GeXP多重PCR技术同时检测12种常见呼吸道病毒

本研究建立了一种基于GeXP多重基因表达遗传分析系统的多重RT-PCR检测方法,该方法可以同时检测12种呼吸道病毒,包括流感病毒A型和B型、季节性H1N1、副流感病毒1～3型、人鼻病毒、人偏肺病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒A型和B型、人博卡病毒。针对病原体保守区序列设计12种病毒的特异性引物,分别用已验证的阳性标本为模板检验多重体系的特异性。多重检测体系在10~3拷贝/μL水平可同时检测到12种病毒。另检测24份临床标本,以real-time RT-PCR为参考标准,进一步验证检测体系。结果表明,这种基于GeXP系统的新方法灵敏度高、特异性强,可以快速同时检测12种常见呼吸道病毒。     

3种菊花病毒/类病毒实时荧光定量RT-PCR检测体系的构建与准确性评价

菊花容易受到病毒感染而造成品质下降,目前国内对菊花病毒的检测主要根据外观表现或者定性PCR检测,无法准确判定病毒载量。为构建一种可同时用于检测菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)和菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chloritic mottle viroid,CChMVd)的实时荧光定量RT-PCR检测方法,本研究分别以保守区域作为靶标设计相应的引物探针,通过优化扩增体系中CVB、TAV、CChMVd 3种病毒/类病毒探针浓度、引物浓度、Mg²⁺浓度、dNTPs浓度,摸索扩增程序中反转录时间、退火温度和扩增循环数,构建了一种可同时用于CVB、TAV、CChMVd的3重实时荧光定量RT-PCR检测体系,优化后的扩扩增体系中CVB、TAV和CChMVd的探针浓度分别为100 nmol/L、120 nmol/L和80 nmol/L,引物浓度分别为200 nmol/L、240 nmol/L和160 nmol/L,Mg²⁺浓度为3.0 mmol/L;dNTPs浓度200μmol/L;最适反转录时间为25 min,退火温度为60℃,循环数为40。敏感性实验结果表明,该反应体系对3种病毒/类病毒的敏感性为1.0×¹⁰3拷贝/mL,敏感性好;定量线性范围为1.0×¹⁰3拷贝/mL~1.0×¹⁰10拷贝/mL,线性范围宽;特异性好,对菊花矮化类病毒、烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒核酸检测结果为阴性;对1.0×¹⁰4拷贝/mL的低浓度参考品平行检测10次,定量结果lg值偏差(CV%)为4.81%,重复性好。在南京农业大学"中国菊花种质资源保存中心"基地随机选择菊花20株进行本研究试剂检测,检出6例CVB病毒株和4例TAV病毒株,其病毒载量为2.5×¹⁰4拷贝/mL~5.5×¹⁰7拷贝/mL,随机选择1株CVB病毒株定量PCR,产物进行TA克隆后经测序与NCBI Blast比对,其与MH678704.1的同源性为100%。因此,本研究建立了一种能同时检测CVB、TAV、CChMVd 3种菊花常见病毒/类病毒的灵敏、快速、可定量的检测方法。     

H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10⁰拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。     

TaqMan—MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析.结果表明引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应.方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好.本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测.     

基于CRISPR/Cas13a系统建立大口黑鲈弹状病毒检测方法

为了建立一种灵敏度高、特异性强并且适合现场诊断的大口黑鲈弹状病毒(Micropterus salmoides rhabdovirus, MSRV)检测方法,研究基于CRISPR-Cas13a系统并结合多酶恒温核酸快速扩增(MIRA)技术建立了一种MSRV的检测方法。实验对MSRV序列进行多重序列比对分析后,针对MSRV衣壳蛋白(CP)基因的特异性区域设计两个靶点,并通过体外转录成特异性的crRNA,同时设计合成MIRA引物序列实现目标序列的等温扩增,最后结合Cas13a蛋白、crRNA、恒温扩增体系构建检测体系,并从高效crRNA的选择、反应温度、ssRNA报告探针浓度和Cas13a与crRNA的浓度比四个方面优化了反应体系,并采用最优检测体系对大口黑鲈样本进行检测验证。结果显示,在20μL检测体系中加入200 nmol/L Cas13a、100 nmol/L crRNA1、100 nmol/L crRNA2及500 nmol/L ssRNA报告探针,在37℃的情况下能够获得最佳的检测效果。并且该检测体系可以检测到10² fM的MSRV病毒,具有良好的特异性和灵敏...     

