定点饱和突变提高Lactobacillus casei L-乳酸脱氢酶对苯丙酮酸的催化效率

【背景】光学纯L-苯乳酸是一种天然防腐剂,也是一种高附加值的手性分子,在食品、制药和材料等领域有广阔的应用前景。本实验室已发现来源于Lactobacillus casei CICIM B1192的NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-LcLDH)可不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸,但其活性较低。为提高L-LcLDH催化苯丙酮酸的催化效率,构建了一个单突变体L-LcLDH~(Q88R),其催化效率kcat/Km是L-LcLDH的4.9倍。【目的】为进一步提高L-LcLDH~(Q88R)催化苯丙酮酸的催化效率,采用饱和突变技术将位于L-LcLDH~(Q88R)底物结合口袋附近的氨基酸残基Ile~(229)随机替换为其他氨基酸,以获得活性更高的优良突变体。【方法】以重组表达质粒p ET-22b-LcldhQ88R为模板,采用全质粒PCR技术对L-LcLDH~(Q88R)基因(LcldhQ88R)中编码Ile~(229)的密码子实施饱和突变,构建突变转化子文库。以催化苯丙酮酸的活性为指标,从文库中筛选出优良的突变转化子。【结果】突变转化子(Escherichia coli/Lcldh~(Q88R/I229Q))表达出一种由Arg和Gln分别替换了Gln88和Ile~(229)的双突变体L-LcLDH~(Q88R/I229Q)。重组表达产物L-LcLDH~(Q88R/I229Q)的酶学性质分析表明:L-LcLDH~(Q88R/I229Q)的比活性是L-LcLDH的18.5倍,是L-LcLDH~(Q88R)的2.3倍;其催化效率分别为后两者的6.8倍和1.4倍。L-LcLDH突变前后的温度和pH特性改变不大。根据分子对接结果推测出,双突变Q88R/I229Q导致L-LcLDH的底物结合口袋的入口变大和构型的变化可能对其催化活性的提高发挥了重要作用。【结论】双突变Q88R/I229Q显著提高了L-LcLDH的活性和催化效率,使得L-LcLDH~(Q88R/I229Q)在不对称还原苯丙酮酸制备L-苯乳酸中成为有潜力的工具酶。     

硫酸锌(ZnSO4)对米根霉发酵产乳酸的影响

[目的]为了了解无机盐与米根霉L-乳酸代谢之间的关系,提高米根霉菌株RLC41-6发酵产L-乳酸的产率与质量,研究了ZnSO4浓度与菌株乳酸代谢和细胞内乳酸脱氢酶活性的关系.[方法]在米根霉培养基中加入不同浓度ZnSO4,经过36℃培养36 h后,应用HPLC-反相色谱法测定产物中的L-乳酸含量,并利用活性PAGE分析法测定细胞内乳酸脱氢酶的活性和组成.[结果]实验结果显示,ZnSO4对除LDH1之外的其它几条同工酶都有促进作用,尤其对LDH4,LDH5作用明显,当ZnSO4浓度大于0.02％时,LDH4,LDH5达到最大水平,同时高浓度的锌离子在体外抑制了LDH的活性.当ZnSO4浓度为0.02％时LDH酶活达到最大200 U/mL,HPLC图谱表明,此时发酵产物的只有L-乳酸,且产量达到最大137g/L,乳酸转化率为91％.[结论]Zn+会影响米根霉的乳酸代谢过程,并导致发酵过程中产物类型的变化,合适浓度的ZnSO4在米根霉代谢产乳酸的过程中,提高了乳酸脱氢酶LDH的表达,抑制丙酮酸进入苹果酸和富马酸途径,从而有利于提高葡萄糖到乳酸的代谢.     

