用SWⅠSS-MODEL和PyMOL2.3.2预测和可视化三维结构。CHN/Xian/18N239株全长7684 nt,开放阅读框(ORF)1~3分别长5316 nt(84~5399 nt)、1635 nt(5383~7017 nt)和648 nt(7017~7664nt),ORF1和ORF2的重叠区长17 nt。Blastn比对显示其与GⅠ.3[P13]型2019年中国台湾株(MN922738)核苷酸同源性最高(98.91%)。系统进化分析表明其为GⅠ.3[P13]型,与韩国2017-2018年、中国台湾2018-2019年流行株核苷酸同源性为98.7%~99.3%。与参考序列U04469比,变异位点共75个,主要在P2区,其中在人外周血抗原结合位点Ⅱ有1个,且在A-Loop、T-loop、U-loop和S-loop区的三维结构改变较大。VP2区熵值为0的位点最少,VP1区易突变位点最多。应加强对本地区诺如病毒分子型别监测,提高防控能力。     

急性胃肠炎暴发中GⅠ.5[P4]型诺如病毒的遗传进化分析

近年来,南京市急性胃肠炎暴发呈上升趋势,主要是由GⅡ型诺如病毒(norovirus,NoV)引起,GⅠ型较为少见.本研究通过对南京市输入性病例和本地性暴发急性胃肠炎疫情中GⅠ.5[P4]型NoV进行遗传进化分析,为本地疫情控制和处置提供科学依据.对两起暴发疫情采集的18份样本进行荧光定量RT-PCR检测,并对NoV阳性样本部分聚合酶区和衣壳蛋白区进行一步法RT-PCR扩增、测序,结合参考株进行序列比对和进化树分析.18份样本中,GⅠ型NoV阳性5份,其中4份扩增出条带,其N/S区域序列与2016-2018年已公布的GⅠ.5[P4]同源性高达99.0％以上.其部分聚合酶区同1987年之后检出的GⅠ.P4进化距离较近,变异不大.部分衣壳蛋白区在2003-2013年发生较为明显的进化,形成新的簇,期间在2008年又继续进化,慢慢趋于稳定.这是南京市首次在输入性病例和本地暴发疫情中均检出同源性极高的GⅠ.5[P4],该NoV虽然在聚合酶区和衣壳蛋白区并没有发生较大进化,但是通过重组已在亚洲地区人群特别是中国多个城市导致了急性胃肠炎流行.因此,该型病毒株将是本市今后监测的重点.     

宁夏地区2019-2020年诺如病毒所致感染性腹泻流行特征和病原学分析

了解宁夏地区感染性腹泻患者中诺如病毒的流行特征和基因进化规律，为该地区诺如病毒所致腹泻防控策略的制定提供科学依据。在宁夏自治区5个市的15家哨点医院开展腹泻症状监测，收集患者粪便标本和相关信息并采用Real-time RT-PCR方法进行诺如病毒初筛检测，阳性标本扩增其聚合酶（RdRp）-衣壳蛋白（Capsid）区基因，扩增产物测序后使用Sequencher 4.1.4软件进行序列拼接和编辑，并用MEGA-X、DNASTAR生物软件进行序列比对、系统进化分析以及同源性分析，应用SPSS 25.0软件进行相关统计学分析。结果显示2019-2020年共收集感染性腹泻患者粪便标本2 358份，诺如病毒检出率为13.44%(317/2 358)。主要为GⅡ基因群（285/317），其中，0～2岁年龄组阳性率最高，为18.43%(188/1 020);60～70岁年龄组阳性率最低，为3.36%(4/119)，各年龄组阳性率差异有统计学意义（P<0.05）。不同地区、年份、季节间阳性率比较，差异有统计学意义。GⅠ基因群（32/2 358）以GⅠ.P13/GⅠ.3(75.0%)为流行优势株，G...     