一种基于新型再测序芯片的不明原因呼吸道感染样品检测方法的建立

再测序芯片(Resequencing Pathogen Microarray,RPM)是一种新的基于微阵列DNA芯片的病原体检测与鉴定技术。为了将RPM应用于不明原因呼吸道感染的检测,提高应对传染病暴发的能力,本研究建立了基于一种新型RPM的呼吸道多病原检测方法。该方法可以同时检测19种常见呼吸道病毒、9种甲型流感(Flu A)和11种鼻病毒(HRV)、28种肠病毒、18种少见呼吸道病毒。选取已验证的16种常见呼吸道病毒感染阳性的样本评价RPM的特异性,用克隆质粒或体外转录的RNA梯度稀释液来检验RPM的灵敏度,在10～103拷贝/反应水平时RPM仍能检测和分辨出相近的病毒亚型。将8份不明原因的咽拭子样品提取的核酸合并,用新建立的方法进行检测,根据RPM结果再以普通PCR加测序作为验证,同时和Abbott公司的质谱测序(PLEX-ID)结果进行比较,除RPM检出假阳性PIV1外,三者的其余检测结果一致。结果表明,这种基于新型RPM的方法具有高灵敏度、高通量的优点,对应对新发和突发传染病具有重要意义。     

琉球病毒、索尔韦齐病毒、苏里斯病毒等三种沙粒病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究

建立可检测琉球病毒(Ryukyu virus,RYKV),索尔韦齐病毒(Solwezi virus,SOLV)以及苏里斯病毒(Souris virus,SOUV)等三种沙粒病毒的实时荧光定量RT-PCR检测方法.分析三种病毒流行病学分布特征,从国际公共数据库搜索下载基因组序列,进行比对分析,确定检测靶标,借助primer premier 6.0生物信息学软件,设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,利用化学合成和体外转录方法制备模拟样本,比较评价三种方法的检测限、特异性、重复性特征.所建实时荧光定量RT-PCR检测方法均可有效扩增检测病毒RNA靶标,检测限分别为40拷贝/μL、7拷贝/μL和15拷贝/μL,检测汉城病毒、汉滩病毒、登革病毒Ⅰ～Ⅳ型分离株、发热伴血小板减少综合病毒及30份健康人血清样本无非特异性扩增,三种病毒相互间以及其他8种出血热相关沙粒病毒RNA间无交叉反应,重复性比较分析显示变异系数均在2％以内.本研究建立的检测RYKV、SOLV和SOUV三种沙粒病毒的实时荧光RT-PCR方法具备用于相关疑似感染者临床样本、宿主动物标本以及进出口物品的筛查检测的潜力,但因未经基于实际病毒感染样本的比较评价,检测结果的解释仍具有一定的局限性.     

十二种血清型蓝舌病病毒型特异性实时荧光定量RT-PCR定型方法的建立

为建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)十二种血清型(血清6、8、10、11、13、14、17、18、19、20、22与23型)特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法,根据GenBank公布的十二种BTV血清型毒株的基因节段2序列,选择高度保守区域,设计每种BTV血清型的扩增引物与TaqMan探针;以十二种血清型BTV参考毒株的cDNA为模板,进行引物的筛选,建立BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法;对检测方法的灵敏度、特异性与重复性进行验证,分别以含有50、100与200个BTV噬斑形成单位(Plaque forming unit,PFU)的模拟BTV阳性血液样本为检测对象,进行检测效果的评估.实验结果表明,建立的BTV血清型特异性qRT-PCR检测方法具有良好的灵敏度和特异性,对不同血清型BTV核酸拷贝数的检出下限在12拷贝/μL(BTV-8)至57拷贝/μL(BTV-14)之间;对我国反刍动物上广泛流行的流行性出血病病毒、中山病病毒与阿卡斑病毒核酸的检测结果均为阴性.反应具有良好的重复性,组内Ct值的变异系数在0.92％至1.96％之间,组间Ct值的变异系数在0.26％至1.62％之间.对模拟BTV阳性血液样本的检测结果显示,BTV血清型特异性qRT-PCR可有效检测含50个PFU(噬斑形成单位)的BTV血液样本.本研究建立的十二种BTV血清型特异性qRT-PCR定型方法具有特异性强、灵敏度高和耗时少等优点,可用于动物感染BTV血清型的诊断.     

