单纯疱疹病毒1型立即早期蛋白ICP22研究进展

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV-1)感染细胞蛋白22(Infected Cell Protein 22,ICP22)是Us1基因编码的一种翻译后修饰多功能蛋白,为HSV-1的五种立即早期蛋白之一。HSV-1 ICP22能与不同的细胞和病毒成分相互作用来执行不同的功能,包括改变RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ/PolⅡ)的磷酸化状态、参与抵抗细胞对病毒复制的消极作用、引起细胞周期蛋白A和B水平降低、介导修饰拓扑异构酶Ⅱα、参与胞核内病毒诱导的分子伴侣富集(Virus-induced chaperone-enriched,VICE)区域的形成及促进病毒新生核衣壳的初次包装。这些作用大多与调节病毒在胞核中有效复制相关。此外,HSV-1 ICP22还在限制细胞中的病毒复制、病毒致病力和潜伏感染建立过程中发挥重要作用,但ICP22发挥这些作用的机制尚未知。本文就上述目前国内外对HSV ICP22的研究进展作一综述,以期为后续研究提供参考。     

单纯疱疹病毒1型DNA聚合酶辅助亚基UL42的研究进展

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1, HSV-1) UL42作为病毒编码的DNA聚合酶辅助亚基之一，是一种多功能蛋白，其在催化和调节病毒在细胞核内的有效复制发挥了重要的作用。已知UL42能提高DNA聚合酶催化亚基UL30的持续合成能力，激活病毒DNA聚合酶活性；介导DNA聚合酶的入核；与DNA模板链结合，提高病毒复制的保真度，以及含有抑制DNA聚合酶活性的肽段，提示其在病毒复制过程中也可能具有负调控作用。近期亦有报道显示，UL42能够阻断肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α， TNF-α)激活的核转录因子(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路以及干扰素调控因子3(interferon regulatory factor 3, IRF-3)的功能，提示其在病毒逃逸宿主天然免疫反应中发挥了一定的功能，但具体的作用机制尚不明确。本文对目前国内外HSV-1 UL42的结构特点、主要功能、作用机制及其在抗病毒药物研发中的研究进展进行综述，为后续揭示病毒致病机制和抗病毒药物的研发提供参考。     

UL29shRNA表达质粒与ACV对HSV-2 抑制效果的比较

目的:通过将筛选的UL29shRNA表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦(ACV)的抗病毒效果及细胞毒性进行比较,探讨RNA干扰在细胞水平上对HSV-2病毒的抑制效果。方法:将筛选的干扰效果最好的表达质粒UL29-shRNA1641作为RNA干扰组与抗病毒药ACV进行对HSV-2的抑制效果的比较研究,分为RNAi组、ACV组和RNAi+ACV组。采用实时荧光定量PCR检测UL29mRNA的相对表达量,Karber法检测细胞上清液中病毒滴度的变化、蛋白印迹法(Western blot)检测ICP8的相对表达量,对RNAi与ACV抑制效果进行比较,通过WST-1(Water-Soluble Tetrazolium-1)法对质粒转染复合物(质粒+转染试剂)和ACV的细胞毒性进行比较。结果:RT-PCR检测三组mRNA的相对表达水平,其中RNAi组UL29基因相对表达量高于ACV组(P0.05);RNAi+ACV组UL29基因相对表达量明显低于RNAi组和ACV组(P0.05)。Karber法检测三组细胞上清液病毒滴度表明,RNAi组病毒滴度高于ACV组(P0.05),RNAi+ACV组的病变病毒滴度明显低于RNAi组和ACV组(P0.05)。Western blot检测ICP8相对表达量,ACV组的ICP8(UL29编码的单链DNA结合蛋白,主要作用是在HSV-2 DNA复制过程中与复制叉产生了单链DNA结合,防止其重新配对形成ds DNA或被核酸酶降解)相对表达量比RNAi组低(P0.05)。RNAi+ACV组ICP8相对表达量降低最为明显,与ACV组和RNAi组相比有显著差异(P0.05)。WST-1法对转染复合物与ACV的细胞毒性进行比较,其中RNAi中质粒和转染试剂对细胞的毒性明显小于ACV。结论:在RNAi与ACV对HSV-2抑制效果的比较中,ACV要好于RNAi,两者联合使用的抑制效果好于单独使用RNAi或ACV。在抑制效果都较好的情况下比较,RNAi中使用的质粒与转染试剂对细胞的影响比ACV小。     

