一株木霉产生菊粉酶的研究

从土壤中分离到一株木霉(Trichoderma sp.)Fx-1,能产生较高活性的菊粉酶(Inulinase)。该酶能被菊粉(Inulin)诱导,而不被蔗糖、棉子糖、纤维素、葡萄糖或果糖诱导,在适宜的培养条件下,酶活性可达64u/ml。5%的菊粉在pH5,0、温度50℃条件下,12小时内几乎100%被该酶所水解。酶解总糖中,果糖占92.3%,葡萄糖占5.8%。酶在60℃下保温10分钟,其活性不变。     

马克斯克鲁维酵母菌菊粉酶的异源表达及低聚果糖制备工艺优化

【目的】低聚果糖是新型的食品和保健品原料,具有广阔的市场需求。以菊粉酶水解菊粉制备低聚果糖的酶法工艺是先进的绿色制造。本研究旨在获得高产的菊粉酶菌株及以菊粉为原料酶法制备低聚果糖的优化工艺。【方法】采用基因工程手段克隆马克斯克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxianus)的菊粉酶基因,实现其在毕赤酵母中的高效表达;测定菊粉酶在不同p H、温度、金属离子和底物浓度等条件下的酶活变化趋势,获得最佳的反应参数;通过高效液相色谱法检测水解产物,获得不同酶量水解产物各组分分布。【结果】菊粉酶工程菌株在10 L发酵罐中的产菊粉酶活达1 570 U/m L、蛋白质含量为2.75 g/L发酵液;菊粉酶最适反应参数为:在体积为1 L的反应体系中,p H 5.0、反应温度50°C、含0.2 mmol/L Mg2+以及菊粉浓度为8%。在该条件下,酶量为10 U时菊粉被完全水解。水解产物中单糖和二糖含量仅为9.25%,而低聚果糖(C3-C8)含量为90.75%,且C3-C5低聚果糖含量高达72.92%。【结论】克隆了K.marxianus菊粉酶基因并实现了高效表达,获得了水解菊粉制备低聚果糖的最佳工艺条件。为菊粉酶的大量生产及低聚果糖的酶法制备奠定了良好的基础。     

内切酶法制取菊苣低聚果糖工艺条件的研究

目的:利用毕赤嗜甲醇酵母表达的重组黑曲霉菊粉内切酶,从菊苣菊粉中制取低聚果糖。方法:用重组黑曲霉菊粉内切酶酶解水提菊粉,用薄层色谱、离子色谱分析酶解产物,研究酶解条件,分析产物组成。结果与结论:菊粉浓度为20～160g/L、酶浓度为12U/g菊粉时,低聚果糖的最大产率逐渐升高然后下降;在接近最大溶解度200g/L时,菊粉寡糖最大产率为62.0%,最大产率与酶的用量无关,但提高酶的浓度可以缩短达到最大产率的时间。pH5.5、50℃、菊粉浓度为40g/L、酶用量为12U/g菊粉时,可达到最大产率64.6%;酶解的产物主要为GF2到GF10的菊粉寡糖。     

青霉菊粉酶的产生和性质

由淀粉通过葡萄糖异构化生产高果糖糖浆,生产上受到原料的限制。果糖另一种来源是菊粉（Inulin）。菊粉是以β-2,1果糖苷键连接的一种多聚果糖,其末端含有一个蔗糖残基,它作为贮存性多糖大量存在于菊芋（Helianthus tuberosus）、菊巨(chicoryintybus)、大丽花（Dahlia pinnata）等多种植物中,至今尚未得到很好利用。菊粉可通过化学法或酶法水解生成果糖。利用菊粉酶     

腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究

分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的编码基因(treP), 该酶可催化以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分解反应. 反向mRNA点杂交实验表明, 腾冲嗜热杆菌中treP基因在高盐胁迫条件下表达量增加, 而在海藻糖诱导条件下表达量降低. 将该基因导入不含TreP的大肠杆菌中进行诱导表达, SDS-PAGE表明, 异源表达的TreP分子量约为90 kD, 与预期值相同. 通过葡萄糖氧化酶法测定分解产物葡萄糖的产率表明: TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70℃, 最适pH值为7.0; 通过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明: TreP催化合成反应的最适温度为70℃, 最适pH值为6.0. 在最适反应条件下, 50 μg的TreP粗酶可催化25 mmol/L α-1-磷酸葡萄糖与葡萄糖在30 min合成11.6 mmol/L海藻糖; 而同量的酶在同样时间内仅能将250 mmol/L海藻糖分解生成1.5 mmol/L葡萄糖. 以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催化海藻糖的合成反应. 热稳定性实验表明, 该酶性质比较稳定, 在50℃下温育7 h还能保持77%以上的活性, 是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶.     

