重组质粒pPIC9K-oLHαhCGβCTP的构建及在毕赤酵母中的表达

将人绒毛膜促性腺激素β－亚基的羧基肽（ＣＴＰ）与羊黄体生成素（ｏＬＨ）的α－亚基融合,通过设计两对引物,用部分重叠聚合酶链式反应（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇＰＣＲ）的方法构建了羊的α亚基ＣＴＰ嵌合体．这个嵌合体被克隆到ｐＰＩＣ９Ｋ质粒中,用电打孔方法转入巴氏毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）,并获高效表达．表达蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明分子量约为２８ｋＤ．２．５Ｌ发酵罐大量培养,产量可达２．０ｇ／Ｌ．     

人血管内皮细胞生长因子受体Flt—1胞外区cDNA在毕赤酵母中的？…

将编码血管内皮细胞生长因子受体ＦＩｔ－１胞外区１－３ｌｏｏｐ３１６个氨基酸残基的ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和α分泌信号肽序列的Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母载体中,构建了重组表达质粒ｐＰＩＣ９Ｋ／ＦＩｔ＝１（１－３）,转化酵母景菌ＧＳ１１５,筛选Ｈｉｓ＾＋Ｍｕｔ＾ｓ表型转化子,经插瓶培养,１％甲醇诱导表达４ｄ后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果显示,培养上清中ＦＩｔ－１（１－３）表达这总蛋白的３０－％     

Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制剂cDNA在P.pastoris酵母菌中的表达和鉴定

将编码３７９个氨基酸残基的ＰＡＩ－１ｃＤＮＡ插入到含ＡＯＸ１启动子和ＰＨＯ１分泌信号肽序列的甲醇营养型酵母载体中,构建成表达质粒ｐＹＩＳ－１．表达质粒转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ甲醇营养型酵母细胞,筛选Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ－表型的转化子,经低密度摇瓶培养,１％甲醇诱导表达７ｄ后,培液经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,ＰＡＩ－１生物活性测定和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达出分子量为４３～５１ｋＤ的４条ＰＡＩ－１条带．表达的ＰＡＩ－１能有效地分泌到培液中,占培液总蛋白的２６％左右,达４ｍｇ／Ｌ培液;其比活性为１．１６×１０４ＡＵ／ｍｇ．不同分子量ＰＡＩ－１可能与其糖基化程度不同有关     

t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ５＇端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥ－Ｙ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔ－ＰＡ的活性。Ｍｕｔ＾ｓ表型菌表     

甲醇酵母表达体系

甲醇酵母表达体系柴清黄秉仁（中国医学科学院基础研究所、中国协和医科大学基础医学院,北京１００００５）关键词巴氏毕赤酵母醇氧化酶表达体系甲醇酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）是最近迅速发展的一种表达宿主,它有许多优点：（１）含特有的ＡＯＸ（醇氧化酶基...     

利用PCR方法鉴定甲醇酵母转化子的表型

本文以含外源基因的甲醇酵母表达载体ｐＰＩＣ９／Ｅ２Ｆ－１－ＤＢ质粒ＤＮＡ电转化甲醇酵母ＧＳ１１５,小规模抽提所得转化子的总ＤＮＡ,并以其为模板,以乙醇氧化酶（ＡＯＸ１）５’端序列和３’端的ＴＴ序列为引物,进行ＰＣＲ反应。ＰＣＲ产物走０．８％Ａｇａｒｏｓｅ电泳,通过对ＰＣＲ产物的电泳带型分析,鉴定出甲醇酵母转化子的表型,即Ｍｕｔ＾＋或Ｍｕｔ＾ｓ。这一鉴定结果为转化子的诱导表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图     

t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔＰＡｃＤＮＡ５′端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥＹ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔＰＡｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔＰＡ的活性。Ｍｕｔｓ表型菌表达产物活性最高为２５００ＩＵ／ｍｌ,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实表达产物具有天然ｔＰＡ分子的免疫原性。     

