组织保护剂对病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA的保存效果探究

病毒核酸和生物组织样本RNA容易受到外部环境的影响,极易发生降解,造成实验结果产生严重偏差。以病毒核酸与豚鼠皮肤组织样本RNA为研究对象,探究组织保护剂保存它们在不同温度放置不同时间后,对病毒载量以及豚鼠皮肤组织样本中RNA的保护效果。结果发现,在4℃保存30 d,25℃保存7 d或37℃保存24 h后,与初始病毒核酸量相比较,组织保护剂中保存的病毒载量未发生明显变化（P>0.05）。在4℃保存30 d,25℃保存7 d或37℃保存24 h后,与液氮储存组相比较,组织保护剂组与市售RNA later组均可以保持豚鼠皮肤组织中样本RNA的提取量和纯度,差异无统计学意义（P>0.05）。结果表明,组织保护剂可作为科研或临床组织样本的储存保存液,在4℃、25℃以及37℃条件下放置一定时间,不影响病毒核酸的病毒载量以及豚鼠皮肤组织样本RNA的提取量和纯度,使样本保存更简便高效。     

基于磁珠吸附的污水病毒高通量富集方法研究

基于环境污水的传染病病原监测是基于病例的传染病监测体系的重要补充。当前常规的污水病毒富集方法存在人力耗费大、周期长、精密度低等缺陷，导致污水病原监测难以大规模开展。本研究系统地探究了磁珠吸附法（磁珠法）对污水中的传染病相关病毒（包括新冠状病毒（SARS-CoV-2）、诺如病毒（Norovirus, NoV））富集的回收率和精密度，探讨了不同样本存储条件对磁珠法富集病毒效果的影响，采取磁珠法和现行标准的聚乙二醇（PEG）沉淀法富集含不同SARS-CoV-2拷贝数加标污水中的病毒，并检测SARS-CoV-2的核酸浓度，通过计算病毒载量来比较两种方法的检出限、病毒回收率和重复富集的精密度；利用2023年5月-6月广东省五个地市采集的28份污水样本，比较两种方法对新鲜水样本中SARS-CoV-2、NoV的富集效果，并探索了污水经冻融以及4度保存24 h后，磁珠法富集SARS-CoV-2和NoV效果的差异。结果表明在加标水重复试验中，磁珠法的检出限在100拷贝/mL，而经PEG沉淀法富集的100拷贝/mL加标水中仅有一份检出阳性，磁珠法病毒回收率在1000拷贝/mL加标水中的变异系数是0.14，...     

样本处理后静置时间对HBV—DNA荧光定量PCR的影响

目的：探讨乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA）荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）在样本处理后立即加样扩增和4℃冰箱静置24h后再加样扩增对检测结果的影响。方法：68例不同模式乙肝患者样本分别用2种方法处理后进行HBV-DNAFQ-PCR检测。结果：68例样本采用第1种方法共检出HBV-DNA阳性35例,第2种方法共检出39例;第2种方法HBV-DNA阳性定量结果普遍高于第1种方法,指数平均高1个次方左右（u=5.14,P〈0.05）;以第2种方法检测结果为依据,则第1种方法有4例阳性结果漏检,检测结果假阴性率达10.3％（4／39）。结论：样本处理后,应置4℃冰箱静置一定时间,以保证病毒颗粒充分裂解后再进行HBV-DNAFQ-PCR,以提高HBV-DNA的检出率。     

苯甲基磺酰氟（PMSF）在犬精子4℃保存中的作用

目的探讨4℃保存的条件下,苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）对犬精子的保护作用。方法犬精子以含不同浓度PMSF的Tris-卵黄液（Tris-egg yolk,EYT）处理后,于4℃低温保存,在24、48、72、96 h分别以伊红、瑞-吉和吖啶橙染色检测精子活率、顶体膜和DNA完整性。结果低温保存24 h后,吖啶橙染色检测DNA断裂率（%）：对照组（5.93±0.32）,实验组：20μg/mL（4.50±0.38）、40μg/mL（4.20±0.25）、80μg/mL（4.21±0.46）、160μg/mL（3.87±0.67）,P〈0.05;各浓度组之间没有明显差异;72 h后,犬精子活率仍〉30%;96 h内,对照组和实验组犬精子在活率、顶体膜完整性上未见明显差异。结论PMSF于4℃低温保存条件下对犬精子具有保护作用,24 h内能有效保护精子DNA双链的完整性,4℃低温保存72 h后,犬精子仍符合人工授精要求。     

