拟南芥酪蛋白激酶1A的原核表达及纯化

拟南芥酪蛋白激酶1A(Arabidopsis casein kinase 1A,At CK1A)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其可能参与了蓝光信号转导并调控植物开花时间。通过对At CK1A的全长序列进行生物信息学分析得到了其激酶区;采用RT-PCR的方法从拟南芥c DNA中扩增At CK1A激酶区,并构建至p ET28a原核表达载体;将表达载体导入BL21(DE3)菌株后,经IPTG诱导表达和Ni亲和层析、阳离子交换层析以及凝胶过滤层析纯化,得到高纯度的重组蛋白;最后利用His标签抗体对重组蛋白进行了验证。     

人生长激素基因的cDNA克隆,原核高效表达及纯化

用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从含有全长人生长激素（ＨＧＨ）基因的ＣＨＯ细胞中获得ｈｇｈ的ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＥＴ－１１ｂ载体中,在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占菌体蛋白总量的２０％。经色谱纯化后,纯度大于９５％。     

人催乳素受体胞外区蛋白的原核表达及纯化

目的:建立人催乳素受体的原核表达系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:由RT-PCR获得人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)胞外区氨基酸的编码序列,扩增并通过酶切位点修饰后克隆至pMD18-T载体,经测序正确后,切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-2中,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),用IPTG诱导重组工程菌表达,使用谷胱甘肽偶联的GSTrapFF柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-hPRLR融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量为37.6×103处有一条带。结论:利用大肠杆菌表达系统获得了较高纯度的GST-hPRLR融合蛋白,为进一步研究催乳素受体的功能和制备特异性的抗体奠定了基础。     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

小麦TaMAPK2激酶基因的原核表达以及多克隆抗体制备

MAPK蛋白激酶是一类重要的植物胁迫信号调控因子.为了研究小麦MAPK基因的功能,苯试验克隆了小麦MAPK蛋白激酶基因TaMAPK2.为了制备TaMAPK2基因的多克隆抗体,TaMAPK2的非保守区段的DNA序列anti-MAPK2被构建到原核表达载体 pET-28a-(+)上,表达融合蛋白His-antiMAPK2.在终浓度为1 mmol/L IPTG诱导1h的条件下,融合蛋白His-antiMAPK2表达量达到最大.通过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)得到纯化的His-antiMAPK2融合蛋白.利用新西兰大白兔制备了TaMAPK2基因的多克隆抗体,ELISA竞争抑制法检测抗体效价检测,效价为1:80000,能满足后续试验要求的效价值,为进一步分析TaMAPK2的蛋白定位、表达等提供基础.     

结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742克隆表达及纯化

Rv2742是本课题组前期基于蛋白质基因组学策略从结核分枝杆菌Mycobacteriumtuberculosis H37Rv中发现、鉴定的遗漏注释基因。文中旨在建立结核分枝杆菌H37Rv漏注释蛋白Rv2742的可溶性诱导表达、纯化体系,为进一步探索Rv2742基因参与的生物学功能奠定基础。前期实验发现构建的pGEX-4T-2-Rv2742、pET-28a-Rv2742、pET-32a-Rv2742及pMAL-c2X-Rv2742原核表达载体均无法实现目的蛋白的诱导表达。但经密码子优化后,仅有pMAL-c2X-Rv2742载体能够实现目的蛋白的可溶性诱导表达。此外,通过比较不同宿主菌、温度及IPTG浓度对目的蛋白表达量的影响,发现目的蛋白在Rosetta (DE3)中,16℃及0.5mmol/LIPTG诱导条件下表达量最高。直链淀粉树脂(Amyloseresin)亲和层析柱纯化获得较纯的产物,经LC-MS/MS验证确认是Rv2742融合蛋白肽段序列。成功获得结核分枝杆菌H37Rv新基因Rv2742的重组蛋白,可进一步开展其潜在相互作用及免疫原性研究工作。     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