双链探针实时荧光PCR核酸检测新技术研究*

目的:采用一种“双链探针”实时荧光PCR技术,提高HBV核酸检测灵敏度,并在同一反应管中实现代谢酶CYP2C19^*2基因型检测。方法:采用双链探针与TaqMan探针同时检测不同浓度HBV血清样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和结果统计分析;采用双链探针检测代谢酶CYP2C19^*2不同基因型样本,使用上海宏石SLAN 96实时荧光PCR仪进行核酸Ct值检测和基因型确定。结果:不同浓度HBV血清样本检测,双链探针荧光本底低,检测灵敏度更高,与TaqMan探针检测结果相比,两者核酸检测Ct值存在显著性差异(P<0.05);双链探针检测36份样本的代谢酶CYP2C19^*2基因型,检测结果与Sanger测序结果完全一致。结论:双链探针实时荧光PCR检测技术可完成目的基因的高灵敏核酸检测,也可实现基因型分析。     

人多瘤病毒7 TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立

目的:建立人多瘤病毒7(HPy V7)核酸快速、特异的Taq Man探针实时定量PCR检测方法。方法:分别设计HPy V7特异性的引物与Taq Man探针,建立实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性和重复性进行评价;用建立的方法检测200份健康成人志愿者的血清和300份急性呼吸道感染住院儿童的鼻咽抽吸物样本。结果:所建立的实时定量PCR方法对HPy V7的检测灵敏度可达10拷贝/μL,检测线性范围为101~1010拷贝/μL,且实验特异性和重复性好(CV1.0%);采用该方法,从200份血清样本中检出9份阳性标本。结论:建立了HPy V7 Taq Man探针实时定量PCR检测方法,为HPy V7的流行病学调查及其初步研究提供了技术手段。     

非洲猪瘟病毒B646L和F778R双基因PCR检测方法的构建

为建立一种能够快速检测非洲猪瘟病毒(ASFV)的普通PCR方法,本研究分别以ASFV B646L和F778R基因为靶序列设计了两对特异性引物,建立ASFV B646L和F778R双基因普通PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行检测。结果显示：该PCR体系(25.0μL体系)的最优组合为Pfu酶0.2μL、10×Reaction Buffer 2.5μL、2.5 mmol/L d NTP Mixture 2.5μL、B646L上下游引物各1.5μL、F778R上下游引物各0.5μL、DNA模板1.0μL;退火温度为57℃、退火时间为30 s、72℃延伸2.5 min,30个循环。该方法仅针对ASFV B646L和F778R基因进行特异性扩增,无交叉反应。同时对B646L和F778R阳性质粒的最低检测下限分别为7.2×10⁷ copies/μL、1.5×10⁶ copies/μL,试验重复性良好。本研究对于提高ASFV临床诊断的准确性、特异性和高效性具有重要价值,为其快速检测提供了可靠的技术支撑。     

尼帕病毒Taqman qRT-PCR检测方法的建立

尼帕病毒(NiV)是一种高致病性人畜共患病原体,可引起人类致死性脑炎和严重的呼吸系统疾病,目前尚无有效的抗NiV药物和疫苗,建立NiV检测方法十分必要。建立针对尼帕病毒N基因的Taqman qRT-PCR检测方法,应用于样本尼帕病毒检测及定量。针对尼帕病毒N基因保守区域设计引物和探针,建立Taqman qRT-PCR检测方法,评价该检测方法灵敏度、特异性和可重复性,并应用此方法进行样本检测。本研究建立的Taqman qRT-PCR检测方法可以特异性的检测尼帕病毒,检测灵敏度为10~2拷贝/μL,标准曲线线性范围为1.0×10~9～1.0×10~2拷贝/μL,可重复性较好,能够有效检出尼帕病毒马来西亚病毒株和孟加拉病毒株,可用于样本尼帕病毒的检测及定量。     

基于基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的猪呼吸道病毒多目标鉴定方法的建立和应用北大核心

【目的】建立能高效同步鉴定猪伪狂犬病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV-2)和3型(porcine circovirus 3,PCV-3)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)以及猪博卡病毒1型(porcine bocavirus group 1,PBoV-G1)、2型(porcine bocavirus group 2,PBoV-G2)和3型(porcine bocavirus group 3,PBoV-G3)等呼吸道病毒的核酸基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)高通量多目标检测技术。【方法】根据7种病原体基因的保守序列,分别设计不同病原的引物及对应的单碱基延伸探针,通过引物浓度和反应条件优化,方法特异性、敏感性和稳定性分析,以及临床样本和猪源产制品的检测验证,建立常见猪呼吸道DNA病毒的MALDI-TOF MS多目标检测体系。【结果】质谱分析显示,多目标检测体系的7种靶标产物峰只在特定病毒阳性样品检测时产生,与其他病原体检测无交叉反应,表明该方法对7种靶标病毒检测特异性良好。重复性试验结果分析显示,体系中每种病毒在高、中、低浓度时批内阳性符合率均≥98.0%,批间均≥98.3%,表明该方法具有较高的稳定性。体系中7种病原体每种病毒最低检测限在8.65–26.27拷贝/μL之间,与荧光PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)检测方法相当。采用MALDI-TOF MS多重检测方法对100份组织、饲料和猪肉样品进行检测应用,检出2种及以上混合感染样品39份,其中5份样本同步检出5种病原体阳性;对8份ASFV-p72假病毒人工污染样品进行验证,均可检出ASFV阳性。将以上样本检测应用结果与荧光PCR方法进行比对验证,2种方法对于不同病原体检测结果的符合率高达94.4%–100%。【结论】本研究建立的基于MALDI-TOF MS的猪呼吸道常见DNA病毒多重检测方法为猪群相关疫病快速监测和鉴别诊断,以及便利化进出口动物检疫等提供了一种新的敏感、特异的高通量多目标检测技术。     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