Kyoto-1保存液保存的移植用肺Ⅱ型肺泡上皮细胞钠-钾泵的研究

目的：临床认为肺水肿已成肺移植过程中的最大障碍。近年来资料表明,过是肺泡液的吸收与Ⅱ型肺泡上皮细胞Na^ 的跨膜能力有关,保存中若能保持肺上Na^ -K^ -ATPase的活性,对成功的肺移植是非常必要的,本实验研究0℃、4℃Kyoto-1（NewET－K）保存液保存体肺脏,型Ⅱ肺泡上皮细胞Na^ -K^ -ATPase的活性变化,为Kyoto-1在临床上最大时限地保存供体肺提供基础理论依据。方法：取Wistar大白鼠,随机分为对照组和实验组,对照组取新鲜肺脏。实验组分别灌注0℃、4℃的Kyoto-1保存液,分别放入0℃、4℃冰箱中保存4h,24h,48h,进行光,电镜酶组织化学研究。使用图像分析系统进行定量测定。结果：4℃、24h实验组钠泵活性可以得到较好的保存（P＞0．05）。结论：钠泵可以作为检测供保存质量的重要指标。     

符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA样本贮存条件考察

目的:考察在不同温度下储存时间和反复冻融对粪便中人基因组DNA含量的影响。方法:1.将粪便样本在室温、4℃、-40℃和-70℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,使用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒提取得到粪便DNA,通过实时荧光定量PCR体系对人KRAS基因定量确定人基因组DNA含量,评价粪便样本不同冻存条件对其中人基因组DNA含量的影响。2.将粪便DNA样本在4℃和-40℃条件下分别放置不同时间和-40℃条件下保存并反复冻融后,评价粪便DNA样本不同冻存条件下对其中人基因组DNA含量的影响。结果:1).粪便样本常温放置2小时,其中人基因组DNA即发生明显降解(P0.01),4℃可保存3天左右,-40℃可保存4周,-70℃可保存3个月以上,粪便反复冻融第3次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。2).粪便DNA 4℃可保存3天,-40℃可保存4周,粪便DNA反复冻融第4次,其中人基因组DNA降解具有统计学意义(P0.05)。结论:符合大肠癌早期无创分子诊断要求的粪便DNA贮存条件:粪便样本室温收集后尽快保存;短期可处理的粪便样本存放在4℃条件下(3天内);暂无法处理则存于-40℃(1个月内);粪便样本长期保存在-70℃条件下,可保存3个月。     

冷应激条件下猪睾丸细胞中RNA结合基序蛋白3过表达对Caspase 3表达的影响

目的：探讨冷应激（32℃）条件下,猪睾丸（ST）细胞系中RNA结合基序蛋白3（RBM3）过表达时凋亡蛋白半胱天冬酶3（Caspase 3）表达量变化情况。方法：利用本实验室成功构建的携带绿色荧光蛋白（GFP）的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分别感染ST细胞,作为过表达病毒（OEV）组和空载体病毒（EVV）组,此外还设立野生型细胞（WTC）组作对照,利用实时荧光定量RCR（qPCR）法和Western blot分析法检测各组中RBM3 mRNA和蛋白的表达情况。然后对各组细胞进行37℃以及32℃（2 h、4 h,8 h）的冷应激处理,利用酶联免疫吸附实验（ELISA）法检测各组Caspase 3表达量的变化。结果：OEV组RBM3基因和蛋白相对表达量高于EVV组和WTC组。在37℃以及32℃冷应激实验（2 h、4 h,8 h）中,OEV组Caspase 3表达量显著低于EVV组和WTC组。结论：冷应激ST细胞中RBM3过表达能够显著地降低Caspase 3的表达程度,为RBM3基因具有抵抗低温诱导ST细胞凋亡作用提供实验依据。     

云南蜂腰兰的快速繁殖和离体保存

1植物名称云南蜂腰兰（Bulleyia yunnanensisSchltr）。2材料类别新鲜种子和干冷保存种子（-20℃、空气湿度15%条件下130 d,然后转入10℃、湿度为37%条件下保存3、5、21个月）,试管苗的小芽和假鳞茎切段。3培养条件种子萌发培养基：（1）花宝1号（美国Haponex公司产品,N：P：K=7：6：19）3 g·L-（-1）＋NAA 0.5mg·L-（-1）（单位下同）＋活性炭500,     

