ATM、ATR和DNA损伤介导的细胞周期阻滞

ATM和ATR属于PIKK家族,是DNA损伤检查点的主要成员。它们被不同类型的DNA损伤所激活,通过磷酸化相应的下游蛋白Chk1和Chk2等,调节细胞周期各个检查点,引起细胞周期阻滞,使DNA损伤得以修复。ATM和ATR在维持基因组的稳定性中起到至关重要的作用。本文着重综述有关ATM和ATR在DNA损伤介导的细胞周期阻滞中发挥的作用以及相互关系的最新研究进展。     

ATM介导的蛋白磷酸化与DNA损伤的信号转导机制

细胞周期检定点激酶ATM蛋白属于磷酸肌醇3激酶（PI－3K）家族成员,也是哺乳动物细胞BASC高分子蛋白复合物的组成之一。ATM调整由于DNA损伤引发的DNA修复和凋亡通路,该通路主要表现为DNA损伤激活ATM激酶,ATM激酶磷酸化其下游的相应蛋白,使细胞在细胞周期关卡处停滞分裂,主要是G1－S期和G2－M期的阻滞,使损伤的DNA得以修复,当修复失败时,细胞进入凋亡进程。ATM磷酸化的蛋白质很多,如p53,cdc25A,cdc25C等,这些蛋白质对细胞周期关卡调控都非常重要,因此也就证明了ATM在细胞周期调控中的重要作用。     

CDK1 siRNA干扰在Taxol诱导细胞凋亡中的作用

目的研究转染细胞周期依赖性蛋白激酶1（cyclin．dependent kinase1,CDK1）siRNA、以及转染后进行凋亡刺激对细胞周期和凋亡的影响,探讨CDK1在细胞凋亡中的确切作用,揭示细胞周期与细胞凋亡协调的分子机制。方法以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,脂质体转染CDK1siRNA,转染后48h加紫杉醇（Tax01）（20μg／m1）刺激凋亡,Western印迹检测CDK1和抗凋亡蛋白BCL2表达,AnnexinV／PI法检测细胞的凋亡,流式细胞仪分析DNA含量检测细胞周期。结果转染CDK1 siRNA后,CDK1蛋白的表达下降,细胞周期G2／M期比例增加,细胞凋亡率与对照相比没有明显升高。只加Taxol刺激12h后细胞凋亡率增加并伴有S期和G2／M期比例增加。转染CDKlsiRNA后再用Taxol刺激,其细胞凋亡率没有明显改变,G2／M期阻滞效应也没有叠加。BCL2蛋白只在加Taxol刺激组表达下降,与CDK1表达减少没有相关性。结论siRNA沉默导致的CDK1表达降低只导致细胞周期G2／M期阻滞,没有引起细胞凋亡;CDK1的表达降低对紫杉醇所诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡效应没有明显影响。     

曲古霉素A诱导人膀胱癌细胞周期阻滞和凋亡的研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)对人膀胱癌T24细胞周期和凋亡的影响。方法:以不同剂量TSA(0.1μM,0.3μM和1μM)处理T24细胞。采用MTT法检测细胞存活率,AnnexinV-PI染色检测细胞凋亡,流式细胞仪检测caspase-3活性,Western blot法检测P21蛋白表达。结果:TSA剂量依赖性降低膀胱癌细胞存活率,促进细胞凋亡,表现为AnnexinV阳性细胞明显增多,同时活化的caspase-3水平增高。TSA还可通过诱导膀胱癌细胞周期阻滞于G2/M期抑制细胞生长,且呈剂量依赖性。结论:TSA通过促进caspase-3激活诱导膀胱癌细胞凋亡,同时诱导细胞阻滞于G2/M期。     

羊栖菜多糖诱导HL-60细胞凋亡的研究

用MTT法观察羊栖莱多糖(SFPS)在体外抗人白血病HL-60细胞增殖作用;扫描电镜、透射电镜、DNA电泳和流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡。结果表明SFPS对HL-60细胞具有显著生长抑制作用,并呈量效和时效关系,药物作用24,36,48,72h的IC50分别为390,362,402,421mg／L;药物浓度为300mg／L和500mg／L作用HL-60细胞后,琼脂糖凝胶电泳显示有凋亡细胞特有的DNA梯状条带,细胞微绒毛减少、染色质固缩、边集,凋亡小体形成;DNA直方图出现亚G1峰。在一定浓度范围内,SFPS诱导细胞凋亡的作用呈现浓度和时间依赖性,同时G2／M期细胞比例增多。因此,SFPS抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡和G2／M期细胞阻滞有关。     

