毕赤酵母表达体系中重组蛋白的分离纯化

随着基因重组技术的快速发展,基因工程产品的利用越来越广泛,但其分离纯化的成本约占总成本的60%～70%.因此,探索一些简单有效的分离纯化方法尤为必要.简单介绍了目前较为流行的毕赤酵母表达体系,着重概述了重组蛋白分离纯化技术方法的应用情况.     

vMIP-II-TfN融合蛋白在毕赤酵母中的表达和纯化

目的:构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,表达纯化vMIP-II-TfN融合蛋白。方法:利用PCR方法扩增编码人转铁蛋白N端半分子的基因片段,通过酶切、连接、转化等分子克隆方法构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体;电击法转化X33酵母菌;用甲醇诱导重组酵母菌表达融合蛋白,利用硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA层析等技术进行蛋白纯化,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达和纯化情况,利用趋化实验进行纯化蛋白活性检测。结果:经过两次PCR扩增了一个长约1.1kb的包含Xba I酶切位点的IgG3-TfN基因片段,插入pPIC-vMIP-II的Xba I酶切位点,经菌液PCR鉴定获得重组子,测序结果表明构建载体pPIC-vMIP-II-TfN的表达框正确无误,转化X33酵母菌,用甲醇诱导表达出48kDa的vMIP-II-TfN融合蛋白,经硫酸铵沉淀、透析、Ni-NTA纯化后得到纯度约为95%的vMIP-II-TfN融合蛋白。Western印迹结果表明融合蛋白能与转铁蛋白抗体特异性结合。活性检测表明经过诱导表达的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。结论:成功构建pPIC-vMIP-II-TfN酵母表达载体,重组酵母工程菌经甲醇诱导成功表达出vMIP-II-TfN融合蛋白,纯化后的vMIP-II-TfN融合蛋白具有趋化抑制活性。     

毕赤酵母表达的重组乙肝表面抗原SS1的纯化及性质鉴定

对毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达的重组乙肝表面抗原ＳＳ１的纯化以及蛋白质的理化性质及免疫原性进行了进一步的研究。采用单抗亲和层析的方法,一步纯化即可得到纯度为９５％的纯化蛋白质。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹鉴定表明,纯化的ＳＳ１融合蛋白同时具有良好的Ｓ和ＰｒｃＳ１抗原性。ＣｓＣ１密度梯度离心和电镜检测的结果则表明,这一重组抗原可以形成与ＨＢＶ亚病毒颗粒类似的颗粒结构。在ＢＡＬＢ／     

毕赤酵母工程菌表达乙肝表面抗原结合蛋白(SBP)的发酵纯化工艺研究

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是以HBsAg为探针,通过人肝cDNA噬菌体表达库筛选的一种人源蛋白。SBP可特异性结合乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen, HBsAg),增强乙肝疫苗的免疫效果,是一种潜在快速高效的免疫佐剂。成功构建了分泌型高表达SBP的毕赤酵母工程菌。对该菌株进行了放大规模发酵表达,并对纯化工艺进行了研究。在发酵实时检测过程中,自诱导剂甲醇加入开始,SBP蛋白的分泌表达量随时间推移而逐渐增加,发现于38h达到最佳水平且此时杂蛋白含量最少,是放罐收集菌液的最佳时间。18L发酵液在低温离心除菌体和沉淀物后可得到15L的上清液,再利用截留量为5kDa的超滤膜包将上清液浓缩至2L,将浓缩后的上清液依次通过S200分子筛柱和TDEAE阴离子交换柱进行分离纯化,可得到300ml浓度为1.125mg/ml、纯度达98%的目标蛋白液,发酵液得率为22.5mg/L;最后将蛋白液定量分装冻干低温保存。所获得的放大规模SBP发酵诱导表达条件和SBP蛋白的分离纯化工艺,为SBP蛋白大规模生产奠定了坚实的基础。     

视黄醇结合蛋白的分离纯化

在变性条件下,应用Sephacryl-100凝胶过滤和Source-30Q阴离子交换两步分离,实现了分离纯化性质不稳定、易于降解的视黄醇结合蛋白(RBP)之目的。最后经过分步缓慢复性,获得具有生物活性的RBP,为其单克隆抗体制备及最终应用于临床营养评价和相关疾病的诊断创造了条件。     

金属硫蛋白融合蛋白的分离纯化

采用IPTG诱导新1#菌BL21（DE3）（pET21a-MT)高效表达Balb/C小鼠金属硫蛋白融合蛋白,并采用包涵体分离纯化方法及Sephadex G-75柱层析得到SDS－PAGE电泳为一条带的金属硫蛋白融合蛋白收集液。     