代谢工程大肠杆菌利用甘油高效合成L-乳酸

以甘油为碳源高效合成L-乳酸有助于推进油脂水解产业和生物可降解材料制造业的共同发展。为此,首先分别从凝结芽胞杆菌Bacillus coagulans CICIM B1821和大肠杆菌Escherichia coli CICIM B0013中克隆了L-乳酸脱氢酶基因BcoaLDH和D-乳酸脱氢酶 (LdhA) 的启动子片段PldhA。将两条DNA片段连接组成了表达盒PldhA-BcoaLDH。然后将上述表达盒通过同源重组删除FMN为辅酶的L-乳酸脱氢酶编码基因lldD的同时克隆入ldhA基因缺失菌株E. coli CICIM B0013-080C (ack-pta pps pflB dld poxB adhE frdA ldhA)的染色体上,获得了L-乳酸高产菌株E. coli CICIM B0013-090B (B0013-080C,lldD::PldhA-BcoaLDH)。考察了菌株CICIM B0013-090B不同培养温度下代谢利用甘油和合成L-乳酸的特征后,建立并优化了一种新型L-乳酸变温发酵工艺。在7 L发酵罐上,发酵27 h,积累L-乳酸132.4 g/L,产酸强度4.90 g/(L·h),甘油到L-乳酸的得率为93.7％,L-乳酸的光学纯度达到99.95％。     

大肠杆菌全细胞转化联产L-2-氨基丁酸和D-葡萄糖酸

以大肠杆菌BL21(DE3)为表达宿主,构建两株分别表达L-苏氨酸脱氨酶(LTD,基因来源大肠杆菌)和共表达亮氨酸脱氢酶(LDH,来源蜡样芽孢杆菌)/葡萄糖脱氢酶(GDH,来源枯草芽孢杆菌)的重组大肠杆菌,在此基础上,构建了一种以L-苏氨酸和D-葡萄糖为底物联产L-2-氨基丁酸(L-ABA)和D-葡萄糖酸的全细胞转化系统。通过转化条件(温度、p H、细胞通透性和菌体量)优化,并采用分批补料策略,164 g/L L-苏氨酸和248 g/L D-葡萄糖最终转化得到141.6 g/L的L-ABA和269.4 g/L的D-葡萄糖酸,时空得率分别达到7.1 g/(L?h)和13.5 g/(L?h),得率超过99%。本研究使用价格低廉的大宗化学品高效率生产出有较高附加值的产物,全细胞转化系统无需额外添加昂贵的辅酶,更适用于工业化生产。     

亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸北大核心CSCD

【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。     

L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌BL-21(DE3)中的表达

为了在大肠杆菌中构建利用葡萄糖生产L-乳酸的途径,以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LA - 04 -01基因组为模板,设计引物扩增L-乳酸脱氢酶基因L-ldh.将该基因连接到表达栽体pET-28a(+)上,并转化大肠杆菌Top10.通过卡那霉素抗性平板筛选,提取重组质粒pET28a-L-ldh并测序,结果正确.将pET28a-L-ldh转化大肠杆菌BL-21( DE3),通过卡那霉素抗性平板筛选,得到产乳酸的大肠杆菌基因工程菌.经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳,检测到目的蛋白条带,L-乳酸脱氢酶比酶活力达到9.44 U/mL.该基因工程菌通过摇瓶发酵,L-乳酸产量达到3 g/L,成功构建出一条在大肠杆菌中生产L-乳酸的新途径.     