外切菊粉酶的酶学研究进展

菊粉富含于菊芋、菊苣等多种菊科植物中,是一种来源丰富的可再生资源。菊粉是一种由D 呋喃果糖经β-2, 1-糖苷键连接,还原端经α-1, 2-糖苷键连接1个葡萄糖残基构成的果聚糖。菊粉能被菊粉酶水解,生产果糖、高果糖浆、菊粉寡糖,可通过微生物发酵生产燃料酒精等产品,在食品、生物能源、医疗保健等方面都有重要应用,受到广泛关注。介绍外切菊粉酶的分类、来源、结构和催化机理,重点总结近10年微生物来源外切菊粉酶的重组表达和酶学性质情况,简述外切菊粉酶在食品、能源等方面的应用,展望外切菊粉酶的研究热点及方向。     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag⁺、Hg2+和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋…     

降解菊粉担子菌的分离鉴定及其酶的产生

从菊芋地的腐木上分离到一株在以菊粉为唯一碳源和能源的培养基上生长良好,具有较高菊粉酶活性的担子菌菌株,经鉴定为采绒革盖菌（Ｃｏｒｉｏｌｕｓｖｅｒｓｉｏｌｏｒ）。该菌的菊粉酶大部分是胞外酶,此酶对菊粉的专一性高,其Ｉ／Ｓ比值在发酵过程中不断变化。菊粉酶活性平行地随菌体生长而增加。该酶的合成受菊粉诱导,受果糖抑制。当果糖浓度大于２．７ｍｇ／ｍｌ时,菊粉酶活性为零。菌体的匀质化可使生长加快从而获得大量菊粉酶。     

毛壳霉内切菊粉酶的纯化与性质

毛壳霉 (Chaetomiumsp .)C34发酵液经硫酸铵分级沉淀、DEAE 纤维素 11离子交换层析、Q SepharoseFastFlow离子交换层析、SephacrylS 2 0 0凝胶过滤、PhenolSepharoseTM HP疏水层析 ,得到电泳纯的内切菊粉酶组分 ,纯化倍数为 30 8倍 ,活力回收率为 7 7%。用SDS PAGE测得该酶亚基的分子量为 6 6kD。菊粉酶的最适pH为 6 0 ,最适温度为 5 0～ 5 5℃。菊粉酶在 5 0℃以下 ,pH5 0～ 8 0时较稳定。Cu2 完全抑制酶的活性 ,Mn2 、Zn2 、Fe2 、EDTA以及NBS(N bromosuccinimide ,N 溴代丁二酰亚胺 )对该酶有很强的抑制作用。该酶对菊粉有较强底物专一性 ,产物主要为低聚果糖 ,也可作用于蔗糖 ,I S值为 2 0。以菊粉为底物时 ,Km 为 0 199mmol L ,Vmax为 115 μmol (mg·min)。     

菊芋粕菊粉的酶法提取、组成及抗氧化活性研究

本研究拟应用酶法提取技术解决菊芋菊粉工业化生产中的废弃物——菊芋粕再利用程度低的问题,并评价菊芋粕菊粉的抗氧化活性功效。对菊芋粕菊粉的果胶酶酶法提取的最佳条件通过响应面法进行了优化,并对菊芋初次水提菊粉(primary water-extracted inulin,PWI)和二次酶提菊粉(secondary enzymatic-extracted inulin,SEI)的组成成分和抗氧化活性进行了比较分析。响应面法优化确定的菊芋粕菊粉最佳酶法提取条件为:pH4.5、提取温度50 ℃、酶底比7.5 U/g、提取时间2 h,该提取方法所得菊芋粕菊粉的得率为35.30%±0.85%,与传统热水浸提法相比菊粉得率提高38.16%。组成分析结果显示,SEI的总糖和菊粉含量均显著高于PWI( P <0.05)。在菊粉聚合度方面,PWI中蔗果三糖和蔗果四糖含量较高,而SEI中蔗果五糖、蔗果六糖及其以上聚合度菊粉的含量较高。此外,SEI的抗氧化活性优于PWI。因此,果胶酶辅助提取方法有望为菊芋粕菊粉的再利用难题提供新的解决思路。     