人Aurora B基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

目的:克隆出人AuroraB基因,并将其于大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株中表达,获得重组蛋白.方法:利用TRIzol Reagent 法提取食管癌ECa 109细胞总RNA,RT-PCR后以其cDNA为模板PCR扩增Aurora B基因,构建pET 28a(+)-Aurora B重组质粒,将其转化Rosetta(DE3)菌株,IPTG体外诱导表达重组蛋白.利用生物信息学工具对Aurora B的核酸序列和蛋白功能结构进行分析.结果:成功构建了pET 28a(+)-AuroraB重组质粒,经序列比对,与GenBank上公布的人Aurora B基因序列同源性达到了99％;获得AuroraB蛋白,大小约39kDa,蛋白表达量约占菌体总蛋白的28％.结论:对人AuroraB基因进行克隆、原核表达及生物信息学分析,为深入研究Aurora B在细胞周期调控中的作用机制及后续Aurora B抑制剂的体外筛选奠定基础.     

GA2ox1氧化酶基因的克隆及原核表达

采用RT-PCR从拟南芥基因组中克隆到GA2ox1基因,通过Gateway克隆技术构建原核重组表达载体pDEST17-GA2ox1,并转化大肠杆菌BL(21)star,对蛋白原核表达条件进行优化.结果表明,最佳表达条件为温度30℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导6 h.蛋白表达形式为包涵体,与Biotech对GA2ox1基因在大肠杆菌中的表达情况推测的结论一致.重组蛋白分子质量约为40 kD,经Ni Sepharose亲和层析柱纯化和Western blot鉴定得纯度90%以上的GA2ox1重组蛋白.研究结果为GA2ox1抗体制备及蛋白功能的进一步研究奠定了基础.     

人核受体Nurr1基因的克隆和表达及产物纯化(英文)

核受体相关因子 1(nuclearreceptor relatedfactor 1,Nurr1)是主要表达于中脑黑质及腹侧被盖区多巴胺能神经元的一种转录因子 ,属于核受体超家族成员 ,其功能性配体尚未被确认 .研究表明 ,Nurr1对中脑多巴胺神经元的发育、存活以及成熟后功能的维持具有特殊重要意义 .如能找到它的特异性配体 ,将为最终筛选出治疗帕金森病等中枢多巴胺失调性疾病的药物或化学合成先导物打下基础 .为了获取Nurr1蛋白以标定其配体以及研究蛋白质间的相互作用 ,采用RT PCR技术 ,从人胚中脑组织特异性扩增及克隆了人Nurr1cDNA ,并获得一个在氨基端缺失 35 0bp碱基的Nurr1突变体 .将正常的Nurr1基因片段亚克隆至表达载体pET2 8a ,分别在TNTRT7偶联网织红细胞溶胞系统和大肠杆菌BL2 1(DE3)中获得表达 ,均以可溶性形式存在 ,且产自于体外转录 翻译系统的真核表达Nurr1蛋白已标记上同位素3 5S .Western印迹分析表明 ,所表达的重组目的蛋白具有特异的免疫反应性 .经Ni NTA亲和层析 ,得到了初步纯化的rhNurr1蛋白 .     

羽衣甘蓝类蛋白质二硫键异构酶PDIL1-2的基因克隆及蛋白表达分析

以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala）自交不亲和系（S13-bS13-b）为试材,利用RT-PCR和RACE的方法从柱头中分离类蛋白质二硫键异构酶BoPDIL1-2基因。将BoPDIL1-2编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到大肠杆菌中进行原核表达与纯化;用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备BoPDIL1-2多克隆抗体;通过免疫印迹法检测BoPDIL1-2在不同组织及不同发育阶段柱头的表达情况。氨基酸序列比对分析结果显示,羽衣甘蓝BoPDIL1-2与油菜BnPDIL1-2、拟南芥AtPDIL1-2的一致性分别是97.3%和85.5%。SDS-PAGE结果显示,在分子量58 kD处有BoPDIL1-2蛋白特异性地诱导表达。免疫印迹结果显示BoPDIL1-2在羽衣甘蓝柱头中特异表达,而且在柱头发育早期表达量较低,在开花期柱头表达量较高。     

