O1群霍乱弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的:建立针对O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,并进行模拟粪便标本的检测评价。方法:根据O1群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对所建立的方法分别进行实验室内的灵敏度及特异性评价;将O1群霍乱弧菌灭活菌株悬液倍比稀释后与健康成人新鲜粪便混匀,制备成模拟带菌者粪便标本,提取DNA,进行Taq-Man PCR检测,用以评价该方法。结果:建立了快速检测O1群霍乱弧菌的实时荧光定量TaqMan PCR方法,灵敏度为每反应体系104拷贝;该方法对其他14种肠道菌DNA没有扩增;该方法对模拟粪便标本的检测灵敏度为每反应体系102 CFU。结论:建立了一种快速、高效检测O1群霍乱弧菌的荧光定量PCR检测方法,该方法可用于O1群霍乱弧菌临床粪便标本的检测。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

EvaGreen实时荧光定量PCR检测猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank中的猪圆环病毒2型(PCV2)ORF4基因序列设计一对特异性引物,通过常规PCR扩增PCV2的ORF4基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用该重组质粒进行EvaGreen实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的标准曲线,并进行熔解曲线分析。结果显示:建立的EvaGreen实时荧光定量PCR特异性强,与其他非靶标病毒基因不发生交叉反应;灵敏度高,最高可检测到10拷贝/μL的病毒量;重复性好,3个浓度的批间和批内的变异系数均小于2.5%;对118份临床样品进行检测,阳性样品25份,阳性率为21.2%,检测结果与普通PCR相符率为99.2%,其中一份样品经荧光PCR检测为PCV2阳性,普通PCR检测为阴性。结果表明,建立的EvaGreen实时荧光定量PCR方法具有特异性强、敏感度高、重复性好、简便快捷等特点,可用于临床PCV2感染的早期诊断以及分子流行病学调查。     

基于转录组测序的马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR内参基因筛选与鉴定

马尔尼菲青霉菌是一种温度依赖性双相型条件致病真菌,可感染免疫缺陷人群,区域流行于东南亚地和我国南方,但其双相转换和致病性分子机制尚不清楚。实时荧光定量PCR是马尔尼菲青霉菌双相转换和致病性分子机制研究的重要手段,但仍缺乏用于马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR标准化分析理想的内参基因。本研究根据转录组测序数据筛选了四个表达最稳定的Pfp、Rp123、FacpA、DigA基因与传统的内参基因18Sr RNA、β-actin(Act1)、β-tubulin(Btu)作为候选内参基因,用Best Keeper和ge Norm软件进行基因表达稳定性分析。结果表明FacpA和DigA基因在马尔尼菲青霉菌双相转换过程中表达最为稳定,可作为用于马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR标准化分析的内参基因。     

H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

H13亚型禽流感病毒以往只在海鸥、鸭等水禽中被发现,2018年,我们实验室报道了蛋鸡感染H13亚型禽流感病毒的证据,表明H13亚型禽流感病毒存在从水禽中溢出感染陆禽的风险,因而有必要加强对H13亚型禽流感病毒的监测。实时荧光定量PCR由于具有特异性强、灵敏度高、检测时间短等优点,在病原监测工作中得到了广泛应用。本研究以H13亚型禽流感病毒的HA基因作为靶基因,设计了一对特异性荧光定量PCR检测引物,通过特异性试验、敏感性试验等,建立了H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法,并应用建立的检测方法对海鸥粪便样品进行核酸检测。实验结果发现,该检测方法的灵敏度为1.60×10⁰拷贝/μL;该检测方法对H1、H3、H5、H6、H7和H9等6个亚型的禽流感病毒无交叉反应;该检测方法的敏感性是常规PCR的10倍;海鸥粪便样品中H13亚型禽流感病毒的核酸检测阳性率为18.8%。我们建立的H13亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点,该检测方法可用于大量临床样品的快速检测,为H13亚型禽流感病毒监测工作的顺利开展提供了技术支撑。     

腐皮镰刀菌SYBR Green实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的建立一种能够快速、灵敏、特异的鉴定腐皮镰刀菌的SYBR Green实时荧光定量PCR。方法运用SYBR Green实时荧光定量PCR反应体系检测腐皮镰刀菌,并对此方法的特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果通过对45例样品的检测,结果显示SYBR Green实时荧光定量PCR特异性好,其检出率高于普通PCR;灵敏度高,对重组质粒标准品的检测灵敏度为1.0×10~2copies/μL;稳定性好,对质粒为1.0×10~7copies/μL、1.0×10~5copies/μL、1.0×10~3copies/μL的标准品重复检测10次,结果显示扩增反应Ct值的变异系数为0.96%~1.68%。结论SYBR Green实时荧光定量PCR检测腐皮镰刀菌,不仅特异性好,灵敏度高,稳定性好,而且简便、快速、易操作。     

