流行性乙型脑炎病毒皮下感染小白鼠后脑组织中抑制物质的初步观察

继Issacs&Lindenmann二氏发现用灭活的流感病毒处理鸡胚绒毛尿囊膜能产生干扰素以来,已证明若干人类病毒在组织培养系统或动物亦能产生干扰素或类干扰素(病毒抑制物质)。其中包括大病毒(如牛痘病毒)和小病毒(如脊髓灰白质炎病毒);含DNA的病毒和含RNA的病毒。这说明病毒引起细胞产生这种抵抗感染发展的物质的性能是很普遍的。然而,关于流行性乙型脑炎病毒干扰素尚未见有报告。     

干扰素的生产及其临床应用

<正> 干扰素-来源于细胞的一种糖蛋白,能影响许多种细胞和病毒的生长过程。1975年Isaacs和Lindenmann发现了干扰素,他们证实:细胞在受到传染性的或是灭活的流感病毒侵袭后,细胞会产生和分泌一种能够抑制病毒繁殖的物质-干扰素。自从干扰素发现之后,就有人想要把它用于治疗病毒性疾病,不过只是到近来部分精制的干扰素制剂才能在数量上满足必要的临床试验。 最近的临床研究已经证明:系统的给予干扰素时对一些病具有显著疗效;诸如慢性活动性肝炎、接受免疫抑制治疗的带状疱疹患者(免疫抑制患者)。疤疹性结膜炎在局部清创术同时并用干扰素加速治疗及抑制病毒感染。局时应用大剂量干扰素对实验性鼻病毒感染具有保护。干扰素对于免疫抑制儿童发原性水痘、狂犬病、骨肉瘤、和其它肿     

不同亚型甲型流感病毒在单个核细胞内复制情况研究

目的研究不同亚型的甲型流感病毒在单个核细胞内的复制情况,探讨其免疫应答机制。方法①细胞培养:复苏A549、MDCK细胞后,用DMEM培养液常规培养;外周血分离得到单个核细胞,用RPMI1640常规培养;②空斑形成试验:用空斑试验检测病毒A/Shantou/169/2006(H1N1)和A/Shantou/602/2006(H3N2)的病毒原始滴度;检测流感病毒感染单个核细胞后的病毒滴度变化。结果流感病毒感染单核细胞后,上清液的病毒滴度下降,36、48、72 h病毒滴度<10 PFU/mL;而其细胞裂解液病毒滴度上升,滴度由9.5×10~4 PFU/mL上升至1.63×10~5 PFU/mL。流感病毒感染淋巴细胞,其细胞上清和裂解液病毒滴度均下降,其中上清液H3N2病毒滴度在48、72 h均<10 PFU/mL;裂解液病毒滴度则由4.8×10~5 PFU/mL下降至1.8×10~3 PFU/mL。结论不同亚型的甲型流感病毒在单核细胞和淋巴细胞中的复制存在差异。单核细胞可以吞噬流感病毒但不能直接灭活流感病毒,而淋巴细胞却可以直接抑制流感病毒的复制。     

流感病毒交叉反应性记忆T细胞的研究进展

流感病毒是长期威胁人类健康最主要的病毒之一.灭活流感疫苗主要产生针对病毒血凝素的菌株特异性抗体,当新出现的流感病毒株与疫苗株不匹配时,疫苗的有效性将会大大降低.由于季节性流感病毒的抗原漂移和突变的持续出现,人们迫切地需要找到更广泛的保护方式.在以往的研究中,人们逐渐意识到细胞免疫的重要性,尤其是预先存在的记忆T细胞能靶...     

A型流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒生物学性状的初步研究

为明确E61-24-P15 A型重组流感病毒的第189代传代子病毒(IVpi-189)是否具备流感病毒温度敏感减毒活疫苗候选株的特点,将IVpi-189病毒感染MDCK细胞,并于不同培养温度条件下培养,观察其致细胞病变效应,病毒合成、释放情况,以及不同温度条件下病毒存活时间。结果显示32℃培养温度下,IVpi-189病毒具有等同于亲代野生病毒株的诱导细胞病变能力,而当培养温度上调至38℃,IVpi-189病毒致细胞病变效果出现缓慢且程度明显减轻。空斑形成单位实验发现IVpi-189病毒在38℃培养条件下增殖能力明显下降,其原因与病毒灭活速度及子病毒释放无关,但与感染细胞病毒合成能力下降有关。上述实验结果初步证实流感病毒持续感染细胞系来源的IVpi-189病毒具有温度敏感减毒活疫苗的生物学特性,在许可培养温度条件下具有良好的增殖能力,而在非许可培养温度下,病毒增殖活性受到明显抑制。本研究为流感病毒减毒活疫苗的开发研制提供实验佐证。     