一种1型单纯庖疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒（HSV-1）作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史. 本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统. 首先,将HSV-1内部反向重复序列（internal inverted repeat sequences, IR）两侧的片段克隆入pKO5获得穿梭质粒pKO5/BN,其电转含pHSV-BAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的 pHSVΔIR-BAC. pHSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR（MH1001）.上述pKO5/BN和含pHSVΔIR BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统. 利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP（MH1002）.MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异|Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降|免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

HSV-1UL6基因编码门蛋白的结构及功能

门蛋白在单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的衣壳装配和基因组包装过程中扮演重要角色,对病毒的复制有重要作用。本文就HSV-1 UL6基因编码的门蛋白进行阐述,具体介绍形成门蛋白多聚体的影响因素,门蛋白及其周边蛋白的结构及功能,以及其靶点药物的研究现状等,以期为研究门蛋白在疱疹病毒感染和复制过程中的作用提供一定参考。     

利用IE基因表达外源抗原的HSVⅠ重组病毒的构建

目的 研究ICP22蛋白缺失是否影响病毒的感染复制以及ICP22蛋白在病毒水平上功能.方法 利用同源重组方法用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的编码基因取代ICP22蛋白的编码基因,以流式细胞仪分选结合蚀斑筛选的方法得到ICP22蛋白缺失的单克隆重组病毒.结果 对ICP22蛋白缺失重组病毒进行绿色荧光的表达情况的镜下观察、GFP基因序列的测定、重组病毒中GFP基因的定量PCR检测、GFP蛋白表达的Western 印迹 检测等方法进行了验证,成功构建了ICP22蛋白缺失的重组病毒,并在研究过程中发现ICP22蛋白缺失的重组病毒出现感染复制停滞的现象.结论 ICP22蛋白缺失的重组病毒出现感染复制停滞的现象提示其在细胞中具有重要的功能.     

靶向ICP4的小干扰RNA对HSV-1病毒复制能力的影响

HSV-1是一种嗜神经病毒,能引起一系列神经系统严重症状,然而目前抗HSV-1药物易反弹、不能完全清除潜伏的病毒。ICP4对HSV复制、转录起主要调节作用,决定着溶细胞型感染或潜伏状态的平衡点。为了探寻新的抗病毒策略,本课题以HSV-1ICP4基因为靶点,设计合成2对siRNA,并构建重组真核慢病毒表达质粒pL-KO-puror-hU6-siRNA,通过脂质体转染和嘌呤霉素筛选建立靶向ICP4的4个siRNA单克隆细胞系,Real-timePCR法检测细胞系中ICP4的mRNA表达水平,TCID50法检测siRNA对HSV-1病毒复制能力的影响。结果显示靶向siRNA能有效抑制单克隆细胞系中的ICP4表达,并且抑制ICP4的表达后HSV-1病毒复制能力明显减弱,表明靶向ICP4的siRNA对HSV-1复制有明显抑制作用,且多位点siRNA联合干扰对病毒复制有协同抑制效果,有望应用于生物抗病毒药物的制备。     

单纯疱疹病毒2型衣壳支架蛋白ICP35原核表达载体的构建及其表达特性分析

本研究旨在构建单纯疱疹病毒2型(herpes simplex virus type 2,HSV-2)衣壳支架蛋白ICP35的原核表达载体,并分析其在HSV-2增殖中的表达特性。以HSV-2基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增HSV-2 ICP35的编码基因UL26.5,并克隆至原核表达载体pET-32a(＋),转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,将纯化的重组ICP35免疫家兔后获得抗体,采用免疫荧光检测ICP35在HSV-2增殖中的表达特性。结果显示,HSV-2 UL26.5基因的PCR产物大小约为1 065 bp,原核表达重组蛋白的相对分子质量约为6.3×10⁴,免疫家兔的血清抗体可特异性识别HSV-2 ICP35。免疫荧光检测结果显示,HSV-2 ICP35可在感染后8 h出现于细胞核周围,12 h表达量进一步增加并向细胞核内聚集,16 h后在细胞核、细胞质内均可检测到聚集成斑点状的衣壳支架蛋白。结果表明,HSV-2 ICP35原核表达载体的成功构建及对其在HSV-2增殖中表达特性的分析,将为研究UL26.5基因的功能、蛋白相互作用、病毒与宿主的相互作用及筛选药物靶标等奠定基础。     

