抗 Trx 单克隆抗体用于血吸虫病诊断的研究 *

摘要 目的： 建立双抗体夹心 ELISA 法检测日本血吸虫硫氧还蛋白 （Thioredoxin,Trx ）。方法： 用重组日本血吸虫 Trx （rTrx ） 蛋白免 疫 BALB/c 小鼠, 筛选高滴度、 高特异性的单克隆抗体建立双抗体夹心 ELISA 法。通过检测日本血吸虫排泄 - 分泌物 （ excretorysecretions,ES ） 与 rTrx 的浓度评价该方法的敏感性; 通过对健康人血清的检测确定其特异性; 通过对布氏姜片吸虫病、 华支睾吸虫 病、 卫氏并殖吸虫病、 囊虫病患者血清进行交叉反应试验, 评价该方法的特异性。 结果： 获得 2 株稳定分泌抗 rTrx 蛋白单克隆抗体 的杂交瘤细胞株, 命名为 McTrx1 和 McTrx2。以 McTrx1 为包被抗体, HRP-McTrx2 为酶标抗体, 建立的双抗体夹心 ELISA 可检 测出 ES 的最低浓度为 4.8 μg/ml, 检测出 rTrx 的最低浓度为 1.2 μg/ml。 该方法的特异性为 96%。 结论： 以抗 rTrx 蛋白单克隆抗体 McTrx1 与 McTrx2 为基础建立的双抗体夹心 ELISA 法具有较高的特异性。     

检测HSA—GLP-1融合蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立

目的：为检测血清中HSA-GLP-1融合蛋白整体分子的浓度,建立一种特异、灵敏的定量检测食蟹猴体内HSA-GLP-1融合蛋白浓度的双抗体夹心ELISA的方法。方法：采用双抗体夹心ELISA方法,以GLP-1单克隆抗体为包被抗体、HSA-GLP-1融合蛋白为夹心抗原、anti-HSA-Biotin为检测抗体,用Streptavidin-HRP进行免疫放大,TMB显色。结果：建立了检测HSA-GLP-1融合蛋白的ELISA方法,其线性范围为15.6~1000 ng/mL,最低检测限为15.6 ng/mL,与GLP-1、HSA、IL2-HSA均无交叉反应,板内和板间精密度均小于15%,准确度为±15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好。结论：建立的HSA-GLP-1蛋白检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于HSA-GLP-1融合蛋白在临床前药代动力学试验的定量检测。     

双抗体夹心ELISA检测HIV-1 gp41抗原方法的建立

目的:建立检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA,并探讨其临床应用的可行性。方法:用饱和硫酸铵(SAS)纯化抗HIV-1gp41-5单克隆抗体(mAb),用HRP标记后建立双抗体夹心ELISA法,对其灵敏度及特异性进行检测,并用该方法对40份HIV-1阳性血清进行了检测。结果:用mAbE12(5μg/mL)为包被抗体,2H6为酶标记抗体(1∶900)建立了双抗体夹心ELISA法,检测gp41-5多肽的灵敏度是100pg/mL。对HIV-1阳性血清中gp41抗原的检出率为67.5%(27/40)。结论:建立了特异性强、灵敏度良好的检测HIV-1gp41抗原的双抗体夹心ELISA法。     

抗HIV-p24单克隆抗体细胞株的建立及初步应用

拟建立抗HIV-P24蛋白的单克隆抗体细胞株及双抗体夹心法,用于检测艾滋病人血清中的P24抗原。用纯化的基因工程表达的HIV-P24蛋白免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0的细胞融合,有限稀释法克隆细胞,ELISA筛选特异性抗体。结果克隆筛选出12株细胞,初步建立了检测HIV-P24抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验。本方法为监控艾滋病病毒感染的窗口期和艾滋病病人临床治疗效果提供了检测手段。     

Nodal检测双单抗夹心ELISA法建立及应用

现已证实,Nodal参与了肿瘤恶性生物学过程,但对其高敏感检测法尚未建立。采用基因工程表达人源Nodal作为抗原免疫BALB/c小鼠,通过经典PEG诱导的细胞融合技术筛选出针对Nodal的特异性单克隆抗体7株。夹心ELISA确证7株抗体组成了15种可配对的抗体对。经筛选后选取抗体对AF12-DG5建立标准化夹心ELISA法,结合生物素-亲和素检测系统,DG5抗体标记生物素,采用链亲和素与辣根过氧化物酶标记的生物素(HRP-Biotin)按质量比4∶1预先混合孵育的ABC混合物进行检测,以提高ELISA法的灵敏度。棋盘滴定确定抗体工作最佳浓度为:捕获抗体(AF12)2μg/ml,检测抗体(生物素化DG5)2μg/ml。此条件下的夹心ELISA法线性范围为0~3 000pg/ml,检测限为68pg/ml,平均回收率为99.6%,精密度准确度良好。以正常人血清作为阴性对照,使用该夹心ELISA法测定结直肠癌、鼻咽癌和胆囊癌患者血清,发现三种肿瘤患者血清与正常人血清中的Nodal浓度均存在明显的统计学差异,可作为临床使用参考。     

抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的制备及双抗体夹心酶联免疫吸附试验检测法的建立

目的：制备针对嗜肺军团茵血清8型的单克隆抗体,并建立双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法。方法：用甲醛灭活的嗜肺军团菌血清8型菌免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,建立双抗夹心ELISA检测方法。结果：研制出8株能特异性分泌抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体的杂交瘤细胞株,Ig类型分别为IgM（2株）、IgG,（1株）和IgG,（5株）;利用IgG1型单抗6G10与6C7配对,建立了双抗夹心ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度为2．6×10^5cfu／mL,除与金黄色葡萄球菌有微弱的交叉反应外,与14株其他血清型嗜肺军团菌、17株非嗜肺军团菌及11株非军团菌均无交叉反应,具有较高的特异性。结论：制备了具有高特异性和亲和力的抗嗜肺军团菌血清8型单克隆抗体,并建立了双抗夹心EUSA检测方法。     

抗埃博拉病毒核蛋白抗体的制备与双抗夹心ELISA检测方法的建立

目的:制备抗埃博拉病毒核蛋白(EBOV NP)单克隆抗体和多克隆抗体,建立针对EBOV NP的ELISA检测方法。方法:以重组EBOV NP免疫动物并制备多克隆抗体和单克隆抗体。在此基础上,通过优化抗体浓度、包被液等条件建立检测EBOV NP的双抗夹心ELISA方法。结果:制备出了兔多克隆抗体,筛选出2株可分泌单克隆抗体的鼠源杂交瘤细胞株。Western blot实验结果表明兔多抗与鼠单抗的结合区域均为N端1~35氨基酸。通过优化,建立了针对EBOV NP的双抗夹心ELISA检测方法。其线性范围是31.2~1 000 ng/ml,最低检测限为2.6 ng/ml。结论:制备出了抗EBOV核蛋白的高特异性多克隆抗体和单克隆抗体,建立了定量检测EBOV核蛋白的方法。     

抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的制备

目的:制备分泌特异性抗人甲状腺球蛋白(thyroglobulin,Tg)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为建立高灵敏度的Tg检测方法做准备。方法:以天然人源甲状腺球蛋白为抗原经皮下免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合制备分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体,并对其进行特异性鉴定,建立检测Tg的双抗体ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)夹心法。结果:获得7株可稳定分泌抗人甲状腺球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,经ELISA鉴定,筛选抗体可与Tg抗原有良好的特异性反应。建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性可达1 ng/mL。结论:成功制备了抗人Tg单克隆抗体并建立了检测人Tg双抗体夹心ELISA方法,为进一步研发Tg快速诊断试剂盒提供了原料。     

抗细小病毒B19-VP2单克隆抗体的建立

制备抗细小病毒B19－VP2单克隆抗体,用于检测人血清中的B19抗原,辅助诊断相关疾病;也可用于制备人类细小病毒基因工程疫苗。用纯化的基因工程表达的B19－VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞融合,有限稀释法克隆细胞。ELISA及IF证明抗体特异性。克隆筛选出4株细胞,并初步建立了检测B19－VP2抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试验,为双抗体夹心法检测B19抗原为临床相关疾病诊断提供了检测手段。     

双抗体夹心ELISA定量检测IFNβ-HSA融合蛋白方法的建立

为了建立β干扰素与人血清白蛋白融合蛋白(IFNβ-HSA)的酶联免疫定量分析方法,以抗IFNβ单克隆抗体为包被抗体,IFNβ-HSA融合蛋白为夹心抗原,辣根过氧化酶(HRP)标记抗HSA单克隆抗体为检测抗体,建立了一种定量测定IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法.并进行了检测限、精密度、准确度和稳定性等方法学考核.结果表明,包被抗体和检测抗体的最佳工作浓度均为2μg/ml,抗原浓度在51.88-3320 ng/ml范围内呈良好线性关系,相关系数R2>0.99.检测限为10ng/m1.经方法学考核,批内、批间变异系数分别为4.86%和8.08%,回收率为91.9%～110.4%,与IFN-B、IFN-α、HSA、IFNα2b-HSA基本无交叉反应.健全性分析表明发酵液稀释倍数对该方法无影响,8 d连续检测标准曲线表明稳定性良好.这种定量检测IFNβ-HSA融合蛋白的双抗体夹心ELISA方法,灵敏度高,重复性好,为当前融合蛋白发酵优化、分离纯化研究提供了定量检测的方法,并为后期药代动力学、临床研究提供了思路和备选方法.     