羽衣甘蓝柱头酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

目的:构建应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝柱头cDNA文库。方法:以羽衣甘蓝S13-bS13-b自交不亲和系为材料,提取柱头的总RNA,用亲和层析法分离纯化mRNA,利用CytoTrapXR建库试剂盒构建羽衣甘蓝柱头cDNA文库。结果:羽衣甘蓝柱头cDNA原始文库的库容量为2.5×105;扩增后文库的库容量约为4×108,重组率为96%,插入片段大小为0.4～3kb,平均长度在0.8kb左右。结论:构建了应用于酵母双杂交系统的羽衣甘蓝自交不亲和系柱头的cDNA文库,为探讨芸苔属植物自交不亲和的分子机理奠定了基础。     

羽衣甘蓝种子主要品质性状的表现及其相关性

随机挑选148份羽衣甘蓝种质资源和高世代材料,分析了成熟种子的含油量、蛋白质、硫苷和7种主要脂肪酸成分的表现特征及其相关性。结果表明:羽衣甘蓝成熟种子平均含油量为29.48%,平均蛋白质含量为45.13%,含油量和蛋白质总量为74.61%。硫苷含量的变幅最大,变异系数为31.72%。7种主要脂肪酸成分中,油酸和芥酸的含量较高,其次为亚油酸,棕榈酸和硬脂酸的含量较低。除硫苷含量和硬脂酸含量外,其余9个性状的表现均呈单峰正态分布。相关性分析表明,大多数性状间都具有显著或极显著的相关性,这与对甘蓝型、白菜型和芥菜型3种类型油菜的研究结果相一致。在羽衣甘蓝中存在一些优异的种质资源,通过筛选可以在油菜优质育种中加以利用。     

激光、高压静电场克服羽衣甘蓝自交不亲和及其分子机制的研究

利用激光、高压静电场对自交不亲和的羽衣甘蓝的花粉进行处理,以期克服其自交不亲和。通过对处理后的花粉的表面结构和蛋白酶活性及其萌发情况的研究,进一步分析激光、高压静电场的生物效应。同时利用分子生物学手段Northern杂交技术,检测了经激光、高压静电场处理的花粉,在授粉后柱头上SLG和SRK基因表达的差异,以探讨激光、高压静电场对生殖反应作用的分子机制。结果表明:通过适宜剂量的激光、高压静电场处理,羽衣甘蓝的花粉萌发率提高,成熟花粉水溶性总蛋白,α-淀粉酶活力,总淀粉酶活力均不同程度的提高,同时自交亲和指数和结籽率提高。从花粉的表面结构的电镜显微观察分析,花粉壁的雕纹受到了伤害,网脊线有轻微断裂,网眼变大。授粉后,取不同时间间隔的柱头样品提取总RNA,利用Northern杂交技术检测SLG和SRK基因的表达量,授粉后24 h激光处理和高压静电场处理与对照比较,SLG和SRK基因的表达量均降低。     

几种影响羽衣甘蓝小孢子胚状体成苗的因素

羽衣甘蓝成熟小孢子胚转到固体培养基上可直接萌发成苗。成苗率与基因型、培养基成分和培养温度有关。MS+1.0%琼脂+3%蔗糖是适宜的成苗培养基;100MG·L-1活性炭对鱼雷形胚成苗起促进作用;10℃低温培养10D可提高成苗率。     

羽衣甘蓝花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育观察

采用常规压片法对羽衣甘蓝花粉母细胞减数分裂及雄配子体发育进行了细胞学观察,结果显示:羽衣甘蓝减数分裂类似甘蓝种,细胞质分裂为同时型,四分体以正四面体型或十字交叉型为主;终变期有9个二价体,此时可进行染色体计数;中期Ⅰ和Ⅱ少数细胞中可见赤道板外染色体,后期Ⅰ和Ⅱ存在落后染色体,四分体时期可观察到少量含微核的异常四分体;单核靠边期时花蕾长度约为2.0~2.2 mm,小孢子经过发育最终成为3-细胞型花粉并具3个萌发孔,成熟花粉中败育花粉比率为1.3%.     