基于密码子优化的蛋白酶K在毕赤酵母中的表达及分离纯化

【目的】提高蛋白酶K在毕赤酵母中的表达产量,建立分离纯化方法。【方法】首先对蛋白酶K密码子进行优化,将其导入毕赤酵母GS115中实现分泌表达。然后对甲醇浓度、发酵温度和p H等表达条件进行优化,再对硫酸铵沉淀、亲和层析等纯化工艺进行比对分析。【结果】蛋白酶K密码子优化后实现了在毕赤酵母中的高效表达。在甲醇量0.75%、温度25°C和p H 7.0条件下进行发酵罐培养,蛋白酶K表达量达到2.2 g/L。采用Ni-NTA亲和柱对发酵液进行纯化可以得到较好的纯化效果。【结论】密码子优化后的蛋白酶K在毕赤酵母中高效表达并可以利用Ni-NTA亲和柱进行有效分离纯化。     

异常汉逊酵母BD102金属硫蛋白的分离纯化和鉴定

从异常汉逊酵母中分离出拮抗Cu²⁺、Cd²⁺等重金属、并经铜、镉诱导产生金属硫蛋白的异常汉逊酵母 (Hansenulaanomala)BD1 0 2。无细胞抽提液经SephadexG 50、DEAESepharoseCL 6B、SephadexG 2 5三次凝胶及阴离子交换柱层析分离纯化 ,Cu²⁺诱导得到Cu MTs两个亚型 ,Cd²⁺诱导得到Cd MT一个亚型。Mr分别约为 7kD和 7 5kD ,由 60和 61个氨基酸组成 ,其中半胱氨酸含量各为 6.8%和 1.0 %。每分子金属硫蛋白 (Cu MTs或Cd MT)可结合 4个铜或镉原子     

皮蝇素C蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化

利用PCR技术从重组质粒pGEM-T/HC中扩增HCcDNA片段,克隆到pPIC9k毕赤酵母表达载体中,获得重组质粒pPIC9k-HC,重组质粒线性化后电激转化入毕赤酵母GS115菌株中,重组子经G418筛选、PCR鉴定得到含外源基因的重组子,然后在含0.5%甲醇的培养基中诱导产生目的蛋白,经SDS-PAGE检测发现表达蛋白质的相对分子量约为28kD,表达量约为121mg/L,表达上清经超滤浓缩和阴离子交换层析初步纯化,所得纯化产物经Western-blot表明具有与兔抗HC血清特异性结合的能力;明胶电泳检测显示具有水解酶活性,为今后进行大规模的牛皮蝇蛆病的调查提供了一种生产大量廉价抗原的方法。     

乙型肝炎病毒PreS2蛋白研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)外膜蛋白包括S蛋白、PreS1蛋白和PreS2蛋白,它们是HBV包膜的主要成分,可诱导机体产生相应的抗体。PreS2蛋白在HBV侵入肝细胞的过程中起着非常重要的作用,对于防治HBV的感染有重要意义。我们简要综述了有关PreS2蛋白的研究,介绍了PreS2蛋白的各项功能。     

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。     

HBV PreS2-MBP融合蛋白在大肠杆菌不同部位的表达

目的:分析比较HBV PreS2蛋白在大肠杆菌细胞周质和细胞质中的融合表达情况。方法:构建大肠杆菌细胞周质中融合表达HBV PreS2蛋白的载体pMAL-P2x/S2和细胞质中融合表达载体pMAL-C2x/S2,IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western Blot检测,分析HBV PreS2-MBP融合蛋白在菌体不同部位的表达情况及表达产物的存在形式。结果:细胞周质中表达的融合蛋白有一部分被降解了,而细胞质中表达出了完整的融合蛋白。细胞质中表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。结论:HBV PreS2-MBP融合蛋白适合在大肠杆菌细胞质中表达。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