HSV-1间层蛋白VP22转录调控功能的分析

HSV-1间层蛋白是一类重要的功能蛋白,在病毒复制的多个环节中具有重要意义．为了解主要间层蛋白VP22在病毒复制过程中的生物学特性,本实验利用氯霉素乙酰转移酶系统,分析了VP22对病毒启动子的转录调控功能,结果表明VP22对HSV-1觯,TK和gC基因启动子明显具有剂量效应关系的转录抑制作用;VP22也能抑制病毒不同转录调控因子（VP16和ICP0）对启动子的转录激活作用,尤其明显抑制ICP0对TK和gC基因启动子的转录激活作用;VP22能明显抑制组蛋白乙酰转移酶PCAF对ICP0转录激活的促进作用,此抑制作用较VP22抑制ICP0的转录激活作用更为显著．VP22对其他病毒启动子的转录抑制效应,在内对照实验β-gal活性分析中也得到了证明．     

特异性干扰ICP27基因的siRNA对HSV-1病毒复制的影响

针对单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus 1,HSV-1)的ICP27基因和其他疱疹病毒相关基因的高度保守区设计小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),研究其抑制病毒复制的效果。首先构建相应的小发夹RNA(small hairpin RNA,shRNA),然后通过病毒滴度测定、real-time PCR和细胞致病变效应(cytopathic effect,CPE)检测所设计的siRNA抑制病毒复制的能力。结果显示,所设计的shRNA-2(靶序列起始位置815)和shRNA-3(靶序列起始位置1 367)具有明显地抑制病毒复制的效果。尤其是shRNA-3,抑制病毒复制的效果更明显,在病毒滴度实验中,与阴性对照相比,其抑制倍数为81,同时可以下调ICP27基因的mR NA表达水平。实验结果表明shRNA-3能够显著抑制HSV-1病毒复制的能力,可以作为HSV-1感染性疾病的补充治疗手段,其对应的靶序列可以作为抗HSV-1新的靶标。     

敲减单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）UL30蛋白表达可抑制HSV-2复制

按照shRNA（small hairpin RNA）设计要求,选择编码单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶催化亚单位的U_L30（unique long 30,U_L30）基因序列保守区域,设计、合成并构建表达U_L30序列特异性siRNA（short interfering RNA）的质粒载体pUL30．通过磷酸钙转染法将其转染入HEK（human embryonic kidney）293细胞中,用蛋白印迹法检测对HSV-2 UL30蛋白表达的影响,观察受染细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,终点滴定法测定细胞上清液中病毒感染滴度（50% tissue culture infective dose,TCID₅₀）．结果表明,针对U_L30基因的siRNA能有效抑制UL30蛋白表达,同时显著抑制受染细胞的CPE,降低上清液中病毒感染滴度．提示本研究建立的针对U_L30基因特异性siRNA能有效阻断HSV-2在HEK293细胞内的复制,U_L30基因是一个潜在的抗HSV-2复制的药物靶标．     

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒,能引起皮肤性疱疹、角膜炎、脑炎等症状。HSV-1感染细胞后,要么进入裂解性感染阶段,要么进入潜伏感染阶段。受感染的细胞常会启动免疫系统抵抗病毒,而病毒却通过某种机制巧妙地逃避宿主的免疫反应并进入潜伏。进入潜伏感染阶段的病毒又会因机体受某种刺激而被激活进入裂解感染期。在这期间,有两个关键的病毒蛋白一间层蛋白(Viral protein16,VP16)和内膜蛋白(Virion host shutoff protein,VHS)倍受关注,它们既是HSV-1的结构蛋白,在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装,同时又作为重要的功能蛋白…     

一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.     

单纯疱疹病毒1型VP16蛋白和VHS蛋白研究进展

单纯疱疹病毒1型(HSV-1)为有包膜的DNA病毒,能引起皮肤性疱疹、角膜炎、脑炎等症状.HSV-1感染细胞后,要么进入裂解性感染阶段,要么进入潜伏感染阶段.受感染的细胞常会启动免疫系统抵抗病毒,而病毒却通过某种机制巧妙地逃避宿主的免疫反应并进入潜伏.进入潜伏感染阶段的病毒又会因机体受某种刺激而被激活进入裂解感染期.在这期间,有两个关键的病毒蛋白一间层蛋白(Viral protein 16,VP16)和内膜蛋白(Virion host shutoff protein,VHS)倍受关注,它们既是HSV-1的结构蛋白,在病毒复制晚期参与病毒颗粒的组装,同时又作为重要的功能蛋白,在病毒感染早期发挥重要的转录调节功能.下面就这两个蛋白相关功能的研究进展作一简要综述:     