9种呼吸道病毒微流体芯片检测体系构建与应用

近年来,越来越多新的致病性呼吸道病毒被发现,给口岸检验检疫机构的预防和控制造了成极大困扰,建立甲型流感病毒(Influenza A virus,FluA)、乙型流感病毒(Influenza B virus,FluB)、副流感病毒(Human Parainfluenza virus,HPIV)、冠状病毒(Coronavirus,Cov)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)、人偏肺病毒(Humanmetapneumovirus,HMPV)、人博卡病毒(Human bocavirus,Hbov)、腺病毒(Adenovirus,Adv)和鼻病毒(Rhinovirus,Rhv)9种呼吸道病原体微流体芯片检测体系。选择人β-actin基因作为靶基因设计内标引物探针,根据9种呼吸道病原体基因组的保守区设计相应的引物探针;在Ultra Fast Labchip Real-time PCR V280平台上,筛选合适的RT-PCR Master Mix;对扩增体系中引物探针浓度进行优化,用优化后的扩增体系进行灵敏度和特异性验证;用100例临床标本进行回顾性检测。选出具有快速扩增性能的RT-PCR Master Mix,优化后病原体上游引物、下游引物和探针终浓度分别为500nmol/L、500nmol/L和250nmol/L,内标基因上游引物、下游引物和探针终浓度均为300nmol/L、300nmol/L和150nmol/L;在此扩增体系下,9种呼吸道病毒的最低检测限均为1.0×10~3拷贝/mL,不同病毒无交叉反应,对100例临床样本检测,准确率100%。因此,本研究建立了一种可同时用于9种呼吸道病毒快速检测的微流体芯片扩增体系,采用本检测体系可在25min内实现上述9种病毒核酸定性检测。     

同时鉴别6种鸡病毒性呼吸道病GeXP检测方法的建立

为了建立一种能够同时鉴别H5、H7、H9亚型禽流感、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎6种鸡病毒性呼吸道传染病病原体的GeXP检测方法,本研究根据这些病原体各自的基因保守序列,设计合成了7对特异性引物,优化反应条件,用单一病毒、混合病毒样品来验证所建立的GeXP方法的特异性和准确性,以不同拷贝数的克隆质粒来检测GeXP方法的灵敏度。检测34份临床阳性样品,进一步验证该法的可靠性。结果显示,在7对引物同时存在的GeXP反应体系中,可特异性地扩增出相关6种病毒目的片段,并可在102拷贝/μL水平同时特异地检测出鸡6种病毒性呼吸道传染病,GeXP方法检测34份临床阳性样品结果与病毒分离一致。本研究建立的GeXP方法不仅可高通量检测6种病原体,而且具有特异性强和灵敏度高的特点,适用于临床样品混合感染的快速鉴别诊断,对这6种发病特征及临床症状相似的鸡病毒性呼吸道病的有效防控有很高的实际应用价值。     

GeXP多重基因表达遗传分析系统在手足口病病原分型检测中的应用

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统,建立一种多重逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,同时检测引起手足口病的9种常见的人肠道病毒—人肠道病毒71型(HEV71)、柯萨奇病毒A组(CVA)16、4、5、9、10型和柯萨奇病毒B组(CVB)1、3、5型。优化多重反应体系中针对5’UTR区的肠道病毒通用引物和11对针对9种血清型人肠道病毒VP1区的特异性引物的浓度比例,分别以病毒细胞培养物和阳性粪便标本来验证多重反应体系的特异性,以TCID50定量的细胞培养物和克隆质粒体外转录的RNA梯度稀释液来检测多重检测体系的灵敏度。结果表明,优化后的多重检测体系,可扩增出人肠道病毒共有的保守片段的和型特异性片段,HEV71和CVA16细胞培养物的检测下限为100.5TCID50/μL,并可在103copies/μL水平同时、特异地检测出9种病毒RNA。该方法灵敏度高、特异性强,可快速对大量临床样本进行高通量检测,用于手足口病的分子流行病学调查。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.