抗人β-BCG单克隆抗体的制备及化学发光检测方法的建立

目的：制备人绒毛膜促性腺激素（β-HCG）单克隆抗体,建立人β-HCG双抗体夹心CLIA检测方法。方法：用人β-HCG抗原免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株,然后将细胞株扩大培养并纯化上清液获得抗体,测定抗体亲和力、特异性及表位,最后建立双抗体夹心CLIA方法。结果：获得4株抗人β-HCG的杂交瘤细胞株（β-1—1、β-2—1、β-3—1、β-4—1）。用β-1—1和β-2—1建立的双抗体夹心法的检测范围为0．5mlU／mL．800mlU／mL,灵敏度0．23mIU／mL,检测结果的相对偏差均在±10％内,回收率在90％以上。结论：本研究最终成功制备了抗人β-HCGmAb,建立了定量检测人β-HCG的双抗体夹心CLIA方法,为β-HCG检测及疾病的诊断奠定基础。     

抗人beta-HCG单克隆抗体的制备及化学发光 检测方法的建立

目的：制备人绒毛膜促性腺激素（beta-HCG）单克隆抗体,建立人beta-HCG双抗体夹心CLIA 检测方法。方法：用人beta-HCG 抗原 免疫小鼠,通过细胞融合、筛选后得到杂交瘤细胞株,然后将细胞株扩大培养并纯化上清液获得抗体,测定抗体亲和力、特异性及 表位,最后建立双抗体夹心CLIA方法。结果：获得4 株抗人茁-HCG的杂交瘤细胞株(beta-1-1、beta-2-1、beta-3-1、beta-4-1)。用beta-1-1 和 beta-2-1 建立的双抗体夹心法的检测范围为0.5 mIU/mL-800 mIU/mL,灵敏度0.23 mIU/mL,检测结果的相对偏差均在± 10 %内,回 收率在90 %以上。结论：本研究最终成功制备了抗人beta-HCG mAb,建立了定量检测人beta-HCG 的双抗体夹心CLIA 方法,为 beta-HCG 检测及疾病的诊断奠定基础。     

Development of a double antibody sandwich ELISA assay for the diagnosis of angiostrongyliasis

With the use of 2 monoclonal antibodies (MAbs) against excretory/secretory (ES) antigens of adult Angiostrongylus cantonensis, a new method was developed for double antibody sandwich ELISA for the detection of circulating antigens (CAg). To evaluate the sensitivity of the new procedure, the CAg in sera of rats (80) and mice (15) infected with A. cantonensis, as well as CAg in sera of clinically confirmed angiostrongyliasis patients (70), were evaluated. Cross-reaction testing was used to determine the specificity of serum from patients infected with Ascaris lumbricoides, Trichinella spiralis , Toxoplasma gondii , Schistosoma japonicum, Paragonimus westermani, Clonorchis sinensis, Echinococcus granulosus, Spirometra, and Taenia solium, as well as normal healthy people. The results proved that the sensitivity and the specificity of the new method were totally effective for the detection of A. cantonensis CAg. The assay is highly sensitive, specific, and reproducible, with easy handling and excellent cost effectiveness, and thereby provides a new method for the accurate diagnosis of angiostrongyliasis.     

HIV感染早期病毒p24蛋白的检测

目的:建立敏感、特异的检测血清中HIV-p24蛋白的方法,作为HIV感染早期即窗口期的监测手段。方法:用纯化的p24蛋白免疫小鼠及家兔,获得单克隆及多克隆抗体,经DEAE-52阴离子交换柱纯化后,标记辣根过氧化物酶,建立ELISA双抗体夹心及间接双抗体夹心方法,检测HIV-p24蛋白。结果:包被单抗、标记多抗或包被多抗、标记单抗,均能特异地检出系列稀释的p24蛋白,包被混合单抗较包被多抗更敏感;经标记的抗种属抗体放大可明显提高检测的敏感性。结论:建立了敏感、特异的检测p24蛋白的双抗体夹心法,间接放大方法可检出50pg/mL的HIV-p24蛋白,检测敏感性与国际同类产品相似。     