人血小板生成素全长分子在酵母系统中的分泌表达及活性分析

外源基因可通过整合型载体被整合到毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体上,获得遗传性稳定分泌表达株．利用酵母信号肽ＭＦα,对该信号肽蛋白酶识别位点的相关序列进行重新设计,使天然人ＴＰＯ成熟肽在毕赤酵母系统中分泌表达成功．表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ进行分析,分子量约为６６ｋＤ处蛋白条带可被ＴＰＯ抗体识别;表达量约为０．１ｇ／Ｌ;Ｎ端氨基酸序列分析结果与设计的一致;表达产物对小鼠骨髓细胞形成巨核细胞集落形成单位（ｍｅｇａｋａｒｙ－ｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ,ＣＦＵ－Ｍｅｇ）具有明显的刺激作用．     

人胰岛素原在甲醇酵母(Pichia pastoris)中的高效表达

甲醇营养型酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ在近十几年已被人们广泛用作外源基因表达的系统。表达的是可溶性蛋白,且胞外分泌。本研究系将外源基因（胰岛素原基因）连接到穿梭质粒ＰＨＩＬ－Ｓ１上,再通过同源重组到酵母染色体,筛选表达株。用１ 升发酵罐在甲醇诱导下可获得０．３ｇ／Ｌ胰岛素原的产率。     

人胰岛素原在甲醇酵母（Pichia pastoris）中的高效表达

甲醇营养型酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ在近十几年已被人们广泛用作外源基因表达的系统。表达的是可溶性蛋白,且胞外分泌。本研究系将外源基因（胰岛素原基因）连接到穿梭质粒ＰＨＩＬ－Ｓ１上,再通过同源重组到酵母染色体,筛选表达株。用１升发酵罐在甲醇诱导下可获得０．３ｇ／Ｌ胰岛素原的产率。     

Vectors for expression of proteins with single or combinatorial fluorescent protein and tandem affinity purification tags in Dictyostelium

The human tumour suppressor P53 is a key protein involved in tumour suppression. P53 acts as a "guardian of genome" by regulating many target genes involved in cell cycle regulation, DNA repair and apoptosis. We report the P53 expression by the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the methanol inducible AOX1 promoter. We have produced the rP53 in intracellular form as well as secreted using the Saccharomyces cerevisiae alpha-mating factor prepro-leader sequence in two genetic contexts of Pichia, Mut(s) and Mut(+). The intracellular P53 was successfully produced by Mut(s) (KM71) as well as Mut(+) (X33) strains, however, the secreted form was mainly observed in the Mut(s) strain, despite a higher number of p53 copies integrated in the Mut(+) strain. Interestingly, in Mut(s) phenotype, the medium pH influences markedly the rP53 production since it was higher at pH 7 than 6.     

人睫状神经营养因子在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达和生物活性测定

The recombinant human ciliary neurotrophi factor(hCNTF)expressed in E.coli aggregatedas inclusion bodies and refolding procedure was necessary to obtine the active protein.To overcome the disadvantage,we cloned hcntf gene into yeast expression plasmid pPIC9K and collected the plasmid pPIC9K-hcntf.Plasmid pPIC9K-hcntf was transformed into yeast Pichia pastoris GS115,and screened on G418-SD plates.The transformants with high copies of hcntf gene were inoculated into BMMY media and induced with 0.5% methanol.The recombinant hCNTF was secreted into the media.The amount of hCNTF in the supernatant was about 10 mg/L when incubated in the conical flasks and reached up to 60 mg/L under fed-batch condition in 15 L fermentator.The recombinant hCNTF expressed in E.coli was renatured as the control.The neonatal rat dorsal root ganglion assay showed that proteins expressed in both systems have the activity of promoting the growth of neuron axons.The phenomenon can be observed with only 3 μg hCNTF expressed in yeast present,which indicates that hCNTF was successfully expressed in Pichia pastoris and has a relatively high activity.     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达

