新疆大麦条纹花叶病毒的研究——Ⅰ.病毒株系类型的鉴定及核酸的体外翻译

我国大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆分离物的RNA,在50％甲酰胺6％甲醛中,50℃处理15分钟,使RNA分子链呈真正的均一状态后,在含甲醛的琼脂糖凝胶上电泳,核酸变性电泳结果显示该病毒为三组分RNA株系,编号为RNA_1,RNA_2,RNA_3,分子量分别为1.40—1.44×10~(?),1.20—1.28×10~0,1.06—1.09×10~6。经制备凝胶电泳分离出的各RNA组分在兔网织红细胞溶胞液的无细胞体系中,RNA_1的翻译产物为120K的蛋白,RNA_2翻译产物主要为25K和一个85K蛋白,其中25K蛋白由于与天然BSMV外壳蛋白共电泳,该蛋白中没有甲硫氨酸,以及能被BSMV抗血清沉淀,而被确定为BSMV外壳蛋白。RNA_3的翻译产物为75K蛋白。     

关于TMV外壳蛋白质信使RNA的分离及其体外翻译产物分析的初步研究

从感染TMV普通株的烟叶中提取总RNA,并经Sepharose 6B层析分部得到7个分部。各分部中各种RNA的分布情况用凝胶电泳检查,当在含[14C]-蛋白质水解液小麦胚无细胞保温液中加入病叶总RNA或层析后得到的IV分部的RNA时,在凝胶电泳放射自显影图谱上出现放射性相当强的带,该带之泳动率与[14C]-标记的天然TMV外壳蛋白质相同。加入病毒颗粒的RNA或用甲醛处理的病毒颗粒RNA就不出现。在同样条件下,改用[9H]-组氨酸代替[14C]-蛋白质水解液,在荧光放射目显影图谱上此带也不出现。因此认为此带即是新合成的TMV外壳蛋白。凝胶电泳图谱表明,IV分部是低分子量RNA富集的一个分部,其中RNA,和RNA．可能相当前人报道的LMC。值得注意的是,用不连续的凝胶电泳IV分部,RNA,和RNA,给出7个带,似乎LMC区是个复杂的多分散的区域,究竟耶个带才真正是TMV外壳蛋白质的mRNA,有待进一步研究。     

从不同植物上来的几个烟草花叶病毒分离物的初步比较研究

试验比较了油菜花叶病15号分离物(YMV15),地黄退化病(DDV)分离物,毛白楊球状丛生(PV)的分离物以及烟草花叶病毒(TMVl)在寄主反应、体外抗性和血清学方面的异同。三个分离物和TMv-在心叶烟,普通烟等鉴定寄主有相似的反应,但是它们在另一些寄主上的反应又有显著的差别。例如,只有YMVt5能侵染油菜和白菜;YMV-s和DDV在菜豆上不就产生局部斑点,而TMV。和’PV却与TMv的大多数毒株一样有此反应。YMvB和DDv在卓前的接种叶上产生枯斑反应,而’rMVi和Pv且¨不表现病状。三个分离物都和TMvl一样极易通过机械接种传染而不能借桃蚜传染;井且具有相近TMV-的稀释限度(10一L一10“),但致死温度TMV-和Pv为92~(3及90℃,而YM’V15和DDV均为86qc。四个分离物的抗血清都有交互的血清沉淀反应。但YMVls与DDV之嗣的反应鞍强,TMVt与PV的反应亦较强。在交互吸收试验中证明YMVt,与DDV的抗血清中有较多的共同抗体,而TMvl与PV的抗血清中亦有较多的共同抗体。交互血清反应,寄主范围,体外抗性,传染方法,都指出它们是FMV的毒株。TMVl极接近于国外TMV的普通株,PV近似黄化奥古巴花叶毒株,YMVL15有些象Holmes的卓前株。作为TMV毒株的最大特点是它们来自与烟草相距极远的植物,因此探讨这些毒株的起源将是很有兴趣的。     

水稻齿叶矮缩病毒双链RNA的体外翻译

水稻齿叶矮缩病毒(Rice Ragged Stunt Virus,以下简称RRSV)的基因组双链RNA经羟甲基汞变性处理后,能在兔网状红细胞体外翻译体系中有效地指导蛋白质生物合成。利用该病毒的抗血清免疫沉淀体外翻译产物,结合SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,证明RRSV基因组RNA体外翻译的主要产物有十种左右,其中八种能被该病毒抗血清专一沉淀。用纯化的水稻齿叶矮缩病毒直接作蛋白质电泳分析,证明上述八种体外翻译产物与该病毒结构蛋白的分子量相当。Schiff试剂染色实验未能检测出糖蛋白。     