抗HLJ1单克隆抗体的制备及抗原检测方法的建立

为制备抗人肝脏DnaJ-like蛋白(Human liver DnaJ-like protein, HLJ1)的单克隆抗体, 并建立免疫组化和双抗体夹心ELISA检测HLJ1的方法。采用淋巴细胞杂交瘤技术, 获得两株能稳定分泌抗HLJ1单克隆抗体的杂交瘤细胞株A4C7和 C4C8。经鉴定, 两株单抗的亚类均为IgG1, 并且效价高、特异性好。以单抗A4C7和C4C8作为一抗, 对人胎肝组织石蜡切片进行免疫组化染色, 结果表明, 两株单抗均为阳性染色, 且HLJ1主要定位于胎肝细胞的胞浆。选取A4C7进行HRP酶标记, 并以HRP- A4C7作为酶标抗体, 以C4C8作为包被抗体, 建立双抗体夹心ELISA方法, 并进行棋盘滴定确定抗体的最佳工作浓度。该检测方法的线性范围是15~750 ng/mL, 灵敏度下限达15 ng/mL, 特异性良好。所建立的免疫组化和双抗体夹心ELISA 法可用于快速、灵敏地检测组织及血清中的HLJ1蛋白, 为HLJ1的肿瘤相关性研究提供了有力的工具。     

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。     

蝶蛹金小蜂卵黄蛋白单克隆抗体的制备及其应用方法的建立

为深入研究寄生蜂卵黄发生及其内分泌调控,特采用杂交瘤细胞技术,制备4株能稳定分泌抗蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum卵黄蛋白（vitellin, Vt）的单克隆抗体（mAb）,即PpVt mAb1,PpVt mAb2,PpVt mAb3和PpVt mAb4。这4株单克隆抗体的重链和轻链的亚类均分别为IgG1和κ类型,不仅特异性识别Vt,而且识别雌蜂血淋巴中卵黄原蛋白（vitellogenin,Vg）,但与雄蜂体液无反应。通过比较4种不同的ELISA方法,确定了微量检测蝶蛹金小蜂体内Vg/Vt的最适ELISA法,即双夹心ELISA法。该方法可用于单头雌蜂体内Vg/Vt的检测,其检测灵敏度为20 ng/mL。用Western 免疫印迹的方法证实了该蜂Vg的合成始于刚羽化的成虫,并在羽化后12～36 h内含量达到高峰。     

定量检测猕猴血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体间接ELISA法的建立

目的：建立定量检测血清中重组人源化抗狂犬病毒单克隆抗体（HuMabs）NM57的间接ELISA法,为药代动力学研究提供一种简单快速的方法。方法：采用狂犬病毒糖蛋白包被酶标板、HRP标记的IgG-Fc段为标记抗体,建立定量检测HuMabsNM57的间接ELISA法,并对其特异性、灵敏度、精密度及准确度进行检测。结果：间接ELISA法检测HuMabsNM57的灵敏度为5ng／mL,组内及组间精密度分别为2．6％-6．0％、8．5％-11．3％。结论：建立了灵敏度高、特异性强的检测HuMabs NM57的间接ELISA法,精密度及准确度均符合药代动力学要求,可用于猕猴及人血清中HuMabsNM57的检测。     

Fasciola gigantica: Immunodiagnosis of fasciolosis by detection of circulating 28.5 kDa tegumental antigen

A monoclonal antibody (MoAb)-based sandwich ELISA was developed for the detection of circulating 28.5 kDa tegumental antigen (28.5 kDa TA) in the sera from mice experimentally infected with Fasciola gigantica. The MoAb was immobilized on a microtiter plate, and the antigen in the serum was captured and detected with biotinylated polyclonal rabbit anti TA antibody. The test could detect 28.5 kDa in the extracts of tegument (TA), whole body (WB) and excretory-secretory (ES) fractions at the concentrations of these crude antigens as low as 600 pg/ml, 16 and 60 ng/ml, respectively. This sandwich ELISA assay could detect the infection from day 1 to 35 post infection and showed that circulating level of 28.5 kDa TA peaked at day 1 post infection. In contrast, the antibody detection by indirect ELISA could only demonstrate the antibody level from 35 days post infection. The reliability of the assay method was evaluated using sera from mice infected with F. gigantica or Schistosoma mansoni, and hamsters infected with Opisthorchis viverrini, as well as healthy mice and hamsters. The sandwich ELISA exhibited a sensitivity and specificity at 94.55% and 100%, respectively, and with a positive predictive value of 100%, a negative predictive value of 97.39%, false positive rate of 0%, false negative rate of 5.50% and an accuracy of 98.2%. Thus, this detection method exhibited high specificity and sensitivity as well as could be used for early diagnosis of fasciolosis by F. gigantica.