甘蔗杆状病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种能够快速、灵敏、特异的检测甘蔗杆状病毒(sugarcane bacilliform virus, SCBV)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,针对SCBV的基因序列,设计了特异性扩增引物,利用构建的标准品建立和优化针对SCBV的荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、稳定性、灵敏性等的测试,随后用于田间样品的检测。结果表明:将含有SCBV基因组序列的重组质粒进行梯度稀释制成标准品,利用标准品进行荧光定量PCR,获得标准曲线y=-3.482 1x+37.264,相关系数r~2=0.999 9,说明CT值与反应起始模板数量呈线性关系,可进行准确定量;组内和组间变异系数在0.19%～1.68%之间,表明检测方法重复性良好;建立的荧光定量PCR方法最低可检测到10个拷贝重组质粒/μL,是常规PCR检测灵敏度的100倍。使用建立的荧光定量PCR方法和常规PCR方法对采集的90份甘蔗叶片样品进行检测,常规PCR检出53份阳性样品,荧光定量PCR检出56份阳性样品,表明所建立的荧光定量PCR方法较常规PCR敏感性高,且准确性高。本研究建立的SCBV荧光定量PCR检测方法重复性好,灵敏度高,为构建甘蔗健康种苗体系提供了一种高效检测方法。     

人博卡病毒TaqMan探针实时定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人博卡病毒(HBoV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码HBoV非结构蛋白NP-1的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法,并与传统PCR方法进行比较,然后分别对两者的灵敏性、特异性、稳定性及临床样本检验的适用性等进行评价。结果:所建立的实时定量PCR检测方法可用于HBoV的特异性检测;相对于传统PCR所达到的250拷贝/反应的检测灵敏度,实时定量PCR的检测灵敏度可高达10拷贝/反应,检测范围为109～101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性;初步用于76份临床呼吸道标本检测,检出阳性5例,高于普通PCR方法(3/76)。结论:建立了HBoV TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,为开展HBoV流行病学监测及早期临床诊断提供了技术手段。     

实时荧光定量PCR及其在传染性疾病检测中的应用

实时荧光定量PCR技术被广泛应用于实验研究、临床检测中。与普通的PCR相比,实时荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点。我们综述了实时荧光定量PCR技术的原理、定量方法,及其在传染性疾病检测研究中的应用。     

双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因

目的建立一种双重荧光定量PCR检测志贺毒素stx1和stx2基因的方法。方法根据不同细菌来源的stx1和stx2序列,设计PCR引物和TaqMan探针,建立双重实时荧光定量PCR检测体系,进行灵敏度、特异性和重复性评价,并对腹泻患者粪便样本进行检测分析。结果双重实时荧光定量PCR检测含志贺毒素基因重组质粒的最低检测下限为102 copies/mL;该法对12种常见肠道病原菌均无特异性扩增,对不同浓度的标准质粒检测重复性高,Ct值变异系数均小于10%;对急性腹泻粪便标本的检测阳性率高于细菌分离培养。结论建立的双重实时荧光定量PCR可作为不同细菌来源的志贺毒素基因的快速鉴定方法,亦可用于人感染性腹泻标本的快速筛查。     

转Cry1Ab基因水稻分子特征及其特异性PCR检测方法

转Cry1Ab基因水稻Bt01为一种新型的转基因水稻,文章首先利用Southern blotting验证了外源基因Cry1Ab转入了Bt01中,且为单拷贝,再利用TAIL-PCR方法获得了其插入位点信息,根据获得的Bt01的5′端插入位点序列,设计了相应的定性与定量PCR检测体系的引物及探针,实验结果显示,定性PCR检测体系的最低检测极限(LOD)为10个拷贝,定量PCR检测体系的LOD为5拷贝,最低定量极限(LOQ)为10拷贝。同时为了验证建立的定量PCR体系的准确性,利用该体系检测已知转基因水稻Bt01含量分别为3%和0.5%的样品,定量结果分别为2.7%和0.47%。研究结果表明,该转化体特异性定性与定量检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性,为转基因水稻Bt01的身份识别和检测提供了有效的方法。     