单纯疱疹病毒Ⅰ型新开放读码框UL57的鉴定

单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)潜伏感染期间LATs的活跃转录可能与其启动子与增强子两侧的CTCF结合序列有关。本研究对位于UL56下游与LAT启动子上游之间并与CTCF结合序列重叠存在的一个新开放读码框(本研究中命名为UL57)进行了鉴定。首先利用HSV-1(F)细菌人工染色体(HSV-BAC)系统构建重组病毒HSV-EGFP-UL57,将EGFP序列插入UL57 5’端;然后分别通过Northern Blot和Western Blot检测EGFP标记的UL57的转录和表达;同时构建敲除UL57的重组病毒HSV-ΔUL57,观察UL57对病毒增殖的影响。结果显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57感染HEp-2细胞17h后,EGFP探针检测到两条转录产物,其中1.8kb转录产物与预测大小相符;使用放线菌酮(Cycloheximide,CHX)阻断病毒即刻早期蛋白/早期蛋白合成后,UL57转录受到明显抑制。重组病毒HSV-EGFP-UL57感染Vero细胞后,9h可见融合蛋白表达,24h表达明显;融合蛋白分子量与预测大小(58kD)一致。病毒生长曲线显示,重组病毒HSV-EGFP-UL57及HSV-ΔUL57在Vero细胞中的增殖水平与HSV-1(F)基本一致。本研究表明,在HSV-1基因组(GenBank:GU734771.1)UL56下游与LAT启动子上游之间存在一个新开放读码框UL57(116 921bp～117 799bp),UL57可以进行转录,且其转录受病毒即刻早期蛋白/早期蛋白调控;转录产物可以翻译出融合蛋白,但表达水平较低。删除UL57对病毒增殖无明显影响。     

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测 p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量（TCID_５０）,以及观察感染细胞的细胞病变效应（CPE）等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与 ERK通路的关系. 结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.     

HSV-1立即早期蛋白ICP22与VP16共同参与α基因转录调控的初步分析

Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus1,HSV-1）在宿主体内形成两种感染模式,不同感染模式的建立与病毒α基因的表达相关.作为病毒α基因表达产物之一的ICP22在病毒复制中发挥了多重作用,但其确切功能尚不清楚.实验利用氯霉素乙酰转移酶（chloram-phenicol acetyl transferase,CAT）报告系统发现ICP22非特异地抑制多种病毒或细胞启动子的转录启动作用,而且该抑制作用不受特定的病毒或细胞启动子上游调控元件影响.进一步的实验发现,HSV病毒蛋白VP16通过结合α4基因启动子上游特定元件解除ICP22对α4基因的转录抑制.这些结果提示,ICP22和VP16可能共同参与α基因的转录调控,从而建立HSV-1裂解性增殖或潜伏性感染.     

HSV-1 UL41基因编码蛋白的RNase活性及其调控

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type-1,HSV-1)UL41基因编码一种皮层蛋白,该蛋白质具有核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)活性,能特异性地降解一些宿主和病毒信使RNA(messenger RNA,m RNA),参与宿主免疫逃逸,与其他蛋白质相互作用调控其RNase活性。该文概述了HSV-1UL41基因编码蛋白的RNase活性及其调控机制,以期为该基因的深入研究提供参考。     

HSV-1早早期蛋白ICPO的研究进展

人单纯疱疹病毒Ⅰ型（herpes simplex virus typeⅠ,HSV-1）不仅可以引起人周期性唇疱疹,还可以引起其它更为严重的疾病。HSV-1病毒基因组的表达具有很高的时序性,按照基因表达的先后顺序可以将病毒基因组中的基因分为早早期基因（immediate early,IE）,早期基因（early,E）和晚期基因（1ate,L）。其中早早期基因是最先转录的,其表达产物用来激活早期基因和晚期基因的启动子。早早期基因的产物包括ICPO（infected cell protein 0,ICP）、ICP4、ICP27、ICP47、ICP22和Us1．5等六种蛋白质。其中最为重要的是ICP0,它具有泛素连接酶E3（enzyme 3,E3）功能域,通过多种途径调控病毒基因组以及宿主细胞中基因的转录。     

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。