人Six1基因促进肺腺癌细胞A549的增殖

目的:构建带有Flag标签的Six1基因的慢病毒表达载体,并对表达产物Flag-Six1的生物学功能进行初步鉴定。方法:以实验室构建的真核表达载体myc-Six1为模板,根据实验需求合成引物,经PCR扩增,酶切后插入pCDHFlag载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;经Western印迹鉴定无误后,与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染人肺癌细胞A549,经嘌呤霉素筛选2周,收集部分细胞,用Western印迹验证蛋白水平的表达,并通过细胞生长实验检测Six1对A549细胞生长的影响;提取RNA,通过qRT-PCR检测细胞中血管内皮细胞生长因子C(VEGF-C)在mRNA水平的变化。结果:构建的慢病毒表达载体pCDH-Flag-Six1能够在293T细胞中正确表达;包装成慢病毒,感染肺癌细胞A549后可正常表达;生长曲线表明Flag-Six1可促进人肺癌细胞A549的繁殖;qRTPCR结果表明Six1可升高肺癌细胞A549的VEGF-C转录水平。结论:构建了带pCDH-Flag标签的人Six1基因慢病毒表达载体,Flag-Six1能够在肺癌细胞系A549中表达,并能促进细胞增殖,这为进一步研究Six1的生物学功能奠定了重要基础。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究

目的:构建带myc标签的Six1基因的真核表达载体,获得myc-Six1融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法:以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Six1编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,Western印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒与空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果:双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT-PCR结果表明myc-Six1可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论:构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

雌激素受体β真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体（ER）β的哺乳动物细胞表达载体,并检测其转录活性。方法：利用PCR扩增带有Flag标签的人类ERβ全长编码序列,将扩增片段克隆到哺乳动物细胞表达载体pIRESpuro2中,得到重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERβ;用Western blot鉴定Flag-ERβ重组蛋白在人胚肾293T细胞中的表达;用含雌激素应答元件（ERE）的报告基因系统检测Flag-ERβ的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERβ重组质粒,其介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含ERE的报告基因的表达。结论：ERβ高效真核表达载体的构建,为进一步研究ERβ在乳腺癌等疾病中的功能奠定了基础。     

DEK真核表达载体的构建及其对p53启动子活性的影响

目的：构建DEK的pcDNA3-Flag表达载体,研究其对抑癌基因p53启动子活性的影响。方法：以乳腺文库为模板,PCR扩增DEK编码序列,克隆到pcDNA3-Flag载体,构建成pcDNA3-Flag-DEK,转染293T细胞,Western印迹鉴定peDNA3-Flag载体介导的DEK的表达,萤光素酶报告基因活性实验研究DEK对p53启动子活性的影响。结果：双酶切实验证实得到pcDNA3-Flag-DEK阳性克隆;Western印迹实验发现DEK在293T细胞内表达;转录活性实验表明在ZR75-1乳腺癌细胞中,DEK呈剂量依赖性抑制p53启动子的活性。结论：构建了DEK的真核表达载体,并发现此表达载体能在ZR75-1乳腺癌细胞中抑制p53启动子活性。     

人IL-24基因原核表达载体的构建及蛋白的表达纯化

构建人白细胞介素24(IL-24)原核表达载体并利用ELP-Intein系统表达纯化可溶性的IL-24蛋白。通过PCR扩增不含信号肽的人IL-24基因,将IL-24基因插入p ET-ELP-Intein质粒构建重组表达载体p ET-ELP-Intein-IL-24。将重组质粒转化至E.coliBLR(DE3),20℃下经IPTG诱导表达。利用ELP蛋白在不同温度下发生相变的特点和Intein蛋白的自切割反应纯化可溶性IL-24蛋白,将纯化得到的IL-24蛋白进行Western blot鉴定。用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测IL-24蛋白的生物学活性。成功构建了重组表达载体p ET-ELP-Intein-IL-24,第一次通过原核表达方法表达并纯化出了可溶性的IL-24蛋白。Western blot检测显示目的蛋白能与IL-24抗体特异性结合,表明纯化出的蛋白确实为IL-24蛋白。细胞凋亡检测实验证明IL-24蛋白能显著地诱导hep G2细胞发生凋亡。     

Netrin-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建携带有Netrin-1基因的逆转录病毒载体,为研究Netrin-1在神经发育中的作用奠定基础。方法:PCR扩增Netrin-1基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pLXSN;通过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。重组质粒转染PA317包装细胞后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染人脑胶质瘤细胞SW038-C2,经Western blot证明重组病毒在真核细胞内表达Netrin-1的情况。结果:经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pLX-NT。Western blot证明在感染细胞泳道有一特异性条带。结论:成功构建了能表达Netrin-1的慢病毒载体。     

人Six1基因真核表达载体的构建及其生物学功能研究简

目的：构建带myc标签的Sixl基因的真核表达载体,获得myc-Sixl融合蛋白,并对其生物学功能进行初步检测。方法：以本实验室保存的乳腺文库为模板,采用PCR技术扩增Sixl编码序列,将其插入pXJ-40-myc载体,West-ern印迹检测其在人293T细胞中的表达;将重组质粒-9空载体分别转染乳腺癌细胞ZR75-1,通过qRT-PCR检测细胞中VEGF-C在mRNA水平的变化。结果：双酶切和测序结果表明myc-Six1真核表达质粒构建成功;Western印迹证明转染293T细胞后成功表达;qRT—PCR结果表明myc-Sixl可升高乳腺癌细胞ZR75-1的VEGF-C转录水平。结论：构建了带myc标签的Six1表达载体,为进一步研究Six1在乳腺癌转移中的作用奠定了基础。     