克鲁维酵母Y-85合成菊粉酶最适条件的研究

采用响应面方法（ResponseSurfaceMethod,RSM）对克鲁维酵母（Kluyveromycessp．）Y－85产菊粉酶培养基成份进行了优选,和正交试验相比,该法选出的最适培养基的酶发酵水平提高28％。用15L自控发酵罐进行产酶条件控制试验,并在1000L罐上进行5批次酶发酵中试,平均菊粉酶活性达68.9u／ml。     

高产菊粉酶酵母筛选、发酵和酶学性质研究

筛选到1株菊粉酶高产克鲁维酵母菌株,采用酵母高密度细胞发酵方法,最高菊粉酶产量达到288.78u/mL,比80～90年代国际上报道的克鲁维酵母菊粉酶最高产量高6.8倍。该酶的菊粉酶/转化酶活性比为1/24.72;菊糖m=13.3mmol/L,蔗糖Km=62.6mmol/L;最适反应pH值为4.4,但在pH3.8～5.6的范围内均保持了较高的活性,相当于最适pH值下活性的90%;最适反应温度为55℃,在50～575℃范围内能够保持较高活性,50℃下酶的半衰期约为16h;外加Mg2+提高酶活性11.28%。     

菊粉酶酶源菌株筛选及其基因克隆

筛选出一株产菊粉酶酶源菌株AF10,鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。PCR扩增AF10的内切菊粉酶基因inuA1并进行核苷酸序列分析。结果表明inuA1全长1551bp,没有内含子,所编码的氨基酸序列中,存在4个潜在的N糖基化位点,其中存在菊粉酶的保守序列WMNEPN。以pUC118为克隆载体,以E.coli JM109为受体菌株,获得菌粉酶基因克隆。     

一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究

从腐烂的菊芋及实验室保存的菌种中,选育到一株发酵菊芋产乙醇的菌株克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus Y1。利用正交实验法对克鲁维酵母产菊粉酶的培养基组成及培养条件进行优化,确定培养基组成（g/L）为：菊粉40,酵母粉4,蛋白胨4,尿素1;初始pH5．0,温度30℃,150r／min条件下培养达到最佳产酶效果（57U／mL）。该菌株所产菊粉酶的性质测定结果表明：以菊粉为底物,该菊粉酶最适反应温度为55℃,在60℃以下稳定性很好,高于60℃时酶迅速失活;最适pH为5．0,pH4．6—5．2范围内酶稳定性很好;该酶属于外切型菊粉酶,体积分数为8％的乙醇对酶活力基本没有影响。     

固定化克鲁维酵母Y-179外切菊粉酶的研究

鹰嘴豆孢克鲁维酵母(Kluveromyces cicerisporus Y-179)分泌的糖基化菊粉外切酶经高碘酸钠氧化其分子表面的糖链产生醛基,再共价结合于氨基型固定化载体ZH-HA上,固定化酶活力达到4 000 U/g湿载体。所制备的固定化酶在pH 3.5和70℃温度下表现出最大反应活性,该固定化酶pH稳定性和热稳定性较游离酶明显提高。固定化酶在分批式反应器中重复水解菊粉50批次,活力没有明显损失,表现出良好的工作稳定性。     