重组低出血抗凝蛋白在毕赤酵母中的中试发酵工艺研究及其纯化与鉴定

目的:通过对毕赤酵母中试发酵工艺的改进,建立一种简便可行的重组低出血抗凝蛋白(EH)的中试发酵工艺,为EH蛋白的放大生产研究奠定基础。方法:首先通过摇瓶培养绘测毕赤酵母工程菌的生长曲线,然后根据生长曲线,将对数生长期的菌种经过两级摇瓶培养放大后,直接接种到500 L的发酵罐中放大培养,通过发酵液的D600nm值、溶氧值(DO2)及菌体湿重动态监测细菌的生长状态,并用流加甲醇的方法诱导表达目的蛋白;表达上清经超滤、两步离子交换层析纯化获得目的蛋白;用非还原型SDS-PAGE和HPLC检测目的蛋白的纯度;用SDS-PAGE和质谱方法分析目的蛋白的相对分子质量;用Western印迹验证目的蛋白;用凝块法检测目的蛋白的抗凝活性。结果:发酵结束时,上清中蛋白含量达1.41 g/L,经后期分离纯化,得到约21 g EH蛋白,SDS-PAGE分析可见EH蛋白在还原状态下表观相对分子质量约为13.2×103±0.2×103,质谱分析相对分子质量约为7.3×103±0.73×103;Western印迹表明检测条带为目的蛋白,能被抗水蛭素抗体特异性结合;非还原型SDS-PAGE和HPLC测得EH蛋白的纯度均高于95%;凝块法检测EH蛋白的抗凝比活性为512~1024 ATU/mg。结论:建立了一条简便可行的EH蛋白的中试放大发酵生产工艺。     

外源基因在毕赤酵母中表达的优化

巴斯德毕赤酵母是近年来成功的外源基因表达系统,已表达出众多外源蛋白。它既能像原核生物一样快速生长高密度发酵,又能进行真核翻译后修饰,并且蛋白分泌量大,因此应用越来越广泛。如果对它的表达载体,转化诱导条件和目的基因内部结构,发酵条件等方面进行优化,能够进一步发挥它的优势,更好地表达需要的外源蛋白。本文就毕赤酵母表达系统表达优化进行总结综述。     

应用蛋白组学方法筛选和鉴定乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白

前S1蛋白（PreS1）在乙型肝炎病毒与宿主的相互作用中起至关重要的作用．为筛选乙型肝炎病毒PreS1结合蛋白,进一步探讨其在病毒感染过程中的作用,原核表达、纯化了PreS1-谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GST）融合蛋白,利用此蛋白与HepG2细胞裂解液进行Pull-down实验,其产物进行双向凝胶电泳分离. 结果发现2个PreS1特异结合蛋白,经质谱鉴定为分子伴侣蛋白——葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和葡萄糖调节蛋白75(GRP75)．通过免疫共沉淀和Western印迹分析证实,PreS1与GRP75之间存在相互作用．实验结果表明,GRP75为新发现乙型肝炎病毒PreS1特异结合蛋白,其与PreS1结合后的生理功能以及在HBV感染过程中的作用值得深入研究．     

重组人骨保护素片段OPG179与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达

目的:在毕赤酵母中融合表达人骨保护素(OPG)片段OPG179与人血清白蛋白(HSA).方法:通过RT-PCR扩增获得OPG179基因,构建表达质粒pHILD2-rhOPG179-HSA,转化至毕赤酵母菌中进行表达、纯化,对分泌表达产物进行SDS-PAGE及Western印迹检测.结果:酶切鉴定与测序结果显示重组表达质...     

乙型肝炎病毒包膜M蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

转化了乙肝病毒 preS2 S基因的重组巴斯德毕赤酵母菌株经甘油培养基充分增殖 ,然后转移到甲醇培养基中进行诱导表达。破碎细胞并提取胞内蛋白 ,经ELISA和WesternBlot检测 ,证明有 4株GS1 1 5 /HIS MUT 表达了HBVM蛋白。     

一种乙肝表面抗原结合蛋白可作为疫苗佐剂

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein, SBP)是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白,该蛋白已经被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用.目前,我们已经利用毕赤酵母表达系统获得了能够分泌表达SBP的毕赤酵母表达菌株.本研究通过对上述菌株的发酵产物进行超滤和亲和层析纯化,获得了一定量的高纯度重组SBP蛋白,并利用酶联免疫吸附检测(ELISA)法和表面等离子体共振(SPF)法分别对重组SBP进行了体内外生物学活性的初步检测,证实其具有与HBsAg结合的能力,并求得了二者之间的亲和常数.将重组SBP作为乙肝疫苗增效剂与乙肝疫苗共同免疫小鼠,SBP增效组小鼠与对照组相比,血清中HBsAg抗体显著升高,表明SBP在体液免疫方面对乙肝疫苗具有显著的增效作用.上述结果表明,SBP有望作为乙肝疫苗的免疫佐剂,在乙型肝炎防治方面有重要意义.