Vero 细胞流感病毒的大规模培养和纯化

目的：采用反应器技术以细胞为基质培养流感病毒,并探索其纯化工艺。 方法：采用5L反应器无血清条件下以Vero细胞为基质培养流感病毒,病毒收获后,经灭活、澄清,采用阴离子柱去除宿主DNA,亲和柱浓缩流感病毒,最后采用分子筛三步层析法进行纯化。结果：整个纯化工艺HA回收率达102%,蛋白降低率为95.3%,宿主蛋白降低率为99.77%,DNA的降低率为99.99%。结论 本研究成功建立了一种细胞流感病毒的纯化工艺。     

流感病毒对福尔马林敏感性的研究

采用三种流感病毒株：A1/京防/1/86、A3/济防/15/90、A3/武汉/359/95,进行敏感性试验。用不浓度的福尔马林灭活病毒,并在不同间隔时间检测血凝交价及灭活效果。结果显示,三种毒株经福尔马林灭活后,血凝滴度均有下降,病毒灭活时间也随着福尔马林浓度的降低而延长,说明相同亚型不同株别及不同亚型的流感病毒,对福尔马林的敏感程度均有差异。该试验对今后流感病毒的研究及其疫苗生产均有重要意义。     

Vero细胞培养流行性感冒病毒的研究

探索Vero细胞培养流感病毒和用于研制流感疫苗的可行性。确立Vero细胞培养流感病毒的最适条件,把流感病毒接种于Vero细胞上培养和传代,于不同时间收获病毒液,进行灭活和超滤浓缩实验,检测血凝素滴度(HA)。结果表明胰酶、pH值、残留牛血清是流感病毒在Vero细胞培养的影响因素,最佳收毒时间为72-96小时。Vero细胞上培养流感病毒的4～7代,HA滴度较高。病毒液用0．05％福尔马林4℃,7天即可灭活,用超滤技术能浓缩流感病毒液。Vero细胞可用于流感病毒的培养和疫苗的开发。     

重水（D2O）对流行性乙型脑炎病毒在鸡胚细胞繁殖的作用及其机制的研究

在流行性乙型脑炎病毒——鸡胚单层细胞系统研究了重水（D2O）对病毒的作用和作用的机制。在经30—40%重水处理的细胞繁殖的病毒感染滴度有明显的增高。实验证明,这种感染滴度的增高不是由于细胞敏感性的增加。发现有两个因素与重水的上述作用的机制有关:1)重水处理的细胞繁殖的病毒对热（50℃）稳定性有明显的增高;2)重水处理的细胞产生干扰素的滴度有一定的下降。重水处理的细胞中繁殖出的病毒对热稳定性增加这一事实指出,病毒结构中的氢原子被氘原子取代后,病毒的结构趋向于稳定。这一结果将有助于阐明热灭活病毒的机制和病毒结构与功能的关系,对于提高病毒的感染滴度和保存病毒亦可能有实际用途。     

禽流感病毒NS第263～277位核苷酸缺失降低其抗干扰素能力

2000年以来,多数H5N1亚型禽流感病毒在NS基因的263～277位发牛15个碱基的缺失。为了研究此缺失在流感病毒进化中的生物学意义,构建H5N1亚型流感病毒A／SD／04株的HA、NA、NS的全基因表达载体,以及NS基因263～277位删除的突变载体。通过反向遗传学技术,与编码WSN的其他内部基因（PB2,PB1,PA,NP和M）的表达载体进行组合转染,获得在NS基因的263～277位缺失和不缺失的2个重组H5N1亚型流感病毒（RWSN—m248和RWSN-248）。此两个重组病毒在无干扰素产生的Vero细胞上的繁殖滴度相似,在能产生干扰素的细胞MDCK和COS-1细胞上的繁殖滴度有明显差异。两个重组病毒在鸡胚中的繁殖滴,IVPI,MDT和EID50均无显著差异。说明NS基因的263～277位核苷酸的缺失不影响病毒的整体毒力,但降低了H5N1的抗干扰素能力。     

