利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的pBlueBacHis2A转移载体中,将重组质粒pBlueBacHis2A-CagA与亲本病毒Bac-N-blue DNA共转染Sf9细胞,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒.经PCR法鉴定后进行扩增培养,SDS-PAGE和Western bolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白,间接ELISA分析表明,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应.     

利用杆状病毒表达幽门螺杆菌cagA基因

幽门螺杆菌cagA基因克隆到杆状病毒表达系统的 pBlueBacHis2A转移载体中 ,将重组质粒 pBlueBacHis2A CagA与亲本病毒Bac N blueDNA共转染Sf9细胞 ,以空斑法纯化获得的重组杆状病毒。经PCR法鉴定后进行扩增培养 ,SDS PAGE和Westernbolt检测结果证实所表达的蛋白为CagA蛋白 ,间接ELISA分析表明 ,表达产物可与Hp感染者血清发生特异性的免疫反应     

幽门螺杆菌cagA克隆表达

克隆表达4株幽门螺杆菌的cagA基因,以方便地获得大鼠CagA蛋白和重组表达质粒,为临床诊断CagA阳性幽门螺杆菌感染,以及进一步研究不同类型CagA功能及其与疾病关系提供材料。PCR扩增幽门螺杆菌的cagA基因,克隆至PinPoint^TMXa-1T载体,酶切鉴定连接方向,IPTG诱导正向连接克隆表达CagA融合蛋白并进行SDS－PAGE和Western blots鉴定。结果显示PCR扩增得到3.5-3.8kb的CagA基因,PCR及酶切鉴定得到正向连接的重组克隆,SDS－PAGE及Western blots证实正向连接的重组克隆表达CagA融合蛋白。构建了4种cagA的重组表达质粒,通过转化同一宿主菌可研究不同CagA的功能和致病性差异;通过亲和层析纯化融合蛋白可获大量CagA蛋白,用于血清学诊断CagA阳性幽门螺杆菌感染,及不同抗原性CagA与疾病之间的关系。     

幽门螺杆菌vacA和cagA基因全长分子系统发育分析

文章从GenBank中下载所有含有vacA和cagA基因的H.pylori菌株的VacA和CagA全长氨基酸序列,利用ClastalX 2.0和MEGA 5.05软件构建VacA和CagA分子系统发育树,探讨两基因之间的分子系统发育关系和不同聚类群的临床感染结果与基因型特征。结果显示,VacA和CagA具有高度相似的分子系统发育树,并且所有H.pylori菌株在系统发育树中具有相同的分布特点,分别聚类为东亚株群1、2和西方株群3个聚类群。其中东亚株群1患萎缩性胃炎比例较高,vacA基因型以s1c/m1b和s1a/m1b为主,cagA基因型以EPIYA-ABD为主;东亚株群2患十二指肠溃疡的比例较高,vacA基因型以s1c/m2和s1a/m2为主,cagA基因型以EPIYA-AB’C为主;西方株群患十二指肠溃疡和胃炎的比例相当,萎缩性胃炎比例较低,vacA基因型以s1a/m1a和s1b/m1a为主,cagA基因型以EPIYA-AB/B’CC为主。这些结果说明,vacA和cagA基因可能具有共进化的遗传关系;东亚株群1、2和西方株群分别具有不同的vacA和cagA基因亚型,这可能与其临床感染结果密切相关,因此,在进行H.pylori相关性疾病分析时,有必要结合vacA和cagA基因型的亚型做深入分析。     

幽门螺杆菌的iceA基因

本文主要论述幽门螺杆菌iceA基因的2个等位基因iceA1和iceA2的结构及与疾病的关系,并简要介绍iceA与cagA和vacA的相关性。     

幽门螺杆菌耐甲硝唑基因分型与耐药性关系研究

目的：了解幽门螺杆菌（Hp）对甲硝唑的耐药株状况,探讨耐甲硝唑基因分型与耐药性的关系。方法：分离培养Hp,以纸片扩散法检测Hp对甲硝唑的耐药性,再用PCR方法扩增甲硝唑耐药基因,用RFLP方法进行基因分型,最后比较基因型与耐药性的关系。结果：武汉地区人群Hp对甲硝唑耐药率为67％,耐药株基因型与耐药性有相关性。结论：可以以基因型鉴定Hp对甲硝唑的耐药性,此方法,稳定可靠。     