采用PCR方法．从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71．甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10％,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。     

球孢白僵菌丝氨酸蛋白酶基因CDEP-1在毕赤酵母中的表达

我们从球孢白僵菌中克隆了丝氨酸蛋白酶Pr1类基因CDEP-1。为明确CDEP-1的功能、评价其在害虫生物防治中的潜力,需要大量制备具有生物活性的CDEP-1编码蛋白。由于大肠杆菌系统表达真核基因存在产物复性困难的问题,本文利用毕赤酵母系统来表达CDEP-1。结果表明,CDEP-1可在毕赤酵母中高效的分泌表达,而且产物活性高,甲醇诱导48h后上清液中的酶活即可达到38,266U/L。诱导表达的上清液经浓缩后进行凝胶过滤层析,得到了CDEP-1的初纯品,蛋白质含量为50mg/L。将纯化的蛋白酶CDEP-1免疫家兔,制备了CDEP-1的抗血清。Westernblotting分析表明,制备的抗血清可特异性地检测CDEP-1。     

人白血病抑制因子基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

将 575bp的人白血病抑制因子基因克隆到表达载体pPICZαA上 ,构建成重组质粒pPICZαA hLIF。pPICZαA hLIF经SacI酶切使之线性化后转化到巴斯德毕赤酵母细胞X 33中。转化子经Mut表型筛选和PCR分析鉴定后 ,利用甘油增菌和甲醇诱导 ,实现了hLIF基因在毕赤酵母系统中的表达。SDS PAGE检测和Westernblot分析结果表明表达产物的分子量约为58 5kD ,与天然hLIF大小相近 ,并且具有免疫原性。凝胶薄层扫描分析显示 ,重组hLIF约占上清总蛋白的 32 8%。生物活性测定结果表明 ,表达产物能够抑制小鼠畸胎瘤细胞F9克隆的形成     

来源于Escherichia coli的高比活植酸酶基因的高效表达

高效表达高比活植酸酶是进一步提高植酸酶发酵效价、降低植酸酶生产成本的一个有效途径。对源于Escherichiacoli的高比活植酸酶基因appA ,按照毕赤酵母 (Pichiapastoris)密码子的偏爱进行了密码子优化改造。该改造后的基因appA m按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9上的α 因子信号肽编码序列 3′端 ,通过电击转化得到重组转化子。对重组毕赤酵母的Southernblotting分析证实植酸酶基因已整合到酵母基因组中 ,并确定了整合基因的拷贝数。Northernblotting分析证实植酸酶基因得到了正常转录。SDS PAGE分析和表达产物的研究表明 ,植酸酶得到了高效分泌表达 ,在 5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到 2 5mg mL发酵液 ,酶活性 (发酵效价 )达到 7 5× 10 6 IU mL发酵液以上 ,大大高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

Combined effect of the methanol utilization (Mut) phenotype and gene dosage on recombinant protein production in Pichia pastoris fed-batch cultures

An important number of heterologous proteins have been produced in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using the alcohol oxidase promoter. Two factors that drastically influence protein production and cultivation process development in this system are gene dosage and methanol assimilation capacity of the host strain (Mut phenotype). Using a battery of four strains which secrete a Rhizopus oryzae lipase (ROL), the combined effects of gene dosage and Mut phenotype on recombinant protein production in Pichia pastoris was studied in fed-batch cultures. Regarding the effect of phenotype, the specific productivity and the Y(P/X) were 1.29- and 2.34-fold higher for Mut(s)ROL single copy strain than for Mut+ROL single copy strain. On the contrary, the productivity of Mut+ROL single copy strain was 1.34-fold higher than Mut(s)ROL single copy strain. An increase in ROL gene dosage seems to negatively affect cell's performance in bioreactor cultures, particularly in Mut(s) strains. Overall, the Mut(s) strain may be still advantageous to use because it allows for easier process control strategies.