纳米银抑制肝癌HepG2细胞活力

目的探讨纳米银(AgNPs)对体外培养的人肝癌细胞株HepG2增殖和凋亡的影响。方法用不同浓度的AgNPs处理肝癌HepG2细胞,采用细胞形态学观察及细胞活力测定(MTT法)来评价AgNPs对HepG2细胞体外增殖的影响,流式细胞仪分析细胞周期分布并检测细胞凋亡率。结果 AgNPs使细胞增殖活性降低,且呈浓度和时间依赖性,细胞呈凋亡形态改变;流式细胞仪检测到细胞凋亡,细胞平均凋亡率呈时间依赖性。AgNPs处理组S期细胞逐渐增多,而G0/G1、G2/M期细胞逐渐减少。结论 AgNPs抑制HepG2细胞生长,使HepG2细胞阻滞于S期,并诱导其凋亡。     

褪黑素抑制人骨肉瘤U2细胞增殖及其机制

目的研究褪黑素对体外培养人骨肉瘤U2细胞增殖的影响,并对其可能机制进行研究。方法体外培养U2细胞,用不同浓度褪黑素加以干预,以CCK-8法检测褪黑素对U2细胞增殖的影响;对细胞进行Hoechst 33258染色,荧光显微镜下观察褪黑素对U2细胞凋亡的影响;以流式细胞术检测褪黑素对细胞凋亡及细胞周期的影响;通过实时荧光定量PCR及免疫印迹法检测U2细胞Fas基因表达情况。结果 1 CCK8法检测显示褪黑素对U2细胞增殖有抑制作用,作用时间越长,浓度越高,抑制作用越明显;2 Hoechst33258染色可见凋亡小体;3流式细胞检测显示褪黑素作用后早期凋亡的U2细胞增加,并使细胞周期阻滞在G2/M期;4实时荧光定量PCR及免疫印迹法显示褪黑素处理后U2细胞上调Fas蛋白表达。结论褪黑素对U2细胞的增殖有抑制作用,可诱导细胞发生凋亡,其机制可能与将细胞复制周期阻滞在G2/M期及上调Fas蛋白表达量有关。     

澳洲茄边碱通过Caspase3蛋白诱导人肺腺癌A549细胞的凋亡作用

运用中药龙葵提取物澳洲茄边碱处理人肺腺癌A549细胞,研究其对A549细胞的抑制及凋亡作用,探讨澳洲茄边碱对肺腺癌的作用机制。通过细胞增殖抑制实验检测不同浓度澳洲茄边碱对A549细胞增殖的影响,采用蛋白印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白Caspase3的表达水平,采用流式细胞术测定处理后A549细胞的凋亡水平及细胞周期变化。结果显示,不同浓度澳洲茄边碱均能抑制A549的增殖,呈浓度效应;用不同浓度澳洲茄边碱处理A549细胞24h后,Western blot结果显示,随药物浓度增大,凋亡蛋白Caspase3水解程度增高,对A549凋亡作用明显增强;流式细胞术检测细胞凋亡的结果显示,20μmol·L-1澳洲茄边碱处理A549细胞后,细胞发生明显凋亡,其中早期凋亡细胞比例为25.35%,晚期凋亡细胞比例为11.47%;流式细胞术检测细胞周期的结果显示,20μmol·L-1澳洲茄边碱处理A549细胞后,细胞周期阻滞于G2/M期。本研究结果表明,澳洲茄边碱通过激活细胞凋亡通路中的Caspase3蛋白触发细胞凋亡,同时将A549细胞阻滞在细胞周期的G2/M期,抑制人肺腺癌细胞A549的生长。     

连香树精油对人肝癌SMMC-7721细胞抗肿瘤机制的研究

为探讨连香树精油的体外抗肿瘤活性。以人肝癌SMMC-7721细胞为受试细胞株,利用MTT法、流式细胞术、JC-1法和Western blot法评价连香树精油的体外抗肿瘤活性。结果表明:连香树精油处理24 h后可降低SMMC-7721细胞存活率;细胞中G0/G1期的比例下降,G2/M期的比例升高;细胞线粒体膜电位降低;自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1表达上升,加入自噬抑制剂氯喹后LC3-Ⅱ蛋白与Bcl-2抗凋亡蛋白表达下降。综上说明连香树精油能抑制SMMC-7721细胞的增殖活性,通过阻滞G2/M期抑制细胞分裂,通过降低线粒体膜电位诱导SMMC-7721细胞凋亡,而自噬在SMMC-7721细胞凋亡过程中作为一种保护机制而存在。     

