辽宁省首株柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

研究引起辽宁地区手足口病的柯萨奇病毒B组5型（coxsackievirus B5,CV-B5）基因组特征。对2018年从辽宁省688份肠道病毒核酸阳性的标本中分离到的1株CV-B5进行高通量测序，并对其全基因组进行遗传进化分析。结果表明，CV-B5辽宁分离株与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为78.5%～97%，氨基酸序列同源性为75.3%～96.7%。基于全基因组的进化分析将CV-B5流行株分为A～D四个基因型，辽宁分离株属于D基因型。通过重组分析发现其在P3区的3D区段发生重组。首次在辽宁地区手足口病患儿中分离出CV-B5，辽宁省分离株（LN2018-23-21/CHN/2018）可能为重组株。     

二代测序技术分析2018年济南市污水中的人星状病毒基因特征

人星状病毒（Human astrovirus,HAstV）是引起急性胃肠炎的主要致病病毒之一，为了解HAstV的型别分布和遗传变异特征，本研究于2018年在济南市按月采集12份生活污水样本，浓缩处理后提取RNA，进行HAstV部分ORF2编码区的PCR扩增，阳性产物进行下一代测序（Next generation sequencing, NGS）分析，探索HAstV各型别的动态变化和系统发生学特征。结果显示所有污水中均检出HAstV核酸，NGS分析显示所测读长分属于HAstV-1至HAstV-6共6个型别，其中HAstV-1型占比最大（27.4%），但不同月份的优势型别有所差别。系统发生学分析显示HAstV-1、HAstV-2、HAstV-5型山东株序列属于多个遗传分支，提示这些型别有多个传播链在当地循环。本研究描述了2018年济南市本地流行的人星状病毒基因型分布和序列特征，研究结果证明基于扩增子NGS的环境监测是探索人群中HAstV分子流行病学特征的有效手段。     

我国2009年新分离乙脑病毒全基因组序列特征研究

本研究对我国2009年新分离的两株乙脑病毒进行全基因组序列测定和分析,以了解病毒全基因组分子特征。通过RT-PCR和核苷酸序列测定方法获得病毒全基因组序列,采用ClustalX、DNASTAR、MEGA等生物学软件完成核苷酸序列及氨基酸序列分析和系统进化分析等。研究结果显示,新分离两株乙脑病毒YN0911和YN0967株基因组全长均为10 965个核苷酸,编码3 432个氨基酸。这2株乙脑病毒之间核苷酸同源性为98.7%,氨基酸同源性为99.8%。与国际乙脑病毒流行株相比,核苷酸同源性为83.5%～98.9%,氨基酸同源性为94.8%～99.7%。与乙脑病毒疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白有13个氨基酸差异位点,但都位于抗原关键位点之外。这2株病毒在3′UTR区域存在11nt缺失。基于C/PrM区段、E基因、全基因组系统进化分析结果均显示新分离2株乙脑病毒为G I乙脑病毒,并且和越南、四川、贵州、广西以往的分离株遗传进化关系较近。本研究提示我国新分离的2株乙脑病毒均为G I乙脑病毒,决定病毒毒力的关键氨基酸位点未见明显变化。     

山东地区16株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒(AIV)山东分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术对16株从山东不同地区分离的H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所获得的HA全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,16个分离株的裂解位点均为RSSR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的分子特征;有7～9个潜在糖基化位点;受体结合位点除198位有变异,其他位点均较保守;234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α,2-6受体结合的特征;16个分离株HA基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为96.3%～99.9%和97.1%～99.6%;16个分离株同属于欧亚分支中的A/Duck/Hong Kong/Y280/97亚群。     

2019-2020年苏中地区某活禽市场H9N2禽流感病毒分子进化

【背景】20世纪90年代以来,H9N2禽流感病毒成为危害我国养禽业及人类健康和公共卫生的重要病原。【目的】了解苏中地区2019-2020年活禽市场H9N2禽流感病毒的分子进化特征。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测,原始标本用SPF鸡胚进行病毒分离,用特异性引物对病毒分离物进行全基因组测序,利用BLAST、ClustalX和MEGA6等软件进行序列比对和系统发育分析。【结果】2019-2020年间从苏中地区某农贸市场采集到231份环境和禽类标本,共检出34份甲型流感病毒,其中33份为H9N2亚型。阳性标本接种SPF鸡胚,分离到20株H9N2病毒。对其中11株病毒进行全基因组测序,系统发育分析表明11株病毒的HA和NA都属于H9N2禽流感Y280-like系的G57基因型。根据HA和NA的进化特征,11株病毒可分为5个基因组合(A、B、C、D和E),其中A (n=5)是优势流行基因组合。11株H9N2分离病毒的HA蛋白HA1和HA2亚单位的裂解位点是一个碱性氨基酸R,具有低致病性禽流感病毒的特征。HA蛋白的受体结合部位有4个氨基酸位点(I155T、H183N、A190...     