湖州市非细菌性急性胃肠炎暴发中诺如病毒的分子生物学特点初步研究

本文初步研究了湖州市非细菌性急性胃肠炎暴发中检出的诺如病毒的分子生物学特征。收集湖州市2008年和2009年2起非细菌性急性胃肠炎暴发疫情中采集的患者粪便标本,采用荧光定量RT-PCR方法对其进行诺如病毒核酸检测,并对核酸阳性标本进行RNA多聚酶部分区域的RT-PCR扩增。选取阳性扩增产物进行纯化及序列测定,结合诺如病毒GI、GII各基因型参考株进行核苷酸序列遗传进化分析。结果2起疫情均同时检出了GI和GII型诺如病毒。随后对其中4份RNA多聚酶区扩增阳性的标本进行测序及序列分析,结果发现2008年检出的2株GI型诺如病毒均为GI/2基因型;而2009年检出的1株GI型诺如病毒为GI/3基因型,另一株GII型诺如病毒则与近些年欧洲和亚洲相继出现的遗传组GII的新基因型GIIb的各代表株同源性最高,为GIIb基因型。这说明湖州地区流行的诺如病毒存在很高的遗传多样性,并且不同时间流行的基因型也存在一定差异。这也是国内首次在急性病毒性胃肠炎暴发中检出诺如病毒GIIb变异株。     

诺如病毒新型GII.4流行株Sydney2012在上海地区的检出和鉴定

为了解上海地区诺如病毒相关急性胃肠炎疫情的流行病学特点及流行株基因型的演化情况,2012年3月至2013年2月,收集上海市两处哨点医院成人急性胃肠炎粪便样本进行诺如病毒的分子检测并对其基因特征进行系统分析。在502份样本中,GI群共检出19例,检出率3.78%,呈现低位流行、全年散发的状态,无明显的季节分布;GII群检出86例,检出率17.13%,在10¹2月出现高位流行,并发现中老年人群GII群诺如病毒检出率显著高于青年个体（P<0.05）。同时首次于2012年9月在上海地区检出新型GII.4变异株Sydney₂012,证实是该变异株引发了2012年秋冬季诺如病毒急性胃肠炎的高位流行。序列分析表明该变异株为GII.e型开放阅读框（Open reading frame,ORF）1与GII.4型ORF2的重组体,目前已成为本地区的优势流行株。研究发现,2012年上海地区出现GII.4新型变异株Sydney₂012,并引发秋冬季诺如病毒急性胃肠炎的高位流行。     

一株与儿童腹泻相关的跨多种属的基因重配G3P[3]型轮状病毒

G3P[3]型别多见于猫/狗A组轮状病毒(Group A rotavirus,RVA)。本研究前期工作中从广西农村一名腹泻儿童粪便标本中检测到1例在人的感染中少见的G3P[3]型RVA(命名M2-102),但经初步基因分析提示其VP7和VP4基因均同猫/狗G3P[3]RVAs进化距离远。为了解M2-102的种属来源,本研究对其全基因组11条基因进行了RT-PCR扩增、测序和序列分析。使用RotaC分型工具对所获得的M2-102全基因组基因序列进行分型。结果显示RVA/Human-wt/CHN/M2-102/2014/G3P[3]具有G3-P[3]-I3-R3-C3-M3-A9-N3-T3-E3-H6基因组型。序列分析进一步显示M2-102基因组中有5条基因(VP7、VP1、VP2、NSP2和NSP3)同云南蝙蝠MYAS33株亲缘关系近,处于相同的进化树支;另有5条基因(VP4、VP3、NSP1、NSP4和NSP5)同猿猴RRV株进化距离近,位于相同的进化树支;仅有1条基因VP6同人AU-1样RVAs处在相同进化树支,并具有较高核苷酸同源性。推测M2-102是一例由人AU-1样病毒同蝙蝠株MYAS33及猿猴株RRV类似病毒经基因重配而产生的多种属来源的重配毒株。     

狂犬病病毒CVS-11株全序列测定及其感染性克隆的构建

[目的]测定狂犬病病毒标准攻击毒CVS-11株全基因组序列,构建CVS-11株全长cDNA感染性克隆.[方法]RT-PCR扩增CVS-11株全基因组得到有重叠的12个片段,分别克隆至平端载体pEASY-Blunt,测定CVS-11株全基因组核苷酸序列.用软件DNAMAN分析CVS-11全序列单一性酶切位点,设计引物,分4段扩增CVS-11全基因组,扩增产物经多步酶切、连接逐步插入至真核表达载体pcDNA3.1,获得全长质粒pcDNA3.1-CVS-11.pcDNA3.1-CVS-11与其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L、G共转染NA细胞,经免疫荧光染色、RT-PCR鉴定,拯救得到重组病毒rCVS-11.[结果]CVS-11全基因组序列由11 927个核苷酸组成,编码5个结构蛋白,结构基因排列同已知的其他狂犬病病毒一致.成功构建了CVS-11全长cDNA重组质粒pcDNA3.1-CVS-11和其辅助质粒pcDNA3.1-N、P、L和G.经共转染,成功拯救了重组病毒rCVS-11.[结论]CVS-11株感染性克隆的构建为从分子水平上进一步研究狂犬病病毒奠定了基础.     