Gö6976转变8-氯-腺苷引起的G2/M期阻滞为S期阻滞并促进K562细胞凋亡

8-氯-腺苷可抑制多种人类肿瘤细胞生长．8-氯-腺苷可引起细胞有丝分裂异常、G2/M 期阻滞和晚期凋亡．为探索增强8-氯-腺苷的抗肿瘤作用,本研究以人慢性髓性白血病细胞株K562为靶细胞,联合使用Chk1抑制剂Gö6976与8-氯-腺苷,观察Gö6976处理后肿瘤细胞对8-氯-腺苷的增敏效果,探索其作用机制．流式细胞分析发现,Gö6976 可消除8-氯-腺苷引起的K562细胞G₂/M期阻滞,使转换为S期阻滞．蛋白质印迹及免疫共沉淀实验显示,Gö6976可灭活Chk1,激活Chk2,使Chk1-Cdc25C-CDK1级联反应转换为Chk2-Cdc25A-CDK2级联反应,从而引起细胞周期阻滞发生改变．蛋白质印迹实验证明,Gö6976 可明显增强8-氯-腺苷作用引起的凋亡相关分子procasepase-3和PARP的激活;流式细胞分析显示,Gö6976促进8-氯-腺苷引起的细胞凋亡．研究结果提示,Gö6976增强了靶细胞对8-氯-腺苷的敏感性,通过转换8-氯-腺苷引起的G₂/M期阻滞为S期阻滞,促进细胞凋亡．     

八氯腺苷诱导SH-SY5Y和SK-N-SH细胞G2/M期阻滞的分子机制不同

为探索八氯腺苷的抗肿瘤作用机制,以神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-SH细胞为对象,采用四唑盐比色实验（MTT法）证明,八氯腺苷具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,这种抑制作用呈剂量-时间依赖性.流式细胞分析显示,10 μmol/L八氯腺苷作用48 h后可导致靶细胞生长停滞于G ^₂/M期;SH-SY5Y细胞发生明显细胞凋亡,但SK-N-SH细胞却未见凋亡.Hoechst 33342染色显示,SK-N-SH细胞发生了核分裂异常.蛋白质免疫印迹分析证明,10 μmol/L 八氯腺苷处理SH SY5Y 48～72 h后,G^₂检验点调节蛋白ATM、Chk1、Cdc25C和Cdc2磷酸化形式明显上调,同时伴有caspase-3的激活,提示SH-SY5Y细胞发生了G^₂检验点通路和细胞凋亡途径的激活.与SH-SY5Y细胞不同,在SK-N-SH细胞中,八氯腺苷处理24～96 h时,磷酸化ATM、磷酸化Chk1/Chk2、磷酸化Cdc25C以及磷酸化Cdc2的水平呈现逐渐降低的趋势.结果提示,SK-N-SH细胞在八氯腺苷处理后发生了G^₂检验点失败.蛋白质免疫印迹分析还显示,八氯腺苷可诱导p53在SH-SY5Y细胞的表达,但却不能影响SK—N-SH细胞的p53组成性表达水平.p21在SK-N-SH的组成性表达随八氯腺苷处理时间延长而逐渐减少,但在处理前后的SH-SY5Y细胞均未检测到p21蛋白的表达.上述实验结果提示,八氯腺苷抑制两种细胞增殖的机制不同：在SH-SY5Y细胞,八氯腺苷可激活ATM-Chk-Cdc25C-Cdc2/cyclin途径和凋亡通路,使细胞发生G_²/M期阻滞和细胞凋亡;在SK-N-SH细胞,八氯腺苷诱导G^₂检验点失败,导致细胞阻滞在有丝分裂期,并发生有丝分裂异常.2种不同的细胞命运可能还与p53和p21表达不同有关.     