2010年云南省1株ECHO-9病毒全基因序列的遗传特性分析

为了解云南省手足口病患者标本中分离到的一株ECHO-9病毒基因组特征,对2010年云南省ECHO-9病毒分离株MSH-KM812-2010全基因组序列测序,并与GenBank中其它ECHO-9病毒株基因组序列比对和分析。MSH-KM812-2010基因组长为7 424bp,编码2 203个氨基酸,其结构基因区与其它ECHO-9病毒核苷酸和氨基酸的同源性高于其它型别肠道病毒;而在非结构区,与其它肠道病毒血清型的同源性高于ECHO-9病毒株。VP1系统进化分析显示ECHO-9病毒株可形成A、B和C三个进化分支,MSH-KM812-2010株以及其它中国分离株属于C簇。三个分支之间核苷酸序列的差异大于15.0%可将ECHO-9病毒分为三个基因型。通过重组检测软件3(RDP3)和基本局部比对搜索工具(BLAST)比对分析,发现在非结构区可能存在重组。本文首次对我国分离的ECHO-9病毒全基因组序列的测定和分析,对了解ECHO-9病毒遗传特性具有重要意义。     

西安市4起急性胃肠炎疫情中诺如病毒的分子特征分析

诺如病毒（Norovirus,NoV）属于杯状病毒科诺如病毒属,能造成急性肠胃炎暴发,在全球流行广泛,但其在西安市的流行情况不明。为明确2018年10月西安市4起幼儿园急性肠胃炎疫情的病原及其基因特征,本研究采集了患者肛拭子,用实时定量PCR检出诺如病毒阳性核酸,对其扩增部分多聚酶区和衣壳区基因并测序。将所得序列上传分型网站以明确基因型,并用软件分析系统进化、重组位点和正选择位点。共检出GII组阳性核酸31份,测序成功25份。4起疫情均由GII.2[P16]型诺如病毒引起。疫情株扩增序列全长、部分多聚酶区和衣壳区的序列与2018年美国流行株（MK773571）的核苷酸同源性分别为99.8%、99.5%和100%。疫情株与GII.2[P16]型中国参考序列（KY421122、KY806296和MG763377）的核苷酸同源性为99.6%,氨基酸同源性为100%。重组位点约在基因组的5 075bp。疫情株基因组的1 613～1 790aa没有正选择位点。及时的流行病学、分子流行病学研究和全基因组测序对控制诺如病毒相关疫情是必要的。     

引起一起暴发性急性胃肠炎疫情的埃可病毒18型VP1基因特征分析

埃可病毒18型(Echovirus 18,E18)属于B组肠道病毒(Enterovirus B,EV-B),是引起病毒性脑膜炎的重要病原体。对2019年4月广东省深圳市龙岗区一起急性胃肠炎疫情进行病原学鉴定及病原基因特征分析。此次疫情共有26名患者,均以发热、呕吐、腹泻、腹痛为主要症状。从其中18名病例采集了18份肛拭子标本,采用实时荧光RT-PCR、病毒分离(RD细胞)和半巢式聚合酶链反应法以鉴定病原,扩增病毒全长VP1区,测序并进行系统进化分析。结果显示,18份标本中11份肠道病毒核酸阳性,其中8份为E18。病毒分离得到2株病毒,从肛拭子标本直接扩增得到的7条E18全长VP1核苷酸序列,核苷酸相似性为100%,与GenBank中E18参考株的核苷酸及氨基酸同源性分别为79.2%~96.4%和93.3%~99.3%;进化树显示,深圳龙岗E18分离株(GDSZ1902)归属由中国分离株组成的C2a进化分支,在其VP1蛋白中的底部环处发现一处特异的氨基酸变异(D200N)。从流行病学和病原学结果分析,E18是引起本次深圳市龙岗区急性胃肠炎疫情的主要病原,属于中国E18主要流行株的进化分支,这是我国首次发现E18引起急性胃肠炎疫情的报道。     