普通Taq DNA聚合酶扩增幽门螺杆菌尿素酶基因长片段

ＰＣＲ反应扩增较长的ＤＮＡ片段比较困难。本实验对幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上的２７Ｋｂ尿素酶基因用普通ＴａｑＤＮＡ聚合酶进行扩增,扩增结果以琼脂糖凝胶电泳证实,得到所需的２７Ｋｂ的片段。该实验为今后幽门螺杆菌工作的进一步研究提供了经济,有效,简捷的条件。     

淮南地区幽门螺杆菌感染个体菌株基因多态性与感染结局的影响

目的:探讨淮南地区幽门螺杆菌感染个体菌株基因多态性及其与感染结局的影响。方法:选取125例幽门螺杆菌(H.pylori,HP)感染的慢性胃炎、消化性溃疡患者,常规获取胃窦、胃体部粘膜,进行HP分离、培养,提取HP基因组DNA,采用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹分析法检测菌株基因多态性;125例患者均给予质子泵抑制、H2受体拮抗剂、铋剂为基础的三联或四联疗法治疗,治疗后4~6周进行14C-尿素呼气试验评估Hp根除情况;获取HP根除失败患者的胃窦、胃体黏膜进行HP分离、培养、鉴定,并采用RAPD指纹分析法检测菌株来源,评估HP基因多态性对治疗结局的影响。结果:cagA、iceA1、iceA2、vacAs1、vacAm1、babA2阳性率分别为92.80%、36.00%、93.60%、93.60%、29.50%、53.50%,cagA、iceA2、vacAs阳性率均高于其他基因类型阳性率(P0.05或P0.01),其他基因类型阳性率比较差异无统计学意义(P0.05)。经治疗后HP根除率为86.4%(107/125),14.4%(18/125)根除失败;18例根除失败患者中,15例患者治疗前后的菌株具有相同的指纹图谱,证实为原菌株复发,其中cagA、iceA1、iceA2、vacAs1、vacAm1、babA2阳性率分别为93.33%、13.33%、86.67%、93.33%、6.67%、20.00%,cagA、iceA2、vacAs阳性率均高于其他基因类型阳性率(P0.05或P0.01)。结论:cagA+、vacAs+、iceA2+为淮南地区HP感染的优势基因型,该基因型易导致HP根除失败;未发现babA2与HP感染结局存在相关性。     

幽门螺杆菌尿素酶基因的研究进展

近年来,幽门螺杆菌的分子生物学研究取得了很大进展,而既是定植因子、又是毒力因子的幽门螺杆菌尿素酶也得到了更加深入的研究。本文就近年来幽门螺杆菌尿素酶基因的结构、转录、表达调控等方面一些新的研究进展作一综述。     

胃癌与幽门螺杆菌cagA、hrgA基因相关性的研究

目的:探讨幽门螺杆菌(Hpylori)菌株中cagA和hrgA基因对胃癌的致病作用及其检测的意义。方法:胃癌及消化性溃疡术后切除标本,组织学检查,快速尿素酶法和PCR检测。结果:40例标本经组织学检查24例为胃腺癌,2例为胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)瘤,14例为消化性溃疡。经快速尿素酶法检测,胃腺癌中,12例H pylori( ),消化性溃疡中,12例H pylori( )。经PCR检测,胃腺癌中,18例hrgA( ),6例hrgA(-),20例cagA( ),4例cagA(-);消化性溃疡中,6例hrgA( ),8例hrgA(-),12例cagA( ),2例cagA(-)。结论:H pylori感染与胃癌的发生有密切关系。PCR检测较快速尿素酶法准确。检测cagA和hrgA基因对了解Hpylori菌株的致病性、估计疾病程度、了解病变预后及临床治疗都具有重要意义。     

Identification of Helicobacter pylori and the cagA genotype in gastric biopsies using highly sensitive real-time PCR as a new diagnostic tool