神经氨酸酶茎部氨基酸缺失对H5N1亚型禽流感病毒生物学特性的影响

近年来H5N1亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)茎部15~20个氨基酸的自发缺失时有报道,突变对于AIV生物学特性的影响还没有得到系统研究。应用反向遗传操作技术,拯救获得5株具有不同NA茎部长度的H5N1/PR8重组AIV。重组病毒的内部基因和血凝素(HA)基因来源相同,NA基因来源不同,并在NA茎部进行20个氨基酸的删除或添加突变。通过研究其生物学特性发现,5株重组病毒在SPF鸡胚中繁殖良好,其EID50、MDT和平均病毒滴度相似;NA茎部长短影响病毒的解凝能力,长茎病毒红细胞解脱能力比短茎病毒强;NA茎部15或20个氨基酸删除突变提高了重组病毒在MDCK细胞上的繁殖能力,短茎病毒释放出的病毒粒子数量是长茎病毒的10~100倍,释放时间提前6~10h,短茎病毒在MDCK细胞上形成的空斑也明显比长茎病毒的空斑大。实验结果揭示了AIV NA茎部氨基酸缺失突变的生物学意义,NA茎部15或20个氨基酸删除突变增强了AIV的细胞适应性,可能与现阶段H5N1亚型AIV宿主范围进一步扩大有关。利用反向遗传技术成功拯救了5株H5N1/PR8重组流感病毒,为流感病毒基因功能研究和重组疫苗研究建立了技术平台。通过对AIV NA茎部氨基酸的删除突变提高了病毒在MDCK细胞上的繁殖产量,为流感病毒细胞苗的生产提供了新的思路。     

流感病毒基因组及其转录

甲型流感病毒的特点是其表面抗原经常发生变化。1931年首先从猪分离出流感病毒;接着也从人体分离出;以后每隔10—15年就出现新的亚型,在人群中广泛流行。流行期间,病毒经常发生变异,这给疫苗研究带来很大困难。甲型流感病毒的不同毒株之间,重组率非常高。灭活病毒经两次或多次感染之后,可以恢复感染     

安全、便捷技术再生一次性医用口罩的实验研究

在防控新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)疫情中,为了减少病毒的传播,一次性医用口罩是普通民众必不可缺少的防护品。然而,随着2019-nCoV的蔓延,口罩短缺现象严重。本研究旨在探讨一次性医用外科口罩(口罩)的再生方法,以达到既有个人防护的效果又能节省资源。用流行性感冒病毒(简称流感)模拟2019-nCoV污染口罩,采用常用的恒温烘箱干烤及电吹风机热风处理2种方法,对表面污染有流感病毒的医用口罩进行病毒灭活,洗脱口罩上已灭活处理的病毒,感染Mardin-Darby狗肾细胞(Mardin-Darby canine kidney cell,MDCK细胞),观察细胞病变并定量检测病毒基因组拷贝数以评价病毒灭活效果。同时采用抽滤系统和PM2.5监测仪对以2种相似热灭活方式处理过的口罩滤过截留PM2.5的效果进行评价。结果显示电吹风机30 min热风处理后病毒基因组拷贝数降低至原来的1/1 000 000～1/10 000 000,接近未感染组,但烘箱56 ℃ 30 min干热处理仅灭活部分病毒。2种热灭活方式对口罩的PM2.5滤过截留效果无显著影响。本研究提供了一个安全、便捷处理一次性医用外科口罩的方法,为个人防护用品口罩表面污染病毒的灭活及其再生利用提供了科学依据。然而,应注意的是在口罩匮乏的非常时期,普通人群可采用该简便技术再生口罩后再次使用,但该方法再生的口罩不适合密切接触患者的人群、医护人员及实验室工作人员使用。     

N-乙酰半胱氨酸体外对流感病毒H1N1的抑制作用

目的探讨N-乙酰半胱氨酸（N—acetylcysteine,NAC）在体外对流感病毒H1N1的抑制作用。方法采用MTT法、鸡胚接种法和免疫荧光法,观察NAC对流感病毒HlM的抑制作用。采用血球凝集试验、神经氨酸酶活性抑制试验和透射电镜负染技术,初步探讨NAC对流感病毒HlM的抑制机制。结果NAC在MDCK细胞上的最大无毒剂量是6．25mg／mL;流感病毒H1Nl在MDCK细胞上的半数致死感染浓度（TCID-50）为1012-2.25／100μ;在三种作用途径下（治疗性给药、预防性给药和直接灭活后给药）,NAC明显抑制了流感病毒HlNl对MDCK细胞的感染,细胞存活率分别为91．88％、93．21％、94．67％,在对照组,流感病毒H1N1感染后的细胞存活率为28．32％,两者相比差异有统计学意义（P〈0．05）;免疫荧光结果显示,与病毒对照组形成的强特异性荧光相比,三种作用途径感染MDCK细胞后的特异性荧光明显减弱;鸡胚培养法的结果显示,NAC明显抑制了流感病毒H1N1在鸡胚内的增殖,实验组血凝效价低于1：2,对照组血凝效价为1：1024;神经氨酸酶活性抑制试验和透射电镜的结果显示,NAC能够明显抑制流感病毒川N1的神经氨酸酶活性,对流感病毒H1N1的病毒体结构也有明显的破坏作用。结论NAC在体外对流感病毒川N1有明显的抑制作用,其抑制机制可能与NAC对流感病毒血凝素和神经氨酸酶活性抑制及病毒体的直接破坏有关。     