一株MLB1型星状病毒全基因组序列分析

了解我国MLB1型星状病毒基因组特征,为星状病毒腹泻的防控提供基础数据。使用星状病毒通用引物筛查北京市丰台区2017年72份儿童腹泻监测病例标本;扩增MLB星状病毒全基因组序列,采用在线比对、进化、重组等生物学信息学方法分析MLB1的全基因组序列。从72份标本中检出2份1型星状病毒（2.78%）和1份MLB1型星状病毒（MLB1-FT）(1.39%)。MLB1-FT与GenBank已报道的MLB1型星状病毒全基因组相似性为92.51%～98.28%;MLB1-FT的三个ORF区,仅5个位点氨基酸与其他株均不相同。依据其ORF2部分序列的进化分析,MLB1可分为A和B两个组,其中A组可分为a和b亚组,MLB1-FT为A组中的b亚组。未发现MLB1-FT具有重组现象。MLB1-FT具有星状病毒特征性的保守基序,部分保守基序与其他型别星状病毒不一样,为MLB1星状病毒特有。MLB1-FT具备新型星状病毒MLB的典型特征。我国新型星状病毒监测力度较弱,应加强监测。     

一种简单高效扩增人杯状病毒ORF2区RT-PCR方法的建立及其意义

人杯状病毒(human calicivirus,HuCV)属于杯状病毒科(Caliciviridae),是单股正链RNA病毒,长约7·5 kb,其3′末端有poly(A)结构。它可分为两个属:诺如病毒(Norovirus)和札如病毒(Sapovirus)[1],根据病毒抗原性和核苷酸序列的多样性,目前将诺如病毒和札如病毒分别划分为三个遗传组(group),每一遗传组依据RNA多聚酶及衣壳蛋白区域序列的差异,可进一步划分为不同群或基因型(cluster or genotype)。病毒基因组包括3个开放读码框(open reading frame,ORF),5′端和3′端各有一个小的非编码区。ORF1编码非结构蛋白的前体聚蛋白,其中包括RNA…     

中国牛病毒性腹泻病毒JZ05-1分离株全基因测序及分析

牛病毒性腹泻病毒为瘟病毒属成员,呈世界性分布并在乳/肉牛业中造成严重经济损失。本研究利用MD-BK细胞增殖一株分离于我国吉林地区的牛源牛病毒性腹泻病毒JZ05-1毒株,观察发现其具有典型的致细胞病变效应。使用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法分别扩增覆盖基因组全长的八个片段并测序,拼接获得该病毒的全基因组序列长12285核苷酸(nt),GenBank登录号:GQ888686。该病毒基因组具有编码多聚蛋白的一个11694nt可读框,5'非翻译区(UTR)长387nt,3'非翻译区长204nt。分别分析BVDVJZ05-1的5'-UTR序列和全基因组序列,发现该病毒属于BVDV-2a亚型。BVDV-2型多数毒株之间的相似性约为96%,与JZ05-1全基因组序列相似性最高的加拿大p11Q毒株和中国XJ-04毒株的相似性为90%和91%。因此,JZ05-1全基因组序列与BVDV-2型其他毒株的全基因组序列具有较大差异。     

3株肠道病毒71型毒株的全基因组序列分析

目的：对获得的3株肠道病毒71（EV71）型毒株进行全基因组序列测定,并对其进化特点及分型进行初步分析。方法：提取病毒RNA,反转录得到eDNA,PCR分段扩增覆盖病毒全长序列的6个重叠片段（不包括多聚腺苷酸尾）;用软件将3株EV71的备片段序列进行拼接、编辑和校正,随后进行氨基酸翻译及序列比较;用MEGA4.1软件构建系统进化树。结果：获得了3株EV71的全长序列：GDV103株基因组全长7404 nt,包括741bp的5’端非编码区（UTR）、6582bp的病毒基因组编码区（ORF）及81bp的3’UTR;安徽株（Anhui2007）基因组全长7405nt,包括742bp的5＇UTR、6582bp的ORF及81bp的3＇UTR;VR1432株基因组全长7408nt,包括743bp的5’UTR、6582bp的ORF及83bp的3’UTR长。经同源性比对和进化树分析,证实GDV103和安徽株EV71属于C基因型的C4基因亚型。而VR1432株则属于C基因型的C2基因亚型。结论：获得了3株EV71的全长基因组序列,并进一步探讨了其型别,为下一步的干扰素保护宴,哈重定了基础．     