The CagA protein is one of the virulence factors of Helicobacter pylori, and two major subtypes of CagA have been observed, the Western and East Asian type. CagA is injected from the bacteria into gastric epithelial cells, undergoes tyrosine phosphorylation, and binds to Src homology 2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase SHP-2. The East Asian type CagA binds to SHP-2 more strongly than the Western type CagA. Here, we tried to distinguish the CagA type by highly sensitive real-time PCR with the objective of establishing a system to detect H. pylori and CagA subtypes from gastric biopsies. We designed primers and probe sets for Western or East Asian-cagA at Western-specific or East Asian-specific sequence regions, respectively, and H. pylori 16S rRNA. We could detect the H. pylori 16S rRNA gene, Western and East Asian-cagA gene from DNA of gastric biopsies. The sensitivity and specificity for H. pylori infection was 100% in this system. In Thai patients, 87.8% (36/41) were cagA-positive; 26.8% (11/41) were Western-cagA positive and 53.7% (22/41) were East Asian-cagA positive, while 7.3% (3/41) reacted with both types of cagA. These results suggest that this real-time PCR system provides a highly sensitive assessment of CagA type as a new diagnostic tool for the pathogenicity of H. pylori infection.     

应用PCR扩增对分枝杆菌分类鉴定及标本检测的研究

用对结核分枝杆菌特异性很强的引物 b对 2 1种分枝杆菌和 13种非分枝杆菌进行 PCR扩增 ,并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明 :受试菌种用引物 b在退火温度 6 1℃时 ,扩增的敏感性为 50 fg,且只能扩出结核分枝杆菌、胃分枝杆菌 ,且他们扩增片段的分子量也不相同。可见 ,用引物 b,必要时辅以引物a,对分枝杆菌 16 S～ 2 3S r DNA间隔区序列进行扩增 ,可以快速有效地鉴定分枝杆菌临床分离株 ,是分枝杆菌鉴定的一种新方法。     

Identification of the repeated number of C and D regions of tyrosine phosphorylation motifs in Helicobacter pylori cagA using multiplex PCR

Various tyrosine phosphorylation motif regions of H. pylori cagA exist. The number of these regions was found to have some influence on cell signaling, which was found to be more pronounced when in D (ESS) region than in C (WSS) region. A molecular biological method with multiplex PCR was developed to distinguish C and D regions, and to identify the repetition number of tyrosine phosphorylation of the cagA gene. Multiplex PCR using novel primer sets was performed on 73 strains of H. pylori isolated from Korean patients with upper gastrointestinal diseases. The Western cagA was identified in only 3 strains (4.1%) whereas East Asia cagA was identified in 69 strains (94.5%). These results were reconfirmed through a sequencing analysis. The method developed in this study would be useful for monitoring the repeated number of C and D regions of tyrosine phosphorylation motifs in H. pylori cagA.     

乙型肝炎病毒基因亚型检测意义

乙型肝炎病毒基因亚型检测意义曹洪林张显忠陈禹保乙型肝炎是危害我国人民身体健康的重要疾病,患者和病毒携带者约占人群的１０％～１５％,感染人群约５０％～７０％。乙型肝炎病毒有四种重要的血清学亚型（ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｒ、ａｙｗ）,血清学亚型检测方法为蛋白质水平的检测技术,所观察的亚型属蛋白质水平的表型结果,不能反映决定其亚型的基因和其变异情况。乙型肝炎病毒血清学亚型的决定基因位于Ｓ基因区,该基因...     

幽门螺杆菌hpaA基因RFLP研究

用限制性片段长度多态性(RFLP)的方法评价幽门螺杆菌不同菌株鞭毛粘附素基因(hpaA)的变异性。PCR扩增9株幽门螺杆菌710bp的hpaA基因,用Hha Ⅰ、HaeⅢ限制性内切酶对该基因片段进行酶切分析。hpaA基因HaeⅢ单酶切可见4种带型,HhaⅠ单酶切出现5种带型。从临床分离的H.pylori菌株hpaA RFLP互有差异,且不同于国际标准菌株;临床分离株感染动物后分离得到的动物适应株其hpaA基因也发生了变异。不同H.pylori菌株间hpaA基因表现出明显的多态性,为开展H.pylori的分子流行病学调查提供了一种有效的方法。     