具有PR／SET结构域的抑癌基因研究进展

含有PR／SET结构域的基因,在多种肿瘤中都可见其缺失,被认为是一个重要的抑癌基因家族,目前发现含有该结构域的基因具有抑癌基因作用,而缺失该结构域的基因具有癌基因的作用,即该基因家族有特殊的“阴阳”作用机制。此外含有PR／SET结构域的基因可以引起细胞G2／M期阻滞和细胞凋亡。在调节细胞生长、限制肿瘤发展方面发挥重要作用。     

共转染CDK1、CDK2siRNA对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响

目的研究共转染CDK1、CDK2siRNA同时抑制CDKI、CDK2蛋白表达对肿瘤细胞周期和细胞凋亡的影响,探讨细胞周期主要调控分子在肿瘤细胞凋亡中的作用。方法以人宫颈癌细胞株HeLa细胞为研究对象,用脂质体lipofectamine2000同时转染CDKl和CDK2siRNA。在转染后48、60h收集细胞,用Western印迹检测CDKl、CDK2蛋白的表达,AnnexinV／PI检测转染细胞的凋亡,流式细胞术DNA含量检测分析细胞周期。转染细胞进行瑞氏一姬姆萨染色（Wright—Giemsa）后在显微镜下观察其形态变化i结果共转染CDKl、CDK2siRNA后48和60h,Western印迹结果显示CDKl和CDK2蛋白的表达都同时降低。共转染CDKl、CDK2siRNA后,细胞周期S期和G1／M期比例与对照相比有明显增加;共转染细胞经瑞氏一姬姆萨染色后在显微镜下可见双核或多核细胞增多;AnnexinV／PI检测结果显示共转染CDK1、CDK2siRNA的细胞在48和60h细胞凋亡率与对照相比有显著的升高。结论siRNA干扰导致的CDKI、CDK2表达同时降低不仅导致细胞周期s期和G1／M期的阻滞,也诱导了肿瘤细胞的凋亡。     

大豆低聚糖对人胃癌细胞株BGC-823细胞的细胞凋亡和细胞周期的影响

目的通过观察大豆低聚糖对胃癌癌细胞株BGC-823细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响,探索乳酸杆菌发酵滤液对胃癌细胞作用的可能机制。方法用光镜和流式细胞仪分析不同浓度大豆低聚糖对BGC-823细胞的凋亡诱导效果;用流式细胞仪分析不同浓度大豆低聚糖对BGC-823细胞细胞周期的影响。结果大豆低聚糖可以诱导BGC-823细胞的凋亡。形态学观察处理后的BGC-823细胞,可见细胞变形,细胞皱缩,体积变小,细胞间隙增大,细胞核固缩。流式细胞仪分析50 mg/ml和100 mg/ml大豆低聚糖作用48 h和72 h BGC-823细胞的凋亡比例,分别为6.76%和7.93%。50 mg/ml大豆低聚糖作用48 h,引起BGC-823细胞G1期阻滞,100 mg/ml大豆低聚糖作用48 h,引起BGC-823细胞出现S期阻滞。结论大豆低聚糖可诱导部分BGC-823细胞凋亡。大豆低聚糖对BGC-823细胞的生长抑制作用在低浓度时可能通过G1期阻滞实现,在高浓度时可能通过S期阻滞实现。     

TBP-like Protein（TLP）通过G2／M期阻滞抑制HeLa细胞的增殖

TBP—likeprotein（TLP）是真核细胞中一种常见的转录因子,在调节生长发育方面起着重要的作用。该实验构建重组质粒pEGFP—N1．TLP,研究TLP对人宫颈癌细胞HeLa增殖的影响。利用流式细胞仪检测质粒的转染效率,通过激光共聚焦显微镜观察外源TLP蛋白的亚细胞定位。经过MTT检测、RNAi—TLP诱导的基因沉默7LHoechst33258染色研究TLP对HeLa细胞的增殖抑制作用。流式细胞术、Westernblot和RT-PCR实验结果表明,TLP将HeLa细胞周期阻滞于G2／M期,并抑制周期相关基因CDKl和CyclinBl的转录和翻译。研究表明,外源TLP在HeLa细胞的细胞核中表达,通过降低细胞周期相关基因CDKl和CDKl的表达水平,将HeLa细胞的细胞周期阻滞于G2／M期,从而抑制细胞的增殖。     

二烯丙基二硫化合物对食管癌Eca109细胞抑制作用

[目的]探究二烯丙基二硫化合物(DADS)对人食管癌细胞Eca109生长活性、增殖抑制及细胞周期的影响。[方法]以不同浓度的DADS处理Eca109细胞,MTT法检测细胞的生长曲线和增殖抑制率;流式细胞仪(FCM)测定细胞周期阻滞情况。Hoechst33258染色法并在荧光显微镜下观察细胞形态变化。[结果]DADS呈时间和剂量依赖性抑制Eca109细胞生长,272μmo L/L DADS作用Eca109细胞72 h,细胞增殖抑制率达到64.3%,IC50为100μmo L/L;荧光显微镜及流式细胞术结果显示DADS促使Eca109细胞形态发现显著变化,且出现凋亡小体,同时呈剂量依赖性阻滞细胞周期进程于G2/M期。[结论]大蒜DADS抗肿瘤的机制可能是通过细胞增殖抑制促使细胞发生形态变化,并将细胞周期阻滞在G2/M期,最终导致肿瘤细胞发生凋亡。     