2019-2022年南京市急性胃肠炎暴发疫情中诺如病毒分子流行病学分析

诺如病毒是引起急性胃肠炎的主要病原体之一，本研究通过分析2019-2022年南京市诺如病毒急性胃肠炎暴发的流行特征和主要基因型变化，为疫情防控提供依据。收集2019年9月至2022年8月南京市疑似诺如病毒急性胃肠炎暴发样本，通过荧光定量PCR和一步法RT-PCR检测，对阳性样本进行序列测定并分型，挑选48株南京代表株与国内外参考株进行同源性分析。2019-2022年南京市诺如病毒急性胃肠炎暴发的高峰为冬春季，场所主要分布在小学和幼儿园，暴发以诺如病毒GII为主，共检测到11种基因型，包括4种GI和7种GII。主要流行株在三个流行季间有所变化，GII.2[P16]为2019-2021年的优势流行株，2021/2022流行季中GII.4 Sydney 2012[P16]亚型、GII.17[P17]亚型占比最大，多种亚型毒株共存。同源分析发现，2021年2株GII.6[P7]南京株分属于两类不同来源的GII.6衣壳基因型，2019-2022年的GII.2[P16]和GII.4 Sydney 2012[P16]南京株的部分聚合酶区序列变化较衣壳蛋白区大。2019-2022年间南京市诺如病毒急性...     

长白县黑线姬鼠携带汉坦病毒的S基因特征研究

为了解长白县黑线姬鼠中汉坦病毒流行情况及病毒型别,采用巢式RT-PCR方法筛查鼠肺RNA,并对PCR阳性样本进行全S基因的扩增、克隆及测序;构建系统发生树并进行分子进化分析。结果显示:共捕获黑线姬鼠58只,共检测出4份阳性标本,阳性率6.90%。经过序列测定及进化分析显示黑线姬鼠所携带的病毒与汉滩病毒第6基因亚型标准株核苷酸的同源性为95.8%～96.3%,氨基酸同源性为98.6%～99.5%。同时发现,长白县黑线姬鼠携带的汉滩病毒的NP蛋白共有1个特异性氨基酸位点为S387。     

江苏省南京市和无锡市两地首次检出人星状病毒HAstV-1a基因亚型

了解江苏省南京市和无锡市两地夏秋季急性胃肠炎人星状病毒(HastV)的基因亚型。收集2015~2016年6~11月江苏省南京市和无锡市两地夏秋季急性胃肠炎患者粪便标本,采用real-time RT-PCR法检测粪便中HAstV的病毒核酸,对阳性标本ORF2区进行RT-PCR扩增及测序,与GenBank公开的序列进行比对,分析基因亚型情况。江苏省南京市和无锡市两地夏秋季急性胃肠炎HAstV感染的比例为15.26%,其中50%为合并其它急性胃肠炎病毒感染,HAstV感染以秋季流行为主,包含HAstV-1a(group 2)亚型和HAstV-4c基因亚型,并且这2个亚型在两地均有分布。HastV在婴幼儿人群中感染率较高;HAstV-1a亚型为在江苏省南京市和无锡市两地首次发现及报道的亚型,可能为欧美输入性毒株,本研究为进一步了解国内HAstV分子流行特征提供依据。     

天津市致病毒性脑炎柯萨奇病毒B组5型全基因组序列分析

肠道病毒是我国病毒性脑炎(Viral encephalitis,VE)的主要病原体。本文研究对4株引起VE的天津柯萨奇病毒B组5型(Coxsackievirus B5,CV-B5)分离株进行Illumina MiniSeq高通量测序,并对其全基因组特征、进化及重组特点进行分析。结果提示,4株CV-B5天津分离株的全基因组核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84.5%~100.0%和98.1%~100.0%,与国内流行株的全基因组核苷酸序列同源性为83.2%~96.5%,氨基酸序列同源性为96.4%~99.4%。基于全基因组的系统进化分析将CV-B5流行株分为A-D四个基因型,其中天津与国内流行株均属于C基因型。C基因型进一步分为3个进化分支,而天津分离株处在两个不同的分支上。基于基因组各区段序列的系统进化与SimPlot重组分析结果显示,天津分离株15-39N、15-41N与埃可病毒30型(Echovirus 30,E-30)原型株在P3区3B、3C、3D区域均检测到重组信号。本研究有助于了解CV-B5的全基因组特点和重组规律,为相关疾病的防控提供依据。     