毛头鬼伞多糖CCP60a对TMV外壳蛋白的影响

对毛头鬼伞（Coprinus comatus Muell．ex Fr．）子实体中的多糖CCP60a进行了提取分离及检测,研究了不同温度条件下CCP60a对烟草花叶病毒（TMV）外壳蛋白体外聚合的影响,并用Western blotting法研究了CCP60a对TMV外壳蛋白表达的影响。结果表明,经沸水浸提、乙醇分级沉淀、DEAESephadex A-25离子交换柱层析、Sepharose-6B凝胶柱层析和抗TMV活性跟踪检测可得到均一的多糖CCP60a。随温度的提高,CCP60a处理组在320nm处的吸光度值增加幅度明显小于对照组,表明CCP60a对TMV外壳蛋白体外聚合有一定的抑制作用。Western blotting检测结果显示,CCP60a可以使TMV外壳蛋白的表达明显降低。     

双抗体免疫沉淀法纯化牛生长激素poly(A)~+RNA的研究

我们用双抗体免疫沉淀法,从牛垂体多聚核糖体中分离出牛生长激素特异多聚核糖体,由此多聚核糖体纯化的牛生长激素Poly(A)~+RNA,可以在麦胚体外翻译系统中和兔网织红细胞体外翻译系统中促进~(14)C-亮氨酸的参入。合成的含~(14)-亮氨酸的翻译产物中有91％可以被牛生长激素抗体沉淀。用SDS-11％PAGE对翻译产物进行鉴定表明,翻译产物在25KD处呈一条放射自显影带,与报导的牛生长激素前体分子量相吻合。     

小麦醇溶蛋白mRNA的分离及体外翻译

本文中采用受粉后发育25天的小偃麦种子制备总RNA。然后用高效Oligo(dT)—Celluiose分离Poly(A)—mRNA。根据它在麦胚无细胞蛋白质合成体系中的翻译活性和对体外翻译产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影分析说明,我们分离的Poly(A)—mRNA     

牛泌乳素mRNA的分离及鉴定

本文报道了从牛脑垂体提取总RNA,经寡聚脱氧胸苷纤维素亲合层析分离获得牛脑垂体Poly(A)~+RNA。牛泌乳素mRNA经含羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳分析,估计其长度约为1200个核苷酸。根据牛泌乳素的部分氨基酸序列推断并合成寡聚核苷酸探针,经Northern印迹杂交及放射自显影分析,证实了该mRNA中含有牛泌乳素mRNA的序列。在兔网织红细胞体外翻译体系中,牛泌乳素mRNA促进了~35S-甲硫氨酸参入,翻译合成的初级翻译产物能与兔抗羊PRL抗血清发生特异性免疫沉淀反应,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射自显影分析结果表明,牛泌乳素前体的分子量约25000。     

腮腺炎病毒的多肽及其在感染细胞中的合成

以差异离心和蔗糖密度梯度离心祛提纯了在鸡胚尿囊腔中繁殖的腮腺炎病毒粒子。并用SDS—PAGE分析病毒粒子的结构多肽,发现其结构多肽为11种,分子量在35K到72K之间。同时还检测到HN蛋白的多聚体和F蛋白的大亚基F1。将腮腺炎病毒分别感染Hela,Vero和CE细胞,比较这三种细胞对ME株腮腺炎病毒的敏感性,发现CE细胞是ME株的敏感宿主。用[31S]蛋氨酸标记病毒感染的CE细胞,以SDS-PAGE及放射自显影法检测到腮腺炎病毒在宿主细胞中合成了至少8种多肽,分子量在26．5K到94K之间。对这些多肽在细胞中不同时期合成情况进行了研究。还用脉冲追踪(pulsechase)技术在感染细胞中发现了FO到F这一转译后加工(Postttanslational procession)现象。此外也研究了放线菌素D和高沈度氯化钠对细胞蛋白质合成的抑制作用。     

用DNA杂交技术测定烟草花叶病毒与长叶车前花叶病毒的关系

从油菜上分离的属于烟草花叶病毒组的油菜花叶病毒15(YMV15)和从大白菜上分离到的白菜花叶病毒(ccMV)的外壳蛋白中,都含有组氨酸和甲硫氨酸,类似于长叶车前花叶病毒(RMV)。用YMV15一、RMV一和番茄花叶病毒(ToMV)突变体Nc广RNA的cDNA与Ymv_RNA、RMV—RNA和ccMV．RNA进行了同源和异源的分子杂交试验。 从分子杂交的R0t曲线和杂交产物的Tm值看,YMV-,和ccMV都不同于RMV,其饱和杂交率表明,ccMV与YMV,,有一定核苷酸序列的同源性,两者都与RMV没有核苷酸序列同源性,说明它们属于烟花叶病毒组的不同亚组。     

