用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS-CoV

为从临床样品中检测和分析SARSCoV病毒打基础,并为分析SARSCoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法。以SARS冠状病毒TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片,探针长度为70nt,每相邻的探针序列重复25nt,共660条。用该芯片分析了细胞培养的SARSCoV病毒总RNA、7个SARSCoV病毒的基因克隆片段。对RNA样品用随机引物进行反转录PCR获得cDNA。对DNA用随机引物扩增和dUTPcy3标记。结果用这种芯片杂交检测SARSCoV病毒RNA可见阳性信号呈全基因组分布,并且有多处连续的阳性信号点;用正常人的白细胞RNA为对照,杂交未出现明显阳性信号。检测7个SARSCoV病毒基因克隆片段,在该片段相应的探针区段出现连续阳性信号点。这种方法可有效地检测和分析样品中SARS冠状病毒全基因组的信息。     

32株SARS冠状病毒基因组比对在PCR检测中的应用

进行了32株SARS冠状病毒基因组的多序列比对分析.所得无根进化树揭示SARS冠状病毒之间的同源性.同时,验证了所设计的PCR检测引物对全部32株SARS冠状病毒检测的适用性.     

SARS病毒与其他冠状病毒的基因组比较

本文利用生物信息学方法比较SARS病毒和其他冠状病毒基因组。通过数据库搜索,找出与SARS病毒基因组相似的核酸或蛋白质序列,并对相似序列进行比对,分析它们的共性和差异。结果表明,SARS病毒在基因组的组织上及结构蛋白质方面与现有冠状病毒有比较大的相似性,SARS病毒基因组与冠状病毒基因组相关。但是,SARS病毒基因组还存在一些特异性序列,ORF1a和S蛋白(特别是S1)的变化以及SARS—CoV特异性的非结构蛋白可能是SARS发病机理与传染特性区别于其他冠状病毒的分子基础。在全基因组水平上进行核酸单词出现频率分析,结果表明,SARS病毒远离已知的其他冠状病毒,单独成为一类。     

SARS相关冠状病毒及其基因组

正在全球部分地区流行的严重急性呼吸综合征(SARS),由于其传染性强、危害性大而引起了广泛关注。各国实验室密切协作,在数月时间内分离出了SARS冠状病毒(SARSCoV),测定了病毒基因组序列,并在猴体内初步再现出SARSCoV所致肺部疾病与人相似,这些工作为遏制SARS的蔓延发挥了重要作用。现就SARSCoV的鉴定、基因组及其产物的结构与功能做一综述。     

SARS冠状病毒全基因组序列初步分析

对已经完成全序列测定的12个SARS病毒基因组进行了多序列比对,发现序列主体部分29708 b具有99．82％的相同碱基,除2个序列各有5个和6个碱基的缺失外,其余部分共有42个位点核苷酸碱基的差异,其中28个位点的碱基差异可引起氨基酸残基改变。利用蛋白质二级结构和跨膜螺旋预测以及蛋白质定位等生物信息学工具,分析了这些产生氨基酸改变部位的蛋白质构像,推测了可能产生的结构和功能改变,为进一步生物学实验提供参考。所有分析结果同时在北京大学生物信息中心抗SARS网站(antisars.cbi.pku．edu．cn)上发布。     

全基因组扩增技术及其在法医个体识别中的应用

全基因组扩增(Whole genome amplification,WGA)技术是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术。近几年来,对WGA技术扩增痕量DNA检材的研究日渐深入,这些研究可望用于刑案现场采集到的痕量DNA样品的扩增,为法医个体识别提供足量的DNA模板。然而,对实际案件中复杂检材的扩增偏差问题一直困扰着法医工作者,寻求一个低扩增偏差、高扩增产率的WGA技术是法医工作者的主要目标。文章综述了WGA技术在法医个体识别中的研究进展及应用前景,为法医解决扩增偏差问题提供参考。     

SARS冠状病毒基因组全序列二碱基指纹分析

二碱基指纹是指全部16种二碱基组合在一个序列内的相对丰度.对病毒、线粒体、细菌、真菌、哺乳动物等上百个物种的基因组序列数据,以及可转座元件序列的分析显示[1-8]:二碱基指纹在基因组内序列之间基本一致,亲缘越近的物种其二碱基指纹越相似.根据这个标准重新进行的分类,与目前通行的基于核酸(或者蛋白质)序列相似性比较所形成的分类基本一致,但也有若干值得注意的差别[9].     

SARS病毒基因组的多态性

对SARS病人粪便样本直接测序,得到SRAS—CoV BJ202全基因组序列（AY864806）。应用比较基因组研究方法对GenBank中公布的115株SARS—CoV基因组序列以及BJ202进行分析。以GZ02序列为参照,发现2个以上基因组中同时存在单核苷酸多态（SNP）位点共278个。多态位点在SARS—CoV基因组中呈偏态分布,大约一半突变位点（50．4％,140／278）发生在基因组3’末端1／3区域。编码Orf10-11、Orf3／4、E蛋白、M蛋白和S蛋白区域突变率较高。克隆并测序含有BJ202基因组12个多态位点的11个cDNA以及4个不含已知多态位点的cDNA片段（15个片段总长度为6．0kb）,结果显示：BJ202特有的3个多态位点（13804、1503l和20792）以及另外3个多态位点（26428、26477和27243）均检出两种不同核苷酸;位点18379虽在已公布的115株SARS—CoV基因组中未发现突变,实际上也是多态位点。14个克隆中有8个克隆该位点为A,6个克隆为G。全部116个SARS—CoV基因组中共有18种缺失类型和2种插入类型。大部分缺失发生在编码ORF9和ORF10-11区域（基因组序列27700—28000bp处）。以邻位连接法（Neighbor-Joining）构建了116株SARS—CoV系统发育树,BJ202与BJ01和LLJ-2004等SARS—CoV的亲缘关系较接近。     