广东省10株乙型脑炎病毒的分子特征研究

了解广东省目前流行的乙型脑炎病毒的基因型别,以及新分离毒株与P3和SA14-14-2疫苗株E蛋白的氨基酸差异,推测疫苗株的可能保护效果。本研究对广东省2017年从蚊虫和蠓虫标本分离的10株乙型脑炎病毒基因组序列测定,利用MEGA软件登录GenBank下载乙型脑炎病毒代表株序列并绘制进化树,同时用ClustalW2软件与疫苗株进行氨基酸同源性比对和E蛋白的序列分析。10株乙型脑炎病毒均属基因I型GI-b组,但分别位于2个不同的、小的进化分枝中。10株新分离病毒与P3和SA14-14-2疫苗株的E蛋白氨基酸同源性分别位于97.40%~97.60%和97.20%~97.40%之间。E基因区段500个氨基酸中,P3株与新分离乙型脑炎病毒株之间共存在17个氨基酸位点的差异(包括12个共同氨基酸的改变),略高于SA14-14-2疫苗株的16个氨基酸位点变异(包括11个共同氨基酸的改变)。其中在DI区的P3和SA14-14-2株分别有1个和3个共同氨基酸变异,DⅡ区各有5个共同氨基酸改变,DⅢ区分别有5个和2个共同氨基酸改变,结构域之外各有1个共同氨基酸的变异。绝大多数变异发生在非关键位点,只在E306和E388处观察到的氨基酸位点变异与疫苗P3株关键位点的改变有关,这两个位点(G306E,E388G)均发生在DⅢ区,而疫苗SA14-14-2未观察到关键位点的改变。总之,广东省流行的乙型脑炎病毒基因型别可能已由Ⅲ型变为I型;疫苗SA14-14-2株及P3株与新分离毒株均具有很高的同源性,绝大多数关键氨基酸位点未发生变异,对新分离病毒均具有良好的免疫保护价值。     

山东省甲型H1N1流感病毒病原学及基因特性研究

在2009~2010年监测年度开展甲型H1N1流感病毒学监测并进行病原学分离鉴定,以及对血凝素基因(HA)和神经氨酸酶基因(NA)特性分析,研究其基因变异情况。采集了17 126份发热患者的鼻、咽拭子标本,采用逆转录实时荧光定量RT-PCR(Real-Time RT-PCR)进行核酸检测,其中甲型H1N1流感病毒核酸检测阳性4004份,总阳性率为23.38%。对阳性标本开展病毒分离,并对分离的甲型H1N1流感病毒的HA、NA基因序列进行测序。利用DNAStar软件对序列进行同源性分析发现与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株HA、NA基因同源性分别为96.9%~99.3%和99.1%~99.6%;利用Mega 4.0软件进行基因进化分析和氨基酸进化分析发现,与WHO推荐的疫苗株相比,山东省甲型H1N1流感流行株有21个血凝素基因的氨基酸发生替换,其中11个氨基酸位点位于抗原决定簇区,一个糖基化位点发生改变;有16个神经氨酸酶基因的氨基酸发生了替换,一个糖基化位点发生改变;未发生神经氨酸酶蛋白275位H→Y的替换。结果显示山东省甲型H1N1流感暴发流行株HA基因和NA基因均具有高度同源性,HA蛋白和NA蛋白均存在不同程度的氨基酸替换,部分流行株抗原决定簇和糖基化位点发生改变,所有病毒均对达菲类药物敏感。     

鸡源H9N2亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因序列分析

对1996～2001年间自中国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因(NA),进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性.结果表明,NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.1%～99.8%和95.7%～99.7%,说明NA基因稳定遗传,高度保守.与A/chicken/HongKong/G9/97相比较,发现中国大陆鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶蛋白在其茎部的第63、64、65位点上都有3个氨基酸的丢失,而与中国邻近的韩国、巴基斯坦鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶没有氨基酸的丢失,因此这些部位的氨基酸丢失可初步认为是中国大陆H9N2流感病毒分离株的一个标记.系统进化树分析表明,该8株病毒的NA基因属于相同的进化分支,即A/duck/HongKong/Y280/97-like分支,尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like分支的分离株.中国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化亚分支,说明H9N2亚型禽流感的发生与流行和地域有一定的相关性.     

一株重组鸭源H5N2亚型禽流感病毒分子进化分析

2016年对武汉地区家禽市场进行常规流感监测,分离鉴定到1株H5N2亚型禽流感病毒。本研究对该株病毒进行了全基因组测序,分子特征和遗传进化分析。结果显示该株病毒的HA基因属于Clade2.3.4.4分支,HA蛋白的裂解位点处具有多个连续碱性氨基酸,具备高致病性禽流感病毒的典型分子特征。序列比对分析显示该株病毒的各基因节段分别与H5不同亚型的禽流感病毒具有较高的相似性,推测该分离株为重组病毒。继续开展对家禽市场H5亚类流感病毒的分子流行病学调查,对研究高致病性流感病毒的变异和进化,以及对禽流感的综合防控有着重要的意义。     