油菜花叶病毒15侵染烟原生质体的研究

与TMV有血清学关系的油菜花叶病毒”(YMV15)侵染烟原生质体的条件与IMV不同。在低于其等电点(5．35)的pH4.7的接种液中,不需要聚鸟氨酸的协助,能达到43—53％感染率,但加入聚鸟氨酸可使感染率增加到46—96％(荧光抗体染色)。YMV．,增殖的一步生长曲线,似乎显示了病毒脱去蛋白质外壳时的侵染性下降,对数生长期一直维持到接种后24小时。每个被感染原生质体内病毒颗粒数为1—3×109。     

大鼠脑线粒体体外蛋白翻译体系的建立及蛋白产物的鉴定

目的 :建立大鼠脑组织线粒体的体外蛋白合成体系并对其合成产物进行电泳分离和分子量鉴定。方法 :分离大鼠脑组织线粒体 ,用3 H 亮氨酸掺入法探索线粒体体外翻译的最佳条件 ,3 5S 蛋氨酸掺入并对翻译后产物经SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影进行分子量鉴定。结果 :分离的线粒体氧化磷酸化偶联程度高 ,呼吸控制率(RCR)在 3.5～ 5 .5之间 ;体外3 H 亮氨酸的掺入活性在 6 0min内近似线性增长 ,而后维持在一相对稳定水平 ;3 H 亮氨酸的掺入活性随线粒体蛋白浓度而增加 ,而单位线粒体蛋白的掺入活性在 1mg/ml时最高 ;3 5S 蛋氨酸掺入SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后可观察到清晰的 8条自显影带 ,分子量分别为 (单位Kda) 86、6 6、5 6、43、33、2 9、2 5、18。结论 :用此方法建立的脑线粒体离体翻译反应体系具有高活性和翻译忠实性等特点 ,是研究脑mtDNA在翻译水平的表达及调控的有效方法     

烟草花叶病毒和番茄花叶病毒在含N基因烟草上的症状差异是由运动蛋白基因决定的

烟草花叶病毒(TMV)和番茄花叶病毒(ToMV)是烟草花叶病毒属中关系最为密切的病毒, 但它们在含N基因烟草上产生的枯斑大小有明显的差异. 比较了TMV, ToMV及用ToMV运动蛋白基因(MP)精确置换TMV MP后获得的重组病毒T/OMP在不同寄主上的症状差异, 发现T/OMP在含N基因烟草上产生的枯斑大小与ToMV相似. 分析比较TMV, ToMV和T/OMP外壳蛋白和MP在植物体内的积累水平, 发现三者之间没有明显的差异, 而TMV和T/OMP在原生质体中的复制水平也没有差异. 比较TMV, ToMV和T/OMP接种后烟草体内防御相关酶(PAL, POD和PPO)的活性变化, 结果T/OMP和TMV所诱导酶的变化趋势基本一致, 而与ToMV有所差异, 因此认为MP基因功能的差异决定了TMV和ToMV在N基因烟草上枯斑的大小.     

应用RNAi技术培育抗2种病毒病的转基因烟草

分别提取烟草普通花叶病(TMV)和烟草黄瓜花叶病（CMV）的病毒RNA。经反转录和外壳蛋白阅读框PCR扩增,获得TMV和CMV外壳蛋白基因cDNA, 分别进行两种病毒已知株系cDNA序列比对获得各自的保守序列,设计干涉序列,将干涉片段扩增产物连接到pMD18-T的相邻酶切位点,制备融合序列,并将其正向和反向序列插入pUCCRNAi载体,再转化到pCAMBIA2300-35S-OCS表达载体中。利用农杆菌LBA4404侵染烟草K326,获得3份含有TMV和CMV外壳蛋白基因干涉序列的转化材料,经分子鉴定证实干涉序列已导入烟草,并采用荧光定量PCR技术对其mRNA表达差异进行分析。抗病性调查表明转化烟株对TMV和CMV抗性都显著增强。     

ColEl-Hhal片断DNA编码产物的体外合成

在S-30无细胞转录翻译联对系统中,应用小量S-30抽提液,即在每毫升反应混合液内,S-30蛋白质含量从6.6毫克降低至1毫克,不仅对DNA模板具有较高合成能力,而且对降低内源蛋白质合成起了显著作用。以Col El—Hhal的六个片断为模板,在S-30转录翻译联对系统进行蛋白合成,各片段DNA都编码了其相应的蛋白质。体外合成的蛋白产物应用Colicin抗血清的沉淀试验得到验证。     