羽衣甘蓝SEPALLATA-like基因的系统发育与表达分析

E类MADS-box基因SEPALLATA (SEP)-like在被子植物生殖生长特别是花器官发育方面具有重要作用。为分析羽衣甘蓝E功能MADS-box基因SEP-like基因的序列特征及其在花发育过程中的时空表达模式,以羽衣甘蓝品系‘14 line’为试材,利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了SEP直系同源基因BroaSEP1/2/3 (GenBank登录号:KC967957、KC967958、KC967960)。序列和系统进化树分析表明,这3个基因分别与野甘蓝(Brassica oleracea var. oleracea)、芜菁Brassica rapa、萝卜Raphanus sativus、甘蓝型油菜Brassica napus的SEP1、SEP2、SEP3基因具有很高的同源性。推导的氨基酸序列显示,这些基因编码的蛋白质都包含高度保守的MADS结构域、I结构域和K结构域,每一基因都有其亚家族特异的C-末端功能域SEPⅠ和SEPⅡ基序。BroaSEP1、BroaSEP2、BroaSEP3基因的开放阅读框长...     

结球甘蓝和青花菜小孢子胚植株再生

结球甘蓝（Brassica oleracea var.capitata）和青花菜（Brassica oleracea var.italica）小孢子胚再生植株频率低是目前影响游离小孢子培养技术有效应用的关键问题之一,研究其小孢子胚植株再生频率的影响因素,提高胚再生植株频率,对促进游离小孢子培养技术在甘蓝类蔬菜育种中更好地应用具有重要意义。该文以结球甘蓝中甘11和青花菜TI-111等基因型为试材,对影响游离小孢子胚再生成植株的固体培养基类型、琼脂浓度、胚的类型及胚在液体培养基中的滞留时间等因素进行了研究。结果表明：游离小孢子培养25天的子叶胚在琼脂浓度为1%–1.25%的B5培养基上植株再生频率最高。进一步通过8个不同基因型对上述实验结果进行了验证,结果显示,游离小孢子培养25天的子叶胚在1%琼脂浓度的B5培养基上植株再生频率达77.8%–97.2%。     

羽衣甘蓝授粉过程中柱头蛋白质的泛素化

分析自花授粉与异花授粉后的羽衣甘蓝柱头蛋白质泛素化变化的结果表明,自花授粉30min后的柱头蛋白质泛素化水平显著增加,45min时达到峰值;异花授粉的柱头蛋白质泛素化水平没有变化。     

羽衣甘蓝BoMAPK4原核表达、抗体制备及蛋白表达分析

以羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala）自交不亲和系（S_13-bS_13-b ）为材料,提取柱头RNA,利用RT-PCR分离羽衣甘蓝柱头丝裂原活化蛋白激酶4（MAPK4）基因。结果表明：获得的BoMAPK4 cDNA含有一个 1 122 bp开放阅读框,编码373个氨基酸,具有丝氨酸/苏氨酸结构域,无信号肽和跨膜结构。羽衣甘蓝BoMAPK4与油菜（B. napus）BnMAPK4、芜菁（B. rapa）BrMAPK4、拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtMAPK4的氨基酸序列一致性分别为99.7%、99.5%、95.4%。将BoMAPK4编码区的序列构建到原核表达载体pET-14b上,并转化到BL21（DE3）大肠杆菌（Escherichia coli）中进行原核表达。SDS-PAGE结果显示,在分子量大小约45 kDa处有BoMAPK4重组蛋白特异性表达。利用亲和层析的方法获得高纯度的重组BoMAPK4蛋白。利用获得的重组BoMAPK4蛋白免疫小鼠,制备BoMAPK4的多克隆抗体。提取羽衣甘蓝萼片、花瓣、花药、柱头、花柱和子房的总蛋白,利用免疫印迹的方法进行蛋白表达检测,结果发现BoMAPK4在花瓣、花药和子房中表达的较少,在萼片和花柱中表达的较多,在柱头中的表达量最高。这些研究为探讨BoMAPK4的生物学功能奠定了基础。