2017–2019年我国南方地区高致病性H5N6亚型禽流感病毒血凝素蛋白分子特征分析

【背景】自2014年以来,H5N6禽流感病毒在我国家禽和活禽市场持续进化,成为人类和动物健康的重大威胁。【目的】对2017–2019年中国南方地区93株高致病性H5N6禽流感病毒的HA基因进行分子进化分析。【方法】接种9–11日龄鸡胚分离核酸检测阳性的H5N6标本,运用下一代测序平台对病毒分离物进行全基因组测序,从NCBI和GISAID数据库下载参考序列,利用BLAST、MEGA6.1及Clustal X等软件进行序列分析。【结果】2017–2019年,从189份江苏省H5亚型禽类/环境标本和1名H5N6患者咽拭子标本中共分离到43株病毒,完成了33株H5N6病毒的全基因组测序。下载网上同时期中国其他地区流行的H5N6毒株序列,对总计93株H5N6病毒的HA基因进行分子进化分析。93株H5N6病毒中有78株属于Clade 2.3.4.4h,9株病毒属于Clade 2.3.4.4e,4株H5N6病毒属于Clade 2.3.4.4b,1株属于Clade 2.3.4.4f,1株属于Clade 2.3.4.4g。所有93株病毒HA蛋白的裂解位点含有多个碱性氨基酸,表明它们都属于高致病性禽流感病...     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点分子特征分析

为了进一步研究猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点的分子特征,选取GenBank中22株TGEV分离株,采用生物信息学方法对抗原位点氨基酸序列进行同源性比对分析。结果表明,不同分离株的A和C位点高度保守,B和D位点则有一些变化。     

中国1995～2004年鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

应用RT-PCR方法扩增到了我国1995～2004年20株IBV现地分离株的膜蛋白(Membrane,M)基因片段.序列测定表明,20株IBV分离株M基因开放阅读框由672～681bp组成,编码由223～226个氨基酸残基组成的多肽.与我国分离株LX4相比,M基因推导氨基酸序列的变异主要发生在2～17位、221～223位,其中4～6位存在氨基酸的插入和缺失,导致IBV毒株间M蛋白糖基化位点的差异.与GenBank中34株IBV参考毒株M蛋白基因推导氨基酸序列进行比较和分析,系统进化关系显示54株IBV毒株分属于5个进化群.我国IBV分离株M基因在进化关系上较为独立,主要分布在第Ⅱ群和第Ⅳ群,其中第Ⅱ群分离株和中国台湾毒株进化关系密切.此外,参考IBV国内分离株S1基因及N基因系统发育进化树的研究结果,并与M基因进行比较,表明我国IBV也存在着基因重组现象,尤其是疫苗毒和流行毒之间的重组.     

一株引起严重急性呼吸道感染病例的A亚型人呼吸道合胞病毒全基因组基因特征分析

人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)是导致儿童急性呼吸道感染的最重要的呼吸道病毒之一。根据对单克隆抗体的反应,HRSV分为A、B两个亚型。为探讨严重急性呼吸道感染(Severe acute respi-ratory infection,SARI)病例中HRSV全基因组基因特征,本研究对2017年河南省漯河市住院SARI病例中检测到的1株HRSV A亚型病毒通过Sanger测序方法对其全基因组序列进行了测定和分析。通过Sequencher 5.4.5、MEGA 5.05、BioEdit 7.0.5等生物信息学软件进行序列拼接和比对,进行了基因亲缘性关系分析、氨基酸变异和糖基化位点分析。基于HRSV全基因组序列和11个单个蛋白基因序列构建的亲缘性关系分析结果提示本研究中检测到的这株HRSVA病毒(RSVAs/Luohe.Henan/CHN/42.17)属于ON1基因型,该型是我国近年流行的优势基因型。该病毒全基因组序列与35条全球代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.69%～99.82%和93.63%～99.67%;G蛋白编码区氨基酸变异最高,而F蛋白相对保守。糖基化位点分析发现,该病毒的F蛋白有6个N-糖基化位点,未发现O-糖基化位点,此结果与原型株long株相同;G蛋白N-糖基化位点有6个,O-糖基化位点为82个,而原型株long株有11个N-糖基化位点,15个O-糖基化位点。本研究对2017年河南省漯河市SARI病例中一株HRSVA病毒全基因组序列进行了测定,与世界其他地区报道的HRSVA亚型病毒全基因组序列进行了对比分析,揭示了SARI病例中我国HRSV优势流行ON1基因型病毒全基因组的核苷酸和氨基酸变异特征,以及G蛋白和F蛋白编码区糖基化情况,丰富了我国HRSV基因数据库,也为HRSV的核酸检测方法的建立、疫苗研发和预防性单克隆抗体的评价提供了核苷酸和氨基酸的基础数据。