保存介质和温度对西伯利亚鲟卵子短期保存的影响

研究了不同保存介质(体腔液CF、Hepes液、RMS液)、温度(4℃、16℃)和保存时间(4 h、8 h、16 h、24 h)对西伯利亚鲟卵子短期保存的影响.结果显示:保存介质、温度和时间对卵子受精率、孵化率和初孵仔鱼畸形率有显著性影响(P<0.05),受精率、孵化率均随保存时间的延长而下降,畸形率上升.16℃条件下保存卵子受精率、孵化率和畸形率均高于4℃,但4℃下卵子的保存时间较16℃下长.研究表明,采用根据西伯利亚鲟体腔液生化成分配制的Hepes液作为保存介质,于16℃下保存4 h为西伯利亚鲟卵子的最佳保存条件,此时受精率、孵化率和畸形率分别为86.36%、94.74%和0.     

大叶黑桫椤孢子超低温保存

大叶黑桫椤孢子在液氮中长期保存的结果表明：（1）大叶黑桫椤孢子可以保存于液氮中;（2）液氮保存后的孢子萌发率比未用液氮保存的普遍下降,保存90d的用室温慢速化冻的孢子萌发率最高（65.3％）,相对保持率最高可达79.3％;（3）采用室温（22～25℃）慢速化冻的效果优于37℃温水浴快速化冻的。据此认为,液氮超低温长期保存大叶黑桫椤孢子是可行的。     

氟康唑注射液稳定性研究

目的检测氟康唑注射液在不同条件下的稳定性。方法系统观察不同条件下氟康唑注射液的稳定性,条件分别为高温（40℃）、4500Lx强光试验观察10d,室温（25℃）、低温（4℃）试验各观察3个月。建立一个简单的HPLC法用于稳定性试验中氟康唑和降解产物的含量测定。结果氟康唑＇往射液的含量和降解产物均无明显下降。结论氟康唑注射液在上述条件下是稳定的。     

人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白,分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列,合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3）,摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件,表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性,研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件,重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6,IPTG终浓度0.4mmol/L,30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d,25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高,冻干品稳定性好,为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。     

SARS病毒NS-1株稳定性及培养条件的研究

用SARS病毒NS-1株接种Vero细胞,37℃培养,于培养1、2、3、4d收获病毒液,分别置-70℃冻融和4℃释放,于不同时期取样进行病毒滴定。结果显示,SARS病毒NS-1株各代次培养特性和形态学变化完全相同,有较好的抗原特异性,病毒滴度稳定,4℃保存125d,滴度下降2．25lgCCID50／ml,-70℃保存6个月,滴度未见明显下降。SARS病毒NS-1株未经冻融或释放,1d收获的病毒滴度比2、3、4d收获的病毒滴度低,经冻融或释放,1、2、3、4d收获的病毒滴度无明显区别,病毒收获时的病毒滴度与形态学变化成正相关。不同接种条件收获的病毒液,病毒滴度无明显区别。SARS NS-1株有较好的遗传稳定性和保存稳定性,培养2d,4℃释放收获病毒液,细胞悬液与病毒混合接种更简单,易操作,更适合疫苗规模生产。     

VSD负压引流技术结合游离植皮治疗大面积皮肤缺损的 临床疗效研究

目的：探讨核苷类似物（NAs）拉米夫定（LAM）用药时间与乙型肝炎（cHB）患者体内HBV病毒血清HBV-DNA载量的关系。方法：选取214例HBeAg阳性患者,在LAM（100mg/d）的36个月用药治疗前使用实时荧光定量PcR进行血清HBV-DNA载量进行测定,并使用特异性引物鉴定HBV病毒DNA保守位点YMDD的抗药性突变以及病毒株的变化情况。结果：（1）214例患者均对LAM产生应答,在治疗12．18个月后血清HBV-DNA载量稳定在较低水平。（2）病毒株在NAs治疗前已经出现耐药性突变（18％）,用药加速了HBV病毒的耐药进化,18个月后耐药病毒数在214例样本中均超过10％的检测标准。结论：LAM治疗在9．18个月获得良好的治疗效果,建议24个月后停药更换临床处方防止耐药病毒株的进化。     