呼吸道合胞病毒TaqMan探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及应用

目的:建立呼吸道合胞病毒(RSV)核酸特异、快速、敏感的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,并对临床样本进行检测。方法:比对编码RSV非编码蛋白的基因序列,选取其保守片段设计引物和探针,建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,并与传统RT-PCR方法进行比较,分别对两者的灵敏性、特异性、重复性及临床样本检验的适用性进行评价。结果:所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于RSV的特异性检测。相对于传统RT-PCR方法100拷贝/反应的检测灵敏度,实时荧光定量RT-PCR的检测灵敏度达到10拷贝/反应,检测范围为1010~101拷贝/反应,且具有良好的特异性和重复性。从169份临床呼吸道标本中检出RSV阳性40例,高于普通PCR方法(31/169)。结论:建立了RSV的TaqMan探针实时定量PCR检测方法,并可用于临床鼻咽拭子样本的检测,在临床上具有较好的应用前景。     

应用TaqMan荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌

目的：利用Roche LightCycler实时定量PCR系统建立一种快速、灵敏、特异的检测土拉弗朗西斯菌的方法。方法：基于TaqMan荧光探针实时定量PCR技术,选择土拉弗朗西斯菌染色体上的特异序列[醇醛酮还原酶（AKR）和外膜蛋白FopA基因]作为检测靶序列,建立土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法;评价该检测方法的特异性和灵敏性;采用克隆菌株污染环境土壤来模拟实际样品,评价该检测方法在快速检测与现场检测等实际应用中的表现。结果：优化筛选基因组中的FT-AKR和FT-fopA片段作为检测靶序列,所建立的土拉弗朗西斯菌实时定量PCR检测方法检测克隆菌株质粒的灵敏度均为10个拷贝/每个反应体系;以其他非土拉弗朗西斯菌为模板未出现非特异扩增;模拟环境土壤样品检测灵敏度2个引物对分别为440和960CFU/g土壤;盲测实验结果显示对于灵敏度范围内的阳性样本均能正确识别,并能正确检测出不同浓度的阳性样本。以FT-fopA片段为靶序列的扩增效率不及基于FT-AKR引物对的扩增。结论：基于FT-AKR片段的引物对扩增效率高,检测土拉弗朗西斯菌具有特异、灵敏的特点,对临床诊断、环境污染监测、防治生物突发事件等具有重要意义。     

复合探针荧光定量PCR法检测布鲁氏菌的实验研究

目的：建立用复合探针荧光定量PCR快速检测布鲁氏菌的方法。方法：研究根据BSCP31基因编码31KDa的布鲁氏杆菌表面蛋白的核苷酸序列设计特异引物,通过PCR法的特异性、灵敏度和重复性研究,建立了复合探针荧光定量PCR检测布鲁氏菌的方法。用于布鲁氏菌病的筛选和诊断。结果：结果表明该检测方法的特异性为100％,最低可检出10个拷贝的质粒DNA分子,可对1×10^1-1×10^6拷贝范围内的模板进行定量,最低可检测至1×10^2CFU／ml细菌。该方法的精密度好,阳性质控品和阴性质控品不同时间测定三次及同一时间五次重复实验结果CV值均小于5％。结论：本研究建立的复合探针实时荧光定量PCR检测布鲁氏杆菌的方法,可对布鲁氏病原菌进行快速检测,对布病的筛选和确诊具有重要意义。     

转Cry1Ab基因水稻分子特征及其特异性PCR检测方法

转Cry1Ab基因水稻Bt01为一种新型的转基因水稻, 文章首先利用Southern blotting验证了外源基因Cry1Ab转入了Bt01中, 且为单拷贝, 再利用TAIL-PCR方法获得了其插入位点信息, 根据获得的Bt01的5′端插入位点序列, 设计了相应的定性与定量PCR检测体系的引物及探针, 实验结果显示, 定性PCR检测体系的最低检测极限(LOD)为10个拷贝, 定量PCR检测体系的LOD为5拷贝, 最低定量极限(LOQ)为10拷贝。同时为了验证建立的定量PCR体系的准确性, 利用该体系检测已知转基因水稻Bt01含量分别为3%和0.5%的样品, 定量结果分别为2.7%和0.47%。研究结果表明, 该转化体特异性定性与定量检测方法具有高度的特异性和良好的灵敏性, 为转基因水稻Bt01的身份识别和检测提供了有效的方法。     