Bst DNA聚合酶大片段在全基因组扩增中的应用

Bst DNA聚合酶大片段作为一种常用的DNA聚合酶,因其独特的特点:能引发链置换反应、高保真、耐高温等,而成为一种重要的DNA多重置换扩增酶。目的:为减少成本,设计一种高产,方便且扩增活性高的Bst DNA聚合酶大片段表达体系;探究该酶应用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增条件。方法:采用p TWIN1质粒作为载体克隆表达Bst DNA聚合酶大片段,应用几丁质亲和层析柱纯化该酶,使用该酶对人类基因组DNA进行不同温度下扩增,探究其最适反应温度,并据此对胃癌石蜡包埋组织基因组DNA进行扩增。结果:由此得到的Bst DNA聚合酶大片段能运用于胃癌石蜡包埋组织基因组DNA的扩增,扩增效率可达200倍,并能应用于a CGH芯片。结论:扩增得到保真性高,覆盖基因组范围大的DNA扩增产物。该应用与a CGH结合,使得对少量的癌症石蜡包埋组织DNA样本进行全基因组扩增,并进行其基因拷贝数变异研究成为可能。     

SARS冠状病毒的变异特性分析

通过对目前所发表或公布的CARS相关资料进行分析,结合所做的一些工作,对SARS-CoV的变异特性、影响变异的可能因素以及变异与Ⅰ临床病程发展的联系进行了探讨。结果显示,SARS．CoV在变异发生频率和动态变化上具有RNA病毒的普遍特性,但由于其在人类的传播时间较短,相对于常见的引起慢性感染的RNA病毒,如丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)等,得到鉴定的变异序列数量相对较少。SARS-CoV5基因尤其是S1区变异程度较高,Ⅳ基因较为保守。就目前有限的研究结果分析,没有发现病毒变异与Ⅰ临床病程发展之间有明确的联系。     

SARS病毒免疫学性状的结构基础分析

运用生物信息学技术,对SARS冠状病毒基因组及其编码区进行了全序列分析,根据其基因和推导蛋白结构特点及同源性分析,探索SARS病毒主要结构蛋白免疫学性状的结构基础及进一步进行免疫学研究的线索,为深入SARS病毒的诊断预防工作提供参考 。     

SARS冠状病毒复制酶蛋白nsp8的原核表达

以SARS冠状病毒(BJ01株)基因组RNA为模板,经RT-PCR扩增得到SARS-CoVnsp8基因,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组质粒pNSP8E。pNSP8E转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达出可溶性的GST-nsp8融合蛋白,经亲和层析和自剪切获得了高纯度nsp8蛋白。以nsp8为抗原免疫家兔,制备了nsp8的多克隆抗体,为下一步研究其在病毒感染的细胞中的功能奠定了基础。     

Initial Analysis of Complete Genome Sequences of SARS Coronavirus

TheoutbreakoftheSevereAcuteRespiratorySyndrome (SARS)startingfromsouthernChinaearlythisyearhasasignificantinfluenceonpublichealth .TheidentificationofSARS CoVasthemajorcausativefactoroftheSARSdiseaseandthegenomicse quencingofthevirusmakesitpossibleforbioinformaticsstudy .Atotalof16SARS CoVgenomesequencesareavailablefromthenucleicaciddatabaseGenBank EMBL DDBJby 2 0May 2 0 0 3.SARS CoVZJ0 1(AY2 970 2 8 1)wasshowninGenBankaftertheanalysiswasperformed .12completegenomeswereretri…     

SARS冠状病毒非结构蛋白Nsp的原核表达

严重急性呼吸综合征病毒,即SARS冠状病毒((Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV),为具有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组约长29~31kb。基因组从5'到3'端依次编码复制酶蛋白(Rep)、刺突蛋白(S)、囊膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核蛋白(N)以及其他一些辅助性蛋白[1]。编码复制酶蛋白的基因,从基因组5'端起约占全长的2/3区域(≈21.2kb),在该区域的nt13392-13398存在保守的UUUAAAC位点,此位点含有-1位的核糖体翻译移框(frameshift),可引发自单一起始位点的蛋白翻译扩展,即由ORF1a编码的Pp1a(约486kDa)扩展为由ORF1b编…     

SARS灭活病毒免疫兔后IgG特异抗体应答

将灭活的SARS冠状病毒抗原每隔两周多点注射免疫兔,共免疫3次,以观察SARS灭活病毒免疫兔后兔血清中IgG特异性抗体的应答变化。免疫前及第一次免疫后第8、14、21、28、35天耳静脉取血,分离血清。间接ELISA法测得血清中特异性IgG抗体持续升高,并表现出一定的剂量依赖性：第35天G1、G2、G3组血清IgG抗体滴度分别为1：51200、1：49600、1：25600;中和试验测得G1组第28天血清样品中和抗体效价为1：2560;蛋白芯片测得M、N、3CI,、S1、S2、S3、S4等病毒蛋白抗原都可特异性结合抗血清中的IgG抗体,但是不同蛋白抗原结合能力有差别。因此可认为SARS灭活病毒经皮下注射免疫兔后,可诱导全身性IgG抗体应答,产生SARS冠状病毒特异性抗体。