蛋白质谷氨酰胺酶的发酵及初步分离和应用研究

研究了不同发酵条件对于产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）生产蛋白质谷氨酰胺酶能力的影响,酶的分离和初步的应用。通过考察种子的生长曲线,发酵的温度、转速、摇瓶装液量,碳源和氮源,得出最大产酶能力的发酵条件为：30℃,200r/min,装液量25ml/250ml,蔗糖为碳源,多聚蛋白胨为氮源,发酵10~12h。初步分离研究表明在4倍超滤浓缩和4倍乙醇沉淀条件下,酶活力回收率均为最高,分别为84.99%和76.07%。该酶与酪蛋白37℃温育2h时,酪蛋白的脱酰胺度为41.03%,到24h后,脱酰胺度不再增加,并且酪蛋白的溶解性也有所增加。     

卫氏并殖吸虫童虫回收和体外保存的实验研究

将实验感染卫氏并殖吸虫囊蚴的21只小鼠和25只大鼠的组织碎片,分别浸于37℃林格氏液中,不同时间内共检获游离的童虫3026条,其中93.6％及98.5％以上的童虫是于浸泡2及4小时检获的,提示此法浸泡2—4小时即可回收绝大多数的虫体。对检获的活虫保存在4—8℃的灭菌生理盐水,林格氏液或囊蚴保存液中,至少可活5天,个别童虫在囊蚴保存液中可活39天以上,而同液保存在20—25℃或37℃中,1—2天即有童虫死亡,5—10天全部死尽。     

成熟欧李果肉中单宁提取条件的优化

以成熟欧李为试验材料,乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺为提取剂,采用L25（5^6）正交试验设计,从溶剂浓度、固液比、浸提时间、浸提温度等因素的不同水平对欧李果肉中单宁的提取条件进行了研究,结果表明：从欧李果肉中提取单宁的最佳条件为：以丙酮作提取剂,浓度60％,浸提时间4h,浸提温度30℃,固液比1：20;以乙醇作提取剂,浓度30％,浸提时间4h,浸提温度60℃,固液比1：30。     

蛇鮈精子保存液的筛选及其效果研究

旨在研究不同精子保存液对蛇鮈精子活率的影响,并探讨保存蛇鮈精子的最佳保存液。在光镜下观察6种精子保存液保存蛇鮈精子后精子活率的变化,结果表明精子保存液在低温(4℃)保存蛇鮈精子的方法效果较好。6种蛇鮈精子保存液使精子的活率保持为80%的时间有着明显的差异:A液为36 h,B液为4 h,C液为0 h,D液为60h,E液为16 h,F液为6 h,因此在低温(4℃)下,蛇鮈精子的最佳保存液为D液。     

SOD对4℃保存人红细胞损伤的防护作用研究

目的：探讨SOD对延时保存红细胞损伤防护作用的机理。方法：取义务献血人员静脉血,置4℃冰箱保存。保存前后不同时期用标准方法分别检查各项指标,用生物荧光素标记红细胞,测定24h活存率。实验分3组：ACD和／或GMA、抗氧化剂（SOD）组。结果：SOD组保存75d,无氧糖酵解率维持在保存前的86．2％,ATP为56．4％,PK为64．3％,明显高于GMA或ACD组。保存75d整体回输后24h活存率为86．1％,与GMA保存42d(89.1%)结果接近。结论：用抗氧化剂保养液在4℃条件下保存人血红细胞从42d延长到75d,红细胞无氧糖酵解率、ATP、PK和整体回输后24h活存率等均与42d保存方相符,为红细胞的活存提供了理论根据。     

不同保存方法对柽柳基因组总DNA产量和质量的影响

通过比较不同保存方法对柽柳(Tamarix chinensis)基因组总DNA提取效果的影响,确定合适的野外采集植物样品的保存方法。采用改良CTAB法提取了室温风干、4℃、-20℃、-80℃和硅胶干燥5种保存方法分别保存24 h、1周和1月后的柽柳基因组总DNA,结果表明:4℃保存1月后DNA产量最低,为60.35μg/g,-80℃条件下保存24 h的材料中提取的DNA产量最高,为246.92μg/g,保存效果最好。但在野外仪器条件不具备的情况下,柽柳可采用室温风干或硅胶干燥保存的方法,1月内材料中DNA降解程度较轻,可以扩增出所需目的片段。