利用五碳糖产高纯度L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

[目的]本研究以已敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)乙醇工程菌SZ470(△frdBC △ldhA △ackA △focA-pflB △pdhR::pflBp6-pflBrbs-aceEF-lpd)为起始菌株,进一步敲除其乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)基因,同时插入带有自身启动子的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,LLDH)基因,构建可利用五碳糖同型发酵L-乳酸重组大肠杆菌.[方法]利用λ噬菌体Red重组系统构建乙醇脱氢酶基因(adhE)缺失菌株Escherichia coli JH01,并克隆P.acidilactici的ldhL基因,利用染色体插入技术将其整合到JH01基因组,构建产L-乳酸大肠杆菌基因工程菌Escherichia coli JH12,利用无氧发酵15 L发酵罐测定重组菌株L-乳酸产量.[结果]工程菌JH12在15 L发酵罐中以6％的葡萄糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为1.46 g/(L·h),乳酸生产强度为1.14 g/(L·h),乳酸的产量达到41.13 g/L.发酵产物中未检测到琥珀酸、甲酸的生成,仅有少量乙酸生成,L-乳酸纯度达95.69％(L-乳酸在总发酵产物的比率).工程菌JH12以6％的木糖为碳源进行发酵,发酵到36 h的过程中葡萄糖的消耗速率为0.88 g/(L·h),乳酸生产强度为0.60 g/(L·h),乳酸的产量达到34.73 g/L.发酵产物中杂酸少,乳酸的纯度高达98％.[结论]本研究通过基因敲除、染色体插入及无氧进化筛选获得一株产L-乳酸的大肠杆菌工程菌JH12,该菌株不需利用外源质粒,稳定性好,可利用五碳糖进行发酵,发酵产物中杂酸少,L-乳酸的纯度高.本研究为L-乳酸大肠杆菌工程菌的构建提供一定的技术支持,同时也为大肠杆菌L-乳酸的工业化生产提供了参考依据.     

代谢工程改造野生耐酸酵母生产L-乳酸

以选育低pH条件下高产L-乳酸的酵母菌为目的,从自然样品中筛选分离得到一株能在pH 2.5 (乳酸调节) 的培养基中生长且不利用乳酸的酵母 (初步鉴定为木兰假丝酵母Candida magnolia);进一步将来源于米根霉As3.819的乳酸脱氢酶编码基因 (ldhA) 插入含有G418抗性基因的酵母穿梭载体,构建了重组质粒pYX212-kanMX-ldhA,电转化入野生型C. magnolia中,筛选获得了一株具有产L-乳酸能力的重组菌株C. magnolia-2;通过发酵实验表明,该重组菌产L-乳酸的最     

丙酮丁醇梭菌ldhL基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

首次从丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum ATCC824)中克隆得到L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,ldhL)基因,并将其连接到pSE380表达载体上,得到重组质粒pSE380ldhL,将重组质粒转化到乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJl44大肠杆菌中进行表达。SDS-PAGE分析表达产物的分子量约为34kD,摇瓶发酵后用HPLC检测分析L-乳酸产量为2.4g/L,纯度达到99.9%,不需要再进行手性分离,为以后在工业上生物法生产高纯度的L-乳酸打下基础。     

利用定点突变改变树干毕赤酵母(Pichia stipitis)木糖醇脱氢酶辅酶特性的研究

在酿酒酵母中同时表达木糖还原酶基因(xyl1)和木糖醇脱氢酶基因(xyl2)可使酿酒酵母利用木糖发酵生成乙醇.但由于两种酶所依赖的辅酶不同导致酿酒酵母细胞内氧化还原失衡,致使中间产物大量积累,降低了乙醇产率.本研究从树干毕赤酵母中克隆了木糖醇脱氢酶基因,通过与银叶粉虱山梨醇脱氢酶[其活性依赖NADP+(H)]序列进行对...     

马肝醇脱氢酶催化有机硅酮不对称还原反应动力学

探讨了马肝醇脱氢酶(HLADH)催化三甲基硅乙酮及其碳结构类似物不对称还原反应动力学.结果表明,在酶浓度低于150 mg/L时,底物浓度与反应初速度的关系符合米氏动力学方程;HLADH催化三甲基硅乙酮不对称还原反应的K_m、v_max和E_a分别为2.67 mmol/L、0.118 mmol/(L·min·mg)和37 kJ/mol, 其碳结构类似物的相应值分别为3.56 mmol/L、0.084 mmol/(L·min·mg)和61 kJ/mol.     