黑麦染色体的显微分离与PCR扩增

利用改良的染色体显微分离技术,分离了黑麦（ＳｅｃａｌｅｃｅｒｅａｌｅＬ．）一个完整细胞的１８条染色体（１４Ａ＋４Ｂ）,用人工合成的寡核苷酸为引物,进行单一引物法（ｓｉｎｇｌｅｕｎｉｑｕｅｐｒｉｍｅｒＰＣＲ,ＳＵＰＰＣＲ）扩增,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证明,ＰＣＲ扩增产物与黑麦基因组ＤＮＡ同源。     

黄海沉积物柱状样中有孔虫古DNA的提取和PCR扩增的方法学初探

海洋沉积物柱状样有孔虫古DNA是近年来国际新兴的研究技术,对于解释海洋全球变化可以获取到传统形态学检获不到的遗传信息,并对其进行比较和补充。目前国际上有孔虫古DNA的研究主要开展于深海和极地等有利于DNA保存的环境,但对于近海陆架海域尚无相关有效的技术研究。为了探索适合提取和扩增陆架浅海环境沉积物柱状样中的有孔虫古DNA的方法,本实验以采自山东半岛附近的黄海沉积物柱状样为研究对象,通过改进DNA提取过程的涡旋震荡时间和洗脱液体积、比较不同的PCR扩增条件和引物对,对陆架浅海地区沉积物柱状样中有孔虫古DNA提取和PCR扩增的方法进行了探索。借助ImageJ软件对PCR产物的凝胶电泳图像进行了定量分析与比较。研究结果显示,延长涡旋震荡时间和减少洗脱液体积可以提高对海洋沉积物环境总古DNA的提取效能,使用引物对s14F0和s15以及优化后的PCR条件能成功扩增陆架浅海环境沉积物中的有孔虫古DNA。本文探索了适用于陆架浅海环境沉积物柱状样的有孔虫古DNA的研究技术,可为古海洋和古环境研究提供新的研究思路。     

山羊品种间线粒体DNA限制性片段长度多态性研究

本试验利用ＡｐａⅠ、ＢａｍＨⅠ、ＢｃｌⅠ、ＢｇｌⅠ、ＢｇｌⅡ、ＣｌａⅠ、ＥｃｏＲⅠ、ＥｃｏＲⅤ、ＨａｅⅡ、ＨｉｎｄⅢ、ＫｐｎⅠＰｓｔⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳａｃⅠ、ＳａｌⅠ、ＳｍａⅠ和ＸｈｏⅠ计１８种限制性内切酶,研究了来自欧洲,非洲及国内的５个山羊品种共计３３只个体的ｍｔＤＮＡ,共检测了２７处限制性态型,可归结为８种单倍型。结果表明,国内２个百品种的基本单倍型为ＢａｍＨⅠ－Ａ,ＢｃｌⅠ－Ｂ、ＣｌａⅠ－Ａ     

Binding of lactoferrin and free secretory component to enterotoxigenic Escherichia coli

To compare the genomic variation of Helicobacter pylori in samples obtained from patients with perforated peptic ulcer, living in the same area of Estonia but belonging to different nationalities, 50 non-consecutive patients (32 Estonians and 18 Russians) admitted in the Tartu University Hospital in 1997-1999 were studied. Gastric samples of antral mucosa were obtained during operation and analysed histologically and with PCR for detection of different genotypes of H. pylori (cagA and vacA s and m subtypes). Among the 50 perforated peptic ulcer patients with histologically proven H. pylori colonisation no sample of gastric mucosa showed the s1b subtype of the vacA gene. The perforated peptic ulcer patients were mainly infected with cagA (82%) and s1 (98%) genotypes of H. pylori. The distribution of s1a/m1, s1a/m2 and s2/m2 subtypes of vacA genes was statistically different in Estonian and Russian patients (P<0.05). In conclusion differences in the distribution of vacA s and m subtypes of H. pylori were revealed between Estonian and Russian patients with perforated peptic ulcer from Southern Estonia.