蓝细菌ORF469的分子克隆和缺失突变工程株的构建

PCR扩增了蓝细菌Synechocystis sp．PCC 6803的ORF469(编码469个氨基酸的开放阅读框),进一步以pUC118为载体将其克隆到E．Coli中,构建了pOQ2质粒。通过DNA体外重组,以红霉素抗性基因取代部分克隆化ORF469片段,又构建丁缺失ORF469片段(保留部分上游和下游序列)的pOQ22质粒。用pOQ22质粒转化Synechocystis sp．PCC 6803野生株细胞,获ORF489缺失突变工程株,它在红霉素抗性培养基上生长正常。对缺失突变工程株DNA的PCR和Southern blot分析证明,Synechocystis sp．PCC 6803的ORF469已被删除。色素测定结果揭示Synechocystis sp．PCC 6803中ORF469表达产物控制细胞内不依赖光的叶绿素生物合成。     

黑曲霉病毒的形态和特性及其在细胞内的表现

从产生糖化酶的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株中分离到一种等轴对称、衣壳表面有突起、内含双链RNA的病毒颗粒。病毒颗柱在电镜下直径为28—33nm,呈六面体晶格排列。病毒在蔗糖密度梯度离心中有三个分部,分析超离心所得沉降系数为161S,118S和94S。病毒在凝胶电泳中为一条带,在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中外壳蛋白分子量为90,000、82,000、76,000、52,0000、42,000 道尔顿。提取的病毒与其抗血清在免疫双扩散实验中出现一条沉淀线。病毒核酸有5个组分,与聚肌苷：聚胞苷[poly(1)：poly?]抗血清反应中出现一条沉淀线。在早期菌丝细胞超薄切片中,病毒颗粒多近似球状紧密聚集,外被以膜结构,聚生或散生于胞质中;后期菌丝细胞中病毒颗粒则多散生于胞质中。     

用电镜放射自显影术研究TMV-RNA在烟叶细胞中的复制

在放线菌素D(AMD)抑制细胞RNA合成时,用3H-尿嘧啶核苷标记TMV侵染的和健康的烟草叶片,经固定,包埋,切片,RNA酶处理及放射自显影后,在电镜下观察。结果表明,3H-尿嘧啶核苷向病毒基因组或其复制中间体的掺入主要发生在细胞核内,叶绿体内有少量掺入,线粒体内未发现有掺入。因此认为TMV—RNA的合成主要是在缅胞核内进行的。切片如先经蛋白酶和RNA酶处理,再进行放射自显影,则自显影上的银粒几乎全部消失。从超薄切片后的剩余样品取小样,用酚一SDS法和Serva纤维素柱层析,从TMV侵染的烟叶中分离到了抗RNA酶的’H—ds—RNA。从而推测复制中间体在体内很可能主要是单链的,其复制过程很可能不经过双链复制型(RF)。提取到的’H一‘is—RNA：,可能是提取过程中的人为产物。     

球形芽孢杆菌Ts-1灭蚊毒蛋白的酶联免疫吸附测定

通过Sephadex G—200柱层析纯化得到球形芽孢杆菌Ts-1毒蛋白,其中主要是42Da和43kDa两种毒蛋白。用此毒蛋白免疫家兔获得抗血清。利用ELlSA双抗体夹心法比较测定了三种灭蚊球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)高毒株和两种无毒株,证明ELlSA具有很强的特异性。ELISA测定球形芽孢杆菌Ta-1纯化毒蛋白,最低可检值为1．56 x 10-5mg／ml。球形芽孢杆菌Ts—1发酵液的最低可检度为1：16000倍稀释。ELISA测定12和24小时发酵培养的Ts—1样品处理液中毒蛋白的含量,分别为0．049mg／ml和0．22mg／ml,毒蛋白含量相差4.59倍。而相应的生物测定LC50。值分别为0．71 ppm和0．154 ppm,毒力相差4.61倍。 ELISA与生物测定方法结果吻合。     

一株辣椒花叶病毒的生化特性研究

本文对辣椒花叶病毒的生化特性进行了研究。病毒蛋白的紫外吸收,最高280毫微米,最低为260毫微米;以SDS-PAGE测定其分子量为17500;病毒蛋白亚基由148个氨基酸组成。从病毒提纯的核酸为线状RNA;紫外吸收最高为260毫微米,最低230毫微米;经聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,其分子量为2.0×10~6。根据形态结构、血清学试验、外壳蛋白亚基组成、核酸和蛋白的分子量等综合分析,我们认为这株辣椒花叶病毒是烟草花叶病毒组(TMV)中的一个毒株。