果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒构建与表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统构建果蝇硒蛋白dSelK基因重组腺病毒并在AD-293细胞中包装扩增。方法:PCR扩增dSelK目的片段连接到穿梭载体pShuttle-CMV上,用电转化法将线性化的pShuttle-CMV-dSelK穿梭载体转入含腺病毒骨架质粒AdEasy1的BJ5183大肠杆菌电感受态细胞中,构建重组腺病毒载体AdEasy-dSelK,线性化后转染AD-293细胞进行包装,并传代扩增,TCID50法测病毒滴度,Western blot鉴定。结果:成功构建腺病毒载体AdEasy-dSelK,经AD-293细胞包装扩增得到重组腺病毒,滴度为107.5。Western blot鉴定AdEasy-dSelK成功表达。结论:成功构建重组腺病毒载体pAdEasy-dSelK,为硒蛋白功能研究奠定基础。     

TNFalph 和 IL-1bet 靶点抗炎药物筛选细胞模型的构建

目的:构建两个高表达人TNFα和IL-1β细胞系,建立抗炎药物筛选细胞模型。方法:运用PCR的方法从载体pCMVSport-TNFα和p CMVSport-IL1β上扩增目的基因,以亚克隆方法将目的基因分别插入真核表达载体pcDNA3.1和pFLAG-CMV中,用单酶切、PCR扩增和基因测序的方法鉴定重组效果,然后将重组成功的质粒转入HEK293细胞系内,挑选能够稳定表达并遗传的单克隆细胞株,用蛋白免疫印迹(Western blot)法分析其表达效果。结果:三种鉴定方法均显示重组质粒构建成功。Western blot结果显示,细胞株T3、T4均能较高表达炎症因子TNF-α;细胞株I2、I3、I5均能较高表达炎症因子IL-1β。结论:成功构建了TNFα和IL-1β靶标的药物筛选细胞模型,为筛选具有抗炎作用的中药提供了一个新平台。     

MOB2基因在真核细胞中的表达研究

通过RT-PCR从培养的HUVECs中扩增MOB2基因片段,将该片段克隆在真核表达载体pEGFP-C1中,转染NIH3T3细胞,经G418筛选,构建稳定表达细胞系,并用荧光显微镜和Western blot对其进行鉴定。经RT-PCR扩增出734 bp基因片段,经测序分析并与GenBank的DNA序列比对分析后,在NIH3T3细胞中表达。G418筛选后,细胞荧光信号较强,Western blot检测,细胞中的融合蛋白能够与抗MOB2的多抗结合。成功地扩增了HUVECs中的MOB2基因全长cDNA并进行真核表达与鉴定。     

Cloning and expression of the porcine myogenin gene

Abstract

Myogenin is a member of the myoD family of myogenic regulatory factors which direct the initiation of myogenesis during skeletal muscle development. Myogenin is responsible for the differentiation of proliferating myoblasts into myotubes and the absence of this factor results in severe muscular deficiency. Using PCR primers designed from mammalian myogenin sequences, a 215 bp PCR product was amplified from porcine genomic DNA and found to be 89.7% homologous to mouse myogenin. A porcine cosmid library was screened with the myogenin PCR probe and a 6.5 kb portion of a cosmid containing the pig myogenin gene was sequenced. The sequence includes 5´ flanking region, the entire protein coding region composed of three exons and two introns and 3´ flanking region. The protein coding region was highly conserved (≥92.5%) with mouse and human myogenin coding regions. Transfection of pig myogenin into C3H10T1/2 cells, a multipotential fibroblast cell line, resulted in 28% myogenic conversion assayed by cell fusion to form multinucleated cells and synthesis of sarcomeric myosin. These results indicate that the cloned myogenin gene was capable of initiating myogenesis in a fibroblast cell line.     

乳腺癌雌激素受体β不同亚型表达载体的构建及其转录活性分析

目的：构建人乳腺癌中雌激素受体B（ERβ）3种亚型ERβ1、ERβ2和ERβ5的真核表达载体,测定不同亚型ERβ的转录活性。方法：以乳腺癌细胞MCF7的cDNA为模板,PCR扩增ERβ1、ERβ2和ERβ5万基因,分别克隆到pXJ40-Mye载体,Western印迹检测克隆载体在293T细胞内的表达;将上述载体与含雌激素应答元件（ERE）的萤光素酶（Luc）报告基因载体（ERE—luc）共转293T细胞,测定各亚型ER／3的转录活性。结果：构建了Myc—ERβ1、Myc—ERβ2和Mye—ERβ5表达载体,转录活性结果显示上述表达载体均具有活性,雌激素可升高ERβ5的转录活性,不能升高Eβ2和ER5的转录活性。结论：该研究为进-步探讨不同亚型ERβ在乳腺癌中的功能奠定了基础。     

肌肉LIM蛋白增强生肌素对AChRγ启动子的反式激活作用

采用RT PCR技术克隆了大鼠肌肉LIM蛋白 (MLP) 6 40bp的全长cDNA序列 .以此cDNA为探针进行的Northern印迹表明 ,MLP于C2C12细胞在分化的第 3d至第 5d表达 .将MLPcDNA亚克隆至pcDNA3,构建真核表达质粒pcDNA3 MLP ,同时构建AChRγ启动子序列 (96 0bp)调控的荧光素酶报告基因真核表达质粒pGL3 γ .C2C12细胞转染及荧光素酶活性分析表明 ,复合转染pcD NA3 MLP和pGL3 γ的分化肌细胞表达的荧光素酶活性约为对照的 4倍 ;而在 3T3或未分化肌细胞复合转染pcDNA3 MLP和pGL3 γ均未检出报告基因表达 ,说明MLP可促进生肌素对AChRγ亚基基因启动子的反式激活作用 .