丙戊酸钠抑制A549细胞生长

目的研究丙戊酸钠对肺癌A549细胞增殖和细胞周期的影响。方法MTT检测生长抑制,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,Western blot检测p21WAF1/CIP1蛋白表达。结果丙戊酸钠以剂量依赖性方式抑制A549细胞生长;丙戊酸钠上调G0/G1期比例,下调S期和G2/M期,不影响细胞凋亡;丙戊酸钠上调p21WAF1/CIP1蛋白表达。结论丙戊酸钠上调p21WAF1/CIP1表达,使细胞阻滞于G0/G1期,抑制A549细胞生长。     

片仔癀对人卵巢癌OVCAR-3细胞增殖、凋亡及周期的影响

目的：研究片仔癀对人卵巢癌细胞株OVCAR-3增殖抑制作用,及其对细胞周期、细胞凋亡的影响。方法：采用MTT法观察片仔癀对人卵巢癌细胞株OVCAR-3细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,westem—blot检测相关蛋白的表达。结果：片仔癀以剂量依赖式抑制人卵巢癌细胞株OVCAR-3细胞增殖,片仔癀250、500、1000μg·mL-1作用于OVCAR-3细胞24h后,其早期凋亡率分别为6．6％、30．9％、43．2％,而对照组为0％,其诱导凋亡作用呈现剂量依赖性;细胞积聚在G0／G1期,同时S期细胞比例减少;Akt、PARP、CDK6表达下调。结论：片仔癀可以抑制OVCAR-3细胞增殖及诱导细胞凋亡作用,并能阻滞细胞于G0／G1期,有望成为卵巢癌治疗药。     

E1/E3缺失型腺病毒载体引起细胞周期G_2/M阻滞

腺病毒载体广泛应用于基因治疗和转基因研究 ,目前常用的E1 E3缺失型复制缺陷腺病毒载体虽然失去了病毒复制必需的E1基因 ,但载体上的其它病毒基因仍能在宿主细胞内表达 .为研究这些基因对细胞的毒性作用 ,选择了 3种携带没有明显细胞毒性外源基因的腺病毒载体 ,观察感染 2种肿瘤细胞后细胞核形态改变 ,并用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况 .发现大剂量重组缺陷型腺病毒感染细胞后引起细胞变圆 ,核增大 ,细胞周期阻滞于G2 M期 ,继而染色质凝聚 ,细胞发生坏死或凋亡 ;各种腺病毒载体造成G2 M阻滞所需感染量不同 ,但都随时间延长和感染量增加而加重 .这些结果提示腺病毒基因对细胞的影响是多方面的 ,在以此类病毒载体进行基因转移和基因治疗的研究中 ,精确滴定病毒滴度和转导效率非常重要 ,腺病毒基因表达造成的毒副作用给此类研究增加了变数     

新型鬼臼毒素衍生物诱导人肺腺癌A549细胞凋亡及其机制研究

目的探讨新型鬼臼毒素衍生物10Ⅲg诱导人肺腺癌细胞A549细胞凋亡及其调控机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTr）比色法、流式细胞术测定细胞周期细胞凋亡率,DNA琼脂糖凝胶电泳和微管蛋白组化染色,Western印迹法检测凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达。结果新型鬼臼毒素衍生物10m。对A549细胞增殖具有明显的剂量和时间依赖性抑制作用,细胞周期分析显示S期细胞数明显增多,出现G2／M期阻滞;10Ⅲg作用48h后DNA电泳可见明显的梯状条带;10Ⅲg能破坏A549细胞的细胞骨架,与依托泊苷相比有明显促进微管解聚现象;10Ⅲg浓度为10^-6mol/L时能显著促进Bax、Caspase-3蛋白的表达。结论新型鬼臼毒素衍生物10Ⅲg通过诱导A549细胞发生G2／M期阻滞而抑制其增殖,其机制可能与抑制细胞微管解聚及诱导细胞凋亡有关。