混合碳源流加对重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的影响

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(PGL)的产量和生产强度,在诱导期采用多种碳源与甲醇混合添加的模式。实验结果发现:甘油、山梨醇、乳酸与甲醇的混合添加均可以提高PGL的产量,其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著。研究表明,通过双碳源混合流加可以提高细胞活力,增强醇氧化酶活力,提高毕赤酵母表达外源蛋白效率。当山梨醇的流速为3.6g/(h·L)时,PGL酶活可达1593U/mL,生产强度为16.7U/(mL·h),比对照分别提高了84.6%和45.2%,实现了碱性果胶酶的高效生产。     

恒细胞密度发酵策略提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的表达效率

为了提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(Alkaline polygalacturonate lyase,PGL)的比速率,开发了一种新的恒细胞密度发酵策略。通过不同的甲醇流加方式,实现发酵过程细胞密度的合理控制。实验结果表明:控制细胞密度为75 g/L的策略为最优,最终单位发酵液体积生产强度和单位菌体生产强度为6.11 U/(mL.h)和81.5 U/(g.h),分别比传统高密度发酵提高了42.1%和191.2%,最终PGL酶活为441.9 U/mL。此外,该策略还具有提高细胞活性和降低蛋白酶降解作用等优势。     

阿维菌素起始酰基转移酶的底物特异性

[背景]阿维菌素起始酰基转移酶(AveAT0)能够以2-甲基丁酰-辅酶A (coenzyme A,CoA)和异丁酰-CoA作为起始单元分别合成"a"系列或"b"系列的阿维菌素。[目的]探究AveAT0对两种底物的偏好性并进行改造。[方法]通过与识别不同底物的起始酰基转移酶(loading acyltransferases,AT0s)进行序列比对,找到AveAT0底物结合重要的氨基酸,利用活性位点定点突变的方法得到对底物偏好性改变的特定突变体。以2-甲基丁酰-CoA、异丁酰-CoA的类似物2-甲基丁酰-N-乙酰半胱氨(N-acetylcysteamine,SNAC)和异丁酰-SNAC为底物,用Ellman测试法检测释放SNAC的游离巯基(sulfhydryl,SH),测定AveAT0及其突变体的动力学常数,以此表征AveAT0及其突变体的底物偏好性。[结果]AveAT0对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.4 mmol/L,kcat值为14.1 min^-1,kcat/Km为32.1 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为6.4 min^-1,kcat/Km为7.5 L/(mmol·min)。选定的突变位点为V224M、Q149L、L121M。按顺序累积突变后发现三突变株AveAT0 V224M/Q149L/L121M对两个底物的偏好性区别最大,对2-甲基丁酰SNAC的Km值为0.8 mmol/L,kcat值为5.4 min^-1,kcat/Km为6.9 L/(mmol·min);对异丁酰-SNAC的kcat/Km为0.1 L/(mmol·min)。[结论]研究发现了AveAT0识别底物过程中的关键氨基酸,为改造阿维菌素聚酮合酶酰基转移酶提供了依据。     

外源添加代谢中间体对产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵制备丁二酸的影响

考察了外源添加中间代谢产物对菌体生长及发酵产酸的影响,结果表明添加0.5g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时丁二酸产量最高。围绕产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通量分析,发现添加PEP后己糖磷酸途径(HMP)与糖酵解途径(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6,解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾,导致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%,丁二酸代谢通量从99.8mmol/(gDCW·h)增至124.4mmol/(gDCW·h),而副产物乙酸及甲酸的代谢通量分别降低了22.9%、15.4%;关键酶活分析结果表明,添加0.5g/LPEP后PEP羧化激酶比酶活达到1910U/mg,与对照相比提高了74.7%,而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最终丁二酸浓度为29.1g/L,收率达到76.2%,比未添加PEP时提高了11.0%。     

循环利用重组大肠杆菌细胞转化合成丁二酸

研究了回收丁二酸发酵液中的大肠杆菌进行细胞转化的可行性,以转化率和生产效率为指标,考察了不同菌体浓度、底物浓度、pH调节剂对细胞转化的影响。发酵结果表明大肠杆菌可以在仅含有葡萄糖和pH调节剂的水环境中转化生产丁二酸,并确定了最佳的转化条件为:细胞浓度(OD600)50,底物浓度40g/L,缓冲盐为MgCO3。基于优化好的条件,在7L发酵罐中进行重复批次转化,第1次转化的转化率和生产效率分别达到91%和3.22g/(L·h),第2次转化的生产效率和转化率达到了86%和2.04g/(L·h),第3次转化的转化率和生产效率分别达到了83%和1.82g/(L·h)。     