β-丙内酯用于病毒介导的细胞融合的研究

制备高效和安全的仙苔病毒细胞融合剂,事先必须灭活。当前灭活病毒一般都采用紫外光或β-丙内酯(β-PL),但前者灭活病毒往往不完全,有细胞毒作用,对有些敏感细胞不适用,利用β-PL灭活病毒较完全,但它是一种强诱变剂和有毒药物。故必须谨慎从事。     

低温常压等离子体提高MDBK细胞中IBRV病毒滴度的作用与机制研究

加强病毒的繁殖可以帮助MDBK细胞生产更多的IBRV病毒用于生产灭活病毒疫苗。已证明低温常压等离子体（Cold atmospheric plasma,CAP）是一种依靠活性氧来实现MDBK细胞中病毒显著增殖的物理方法,可有效增强病毒的传播,其中牛鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotrachieitis virus,IBRV）和牛肾细胞（Madin-Darby Bovine Kidney,MDBK）分别被用作模型所需病毒和细胞系。CAP被证明与病毒感染具有协同作用,可以在G2/M期阻止宿主细胞分裂增殖,降低细胞膜电位,增加细胞内钙离子水平并诱导细胞选择性自噬。通过检测免疫相关蛋白表达,CAP被证明可以抑制病毒触发的免疫原性信号传导。综上所述,我们证明了CAP触发了宿主资源对病毒繁殖的最大化,这有利于病毒疫苗的生产,并为在医疗和卫生领域应用CAP开辟了新的可能。     

黄酮类化合物对禽流感病毒的抑制作用

采用鸡胚培养法探讨黄酮类化合物对禽流感H5N1亚型病毒的抑制作用。实验分三种给药方式:即直接作用、先感染病毒后用药和先加药后感染。第一种给药方式说明黄酮类化合物可以直接灭活H5N1病毒;第二种给药方式说明黄酮类化合物可通过抑制流感病毒唾液酶的活性,从而抑制病毒粒子的复制;第三种给药方式反映一定浓度的药物可以阻断病毒对细胞的吸附作用。结果表明,黄酮类化合物对禽流感病毒的预防及治疗均有显著效果。     

温度和pH对流行性乙型脑炎病毒——鸡胚细胞系统干扰素的产生和病毒繁殖的影响

本文较系统地研究了在鸡胚细胞上温度和pH对流行性乙型脑炎病毒繁殖和干扰素产生的动态,以及病毒繁殖与干扰素产生的相互关系。温度是一个重要而明显直的影响因秦。在31—38.5℃范围内,随着培养温度的升高,干扰秦产生的滴度和浊度也增加。文叶1讨论了温度对病毒感染的意义。研究了不同NaHCO3含量及不同pH对流行性乙型脑炎病毒繁殖和干扰素产生的影响。与病毒相比,产生干扰秦的适宜pH的上限较适宜繁殖病毒者为低。pH7．10不利于病毒的繁殖,但不影响干扰素的产生,相反,pH7.80有利于病毒的繁殖而不利于干扰素的产生。影响病毒的繁殖及干扰素的产生取决于pH,而与NaI{c03的浓度无直接关系。研究的结果指出,发烧及pH的改变通过干扰素的产生,在病毒感染恢复机制中可能是重要的因素。     

MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用

目的：驯化MDCK细胞使之适应悬浮培养,以之作为生产流感病毒疫苗的介质,为以细胞代替鸡胚制备流感病毒疫苗提供保证。方法：通过直接法和间接法分别驯化MDCK细胞,放大培养能悬浮生长的MDCK细胞,并以之作为介质培养流感病毒。结果：获得了能悬浮培养的MDCK细胞,其在悬浮条件下生长良好;以之作为载体培养流感病毒,可获得较高产量的病毒。结论：建立了悬浮培养的MDCK细胞,以之作为载体培养流感病毒可获得较高病毒滴度,为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。     

利用靶定基质蛋白基因m的小干扰RNA抑制2009甲型H1N1流感病毒的复制

目的:设计、构建并筛选针对流感病毒基质蛋白基因m的小干扰RNA(siRNA),检测其对2009甲型H1N1流感病毒复制的抑制效果。方法:设计3条针对流感病毒m基因的siRNA,并克隆到短发夹型(shRNA)siRNA表达载体pSilencer2.1-U6-hygro上;经测序证明构建成功后,将表达3种siRNA的质粒和阴性对照质粒psiRNA-control分别转染MDCK细胞,用潮霉素筛选稳定表达细胞株,用H1N1流感病毒感染细胞,通过Real-time PCR和Western印迹检测干扰效果。结果:构建了3个针对流感病毒m基因的siRNA表达质粒,3种siRNA均使m基因的mRNA水平降低,其中M1-306的抑制效率达60%;3种siRNA均使流感病毒NA蛋白的表达量降低,M2-25、M1-105的抑制效率明显,M1-306略低。结论:针对m基因的siRNA可以有效抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。