兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa.利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92.7%和97.2%,氨基酸序列的同源性分别为96.1%和98.6%,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83.7%～97.0%之间,氨基酸序列的同源性在90.5%～99.0%之间,具有高度的同源性. 进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高.在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征.三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中.与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系.运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构.NJ85 VP60的二级结构以β片层为主,三级结构稳定.病毒衣