不同磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻生长和碳水化合物积累的影响

【目的】为了研究不同磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻(Desmodesmus insignis)生长与碳水化合物积累的影响,本实验以改良BG11培养基为基础,设计了8种不同初始K_2HPO_4浓度、8种不同初始MgSO_4浓度及4种二氧化碳浓度培养标志链带藻。【方法】采用干重法和苯酚-硫酸法分别测定其生物质浓度与总碳水化合物的含量。【结果】实验结果显示,在高磷浓度(0.460 mmol/L)下生物量达到最高为6.37 g/L,磷浓度为0.230 mmol/L (对照组)时总碳水化合物含量及单位体积产率达到最高,分别为45.40%(%干重)和0.20 g/(L·d)。不同初始MgSO_4浓度实验结果显示,高硫浓度有利于标志链带藻生长及碳水化合物的积累,生物量、总碳水化合物含量及单位体积产率分别在硫浓度为1.217 mmol/L、0.609 mmol/L和1.824 mmol/L时达到最高,分别为7.02 g/L、51.6%(%干重)及0.26 g/(L·d)。当二氧化碳浓度为3%(V/V)时,标志链带藻生物量、总碳水化合物含量及单位体积产率均达到最高,分别为6.81 g/L、44.03%和0.20 g/(L·d)。【结论】因此,磷浓度为0.230 mmol/L、硫浓度为1.824 mmol/L和二氧化碳浓度为3%时最有利于标志链带藻生长及碳水化合物的积累。     

化学改性甘蔗渣对固定化细胞发酵产丁醇的影响

旨在研究化学改性的甘蔗渣作为固定化载体对丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum XY16发酵制备生物丁醇的影响。首先利用不同浓度的聚乙烯亚胺(PEI)和1 g/L戊二醛(GA)对甘蔗渣表面进行化学改性,增强甘蔗渣对Clostridium acetobutylicum XY16的附载能力。经4 g/L聚乙烯亚胺和1 g/L戊二醛改性的甘蔗渣(添加量10 g/L)应用到固定化批次发酵中,发酵36 h后丁醇和总溶剂浓度最高,分别达到了12.24 g/L和21.67 g/L,同时溶剂的生产速率达到0.60 g/(L·h),生产速率比游离细胞和未改性甘蔗渣固定化细胞分批发酵分别提高了130.8%和66.7%。在此基础上对改性甘蔗渣固定化的细胞进行6次重复批次发酵,丁醇和总溶剂的产量稳定,溶剂生产速率逐渐提高至0.83 g/(L·h),同时转化率也提高至0.42 g/g。     

双碳源流加对重组毕赤酵母高效表达葡萄糖氧化酶的影响

葡萄糖氧化酶(GOD)是一种具有广泛应用前景的工业酶.为了实现葡萄糖氧化酶的高效生产,提高重组毕赤酵母生产GOD的产量和增强生产强度,对重组毕赤酵母诱导阶段的初始菌体浓度和甲醇浓度进行了优化.在此基础上,诱导期采用了双碳源(甘油、山梨醇和甘露醇)与甲醇混合流加的模式.研究发现,最佳诱导前初始菌体浓度和甲醇浓度分别为100 g/L和18 g/L,此时GOD产量为427.6 U/mL.在诱导阶段采用甘油、山梨醇和甘露醇与甲醇的混合添加均可以提高GOD产量,其中甘露醇与甲醇的混合流加效果最为显著.当甲醇与甘露醇混合流加的比例为20∶1(W/W)时,诱导156h GOD产量和生产强度分别可达711.3 U/mL和4.60 U/(mL·h),比甲醇单一流加策略结果分别提高了66.3％和67.9％.此外采用合适的甘露醇混合流加策略不但不会抑制AOX1启动子的表达,甚至有一定促进作用,AOX酶活性为8.8 U/g(对照为5.2 U/g).双碳源流加方式还能推广到毕赤酵母其他表型中,为该系统高效表达外源蛋白提供一种新策略.