用环介导等温扩增技术快速检测粪便样本中的沙门菌

目的:建立快速检测粪便样本中的沙门菌的环介导等温扩增技术(LAMP),并着重在灵敏度和特异性方面对此方法进行评价。方法:利用LAMP针对沙门菌特定基因invA(靶基因)设计的6条特异引物,通过引物特异性识别特定基因invA上的8个独立区域来快速检测沙门菌;LAMP反应过程中会产生白色沉淀焦磷酸镁,故可以通过监测浊度来判定反应结果。结果:实时浊度仪监测反应结果表明,LAMP反应在60~65℃等温条件下50 min内完成;如果在反应前添加羟基萘酚兰,蓝色阳性结果很明显区别于紫色阴性结果;LAMP的最低检出限为6.97 pg/μL,PCR为69.7pg/μL,LAMP方法的检测灵敏度是PCR的10倍,且具有良好的特异性。结论:LAMP方法用于快速检测沙门菌,具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨、灵敏度高、特异性强的特点,对非沙门菌菌株的结果呈阴性,表明引物设计有很好的特异性。对粪便样本进行检测,发现具有同样的敏感性和特异性。这表明LAMP法是潜在的和有价值的在粪便样本中直接检测沙门菌的方法,具有快速、简便、低成本的特点。LAMP法适用于快速临床诊断。     

New bioluminescence pyrophosphate assay for high‐sensitivity detection of food‐borne pathogens

Traditional methods of identifying food‐borne pathogens are time consuming and laborious, so innovative methods for their rapid identification must be developed. Testing for bioluminescence pyrophosphate is a convenient and fast method of detecting pathogens without complex equipment. However, the sensitivity of the method is not as high as that of other methods, and it has a very high detection limit. In this study, the method was optimized to improve its sensitivity. The shortcomings of the method were first identified and corrected using dATPαS instead of dATP for the polymerase chain reaction (PCR), therefore reducing the background signal. Also, when the DNA template extracted from the food‐borne pathogens was purified, the new bioluminescence pyrophosphate assay had a limit of detection of <10 copy/μl or 10 colony‐forming units/ml, and its sensitivity was higher than that of fluorescent real‐time quantitative PCR. Moreover, a single copy of a food‐borne pathogen could be detected when a single DNA template was included in the PCR. Salmonella was detected in and isolated from 60 samples of broiler chicken, and the accuracy of the results was verified using a culture method (GB 4789.4–2010). These results showed that the new bioluminescence pyrophosphate assay has the advantages of an intuitive detection process, convenient operation, and rapid measurements. Therefore, it can be used for the rapid detection of pathogenic bacteria and probiotics in various fields.     

Rapid detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by Real Time PCR and Bactec 960 MIGT

We have developed a Real-Time PCR assay to detect M. tuberculosis using the iCycler iQ detection system by TaqMan assay directly on the clinical specimen. A total of 513 clinical samples were taken from patients with suspected tuberculosis and other patients that had an active mycobacterial infection, as well as patients with diagnosed tuberculosis who were receiving antitubercular therapy. The sensitivity and specificity of this assay, 10% and 100%, respectively, were compared to those of conventional microbiological methods.     

临床皮炎外瓶霉荧光定量PCR检测方法的建立

目的 建立基于TaqMan探针技术的皮炎外瓶霉荧光定量PCR检测方法.方法 通过对皮炎外瓶霉ITS区域基因组序列（GenBank：JN675373.1）进行分析,设计合成特异性引物和荧光标记探针,优化荧光定量PCR反应条件.以临床标本中分离的皮炎外瓶霉为阳性菌株,及其他种类真菌和细菌作为阴性对照菌株,从特异性、敏感性及重复性方面对该方法检测效果进行评价.结果 该研究设计的引物和探针能扩增皮炎外瓶霉特异性序列.临床分离得到的皮炎外瓶霉在反应中有明显扩增曲线,而甄氏外瓶霉、棘状外瓶霉、烟曲霉、白色念珠菌、新生隐球菌、马内菲青霉等20株菌在CT值≤38范围内均未有扩增;利用基因重组构建的标准品完成了标准曲线的绘制,在1.0×103～1.0×107拷贝数（Cp）内具有良好的线性关系（R2=1.000）,最低可检出量为10 Cp/μL.结论 成功建立了荧光定量PCR检测皮炎外瓶霉方法,该法特异度强、敏感度高、重复性好,将有助于临床皮炎外瓶霉感染的早期诊断和针对性治疗.