2018-2019年福州腹泻住院儿童A组轮状病毒全基因组分析

了解2018-2019年福州市五岁以下腹泻住院儿童标本中A组轮状病毒(RVA)基因组特征.通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对49份RVA阳性标本进行核酸扩增,对扩增到的40份标本进行全基因组二代测序,获得G1P[8]型RVA毒株7株,G9P[8]型RVA毒株33株.根据VP7节段分型,40株RVA毒株中有30株G9-Ⅵ亚型、3株G9-Ⅲ亚型和7株G1-Ⅰ亚型;根据VP4节段分型,40株RVA毒株均属于P[8]-3亚型.全基因组核苷酸序列分析表明,除了VP7节段外,序列差异比较大的有NSP4和NSP1两个节段.本研究获得11株G9P[8]型Waa-ike株(G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1),22株NSP4节段重配的G9P[8]-E2株(G9-P[8]-I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E2-H1),在测序的33株G9P[8]型RVA毒株中G9P[8]-E2重配株占66.7％.7株G1P[8]型RVA毒株均为Wa-like株.研究结果表明,2018-2019年福州地区流行的RVA毒株中G9P[8]-E2重配株已经成为优势株,为了更全面了解福州地区RVA毒株的遗传变异情况,后续还需加大标本量持续进行监测.     

我国登革 4型病毒 B5株基因组全序列的测定及分析(英文)

 对我国登革 4型病毒 B5株 (D4- B5)基因组进行全序列测定及分析 ,为研究病毒基因组结构与功能的关系及研制新型登革疫苗奠定基础 .根据登革 4型病毒 81 4669株的序列设计特异引物 ,通过 RT- PCR扩增出 D4- B5株不同长度的片段 ,分别克隆到 p GEM- T载体 ,将挑取的阳性克隆进行 PCR、酶切鉴定及序列测定 .结果显示 ,D4- B5株的基因组全长 1 0 665nt,5′和 3′非编码区分别为 1 0 1 nt和 40 3nt,中间一个长 1 0 1 61 nt的开放读码框架 ,编码 3387个氨基酸 .与 D4- 81 4669株比较 ,两者核苷酸序列同源性为 93.0 8% ,氨基酸序列同源性为 96.58% .D4- B5株的基因组全序列与 D4- 81 4669株类似 ,但也有较大差异 .同源进化分析表明 ,D4- B5株的基因型为 型 ,与登革 4型病毒菲律宾分离株亲缘关系较近 .这是首次报道的我国登革 4型病毒分离株基因组全序列 ,对研究病毒基因组结构与功能的关系 ,探讨我国毒株的地理来源及研制适合我国人群的新型登革疫苗具有一定的意义 .     

2株WU多瘤病毒全基因组序列测定和分析

WU多瘤病毒(WUPyV)是多瘤病毒科多瘤病毒属的新成员,近来发现与人呼吸道感染等有关。本研究对2株WUPyV进行全基因组序列测定和拼接,获得这2株病毒全基因组序列,并与已上传到GenBank的国内外几株WUPyV的全基因组序列和氨基酸序列进行比对和系统进化分析。这2株WUPyV是环状、双链DNA病毒,基因组全长5 228bp,比GenBank已知WUPyV全序列少1bp。缺失的一对碱基位于位点4 536处,属于大T抗原的非编码区。病毒全基因组编码5个蛋白,分别是3个衣壳蛋白VP2、VP3、VP1与大T抗原和小T抗原。系统进化分析显示相对中国福建福州的FZ18株,另一株FZTF株与参考株-澳大利亚的B0株关系较近。     

辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型（coxsackievirus B5,CV-B5）基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序，并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明，CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%～97%，氨基酸序列同源性为75.3%～96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A～D四个基因型，辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5，辽宁省分离株（LN2018-23-21/CHN/2018）可能为重组株。