克鲁维酵母Y-85菊粉酶的纯化和性质

克鲁维酵母(Kluyveromyces sp.)Y-85产生的胞内菊粉酶(endocellular inulinase)和胞外菊粉酶(exocellular inulinase)粗酶液分别经PEG6000-磷酸盐缓冲液双水相抽提得部分纯化酶液。前者进一步用硫酸铵分级沉淀、Protein-PAK DEAE离子交换、Protein-PAK200SW凝胶过滤后得到两个菊粉酶组分EⅠ和EⅡ;后者采用DEAE-Sephacel离子交换、Sephadex G150凝胶过滤后得到菊粉酶Eexo。经Waters 650E蛋白纯化系统鉴定,三者均呈单一的对称峰;EⅠ和EⅡ达聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳纯。EⅠ、EⅡ和Eexo的分子量分别为42kD、65kD和57kD;三者均为糖蛋白,多糖含量分别为30％、35％和25％;I/S(Inulinaseactivity/Sucrase activity)比值分别为0.086、0.078和0.072;三者均属外切菊粉酶。EⅠ、EⅡ和Eexo酶反应最适pH分别为4.6、4.5和4.6,最适温度分别为52℃、52℃和55℃;Ag^+、Hg^(2+)和PCMB对酶活性有强烈的抑制作用;三者水解菊芋粉糖液的产物均为果糖(86.5％)和葡萄糖(13.5％)。     

菊粉羧甲基化修饰及其抗氧化活性研究

以菊粉为原料,采用溶媒法对菊粉进行羧甲基化修饰,研究了碱化时间、醚化时间、NaOH用量、溶剂体积分数四因素对羧甲基菊粉制备的影响,以取代度为指标,确定最佳修饰工艺条件。在该条件下,比较菊粉羧甲基修饰前后抗氧化活性的变化。结果表明,最佳工艺条件为碱化时间40 min、醚化时间70 min、m(菊粉)∶m(NaOH)∶m(氯乙酸)=27∶4∶13.8、异丙醇95%,取代度为0.682,当浓度为1mg/mL时,与修饰前菊粉相比,羧甲基菊粉清除羟自由基、DPPH、超氧阴离子自由基分别提高了12.6%、24.0%、13.9%。     

微生物菊粉酶的研究进展

菊粉酶（Inulinas．EC3.2.1.7）是B－2．1-D-果聚糖酶,可从果糖的非应原端逐个切下单个果糖（外切酶活性）,或在分子内部随机切断某个p－2.1糖着键（内切酶活性）［1］。菊粉酶主要来源于菊科植物和部分微生物,微生物菊粉酶主要来自霉菌、酵母菌和细菌。菊粉酶可水解天然果聚精一菊粉（Inulin）,利用菊粉酶一步水解菊粉制备高果糖浆具有工艺简单、原料价格低廉、转化率高、副产物少,不增加环境污染等优点,因而具有很大的开发应用潜力。菊粉是果糖的多聚物,富含于菊芋（He－lianthustuberosus）等多种菊科植物中,菊芋块茎主要成分…     

菊粉酶水解菊芋浸汁反应条件研究

利用产紫青霉（PenicillumP.)F-7产生的胞外菊粉酶对菊芋浸汁进行了水解试验,37℃水解10h,得到含低聚寡糖74.7%(占总糖含量）的水解液;同时进行了菊粉酶水解的各项条件试验,摸索出了最适水解条件;pH5.0,温度为37℃,反应时间为10h,有Mn^2 存在（0.001M)。     

黑曲霉生产菊粉酶工艺条件的研究

从徐州市沛县河口镇秦庄村牛蒡种植基地取得的土壤样本中,筛选出产菊粉酶的菌株,对从土壤中分离到的40株产菊粉酶的各类微生物进行酶活的测定。通过透明圈法初筛及摇瓶复筛,获得产菊粉酶能力较高的霉菌菌株3株,为C122803、D081506和D081513,这3株菌株的酶活分别达到：C122803：1.411 U/ml;D081506 ：1.895U/ml;D081513 ：1.792U/ml。其中D081506的酶活最高,为1.895U/ml;对D081506号黑曲霉产菊粉酶的发酵条件进行了研究,确定了优化的发酵条件为：牛蒡汁2%,酵母膏1.6%,(NH4)2SO41.6%,NaCl 0.5%,K2HPO4 0.5%,pH 5.0,在27℃、140 r/min条件下,摇瓶培养24h, D081506酶活力为2.958U/ml,酶活力提高56.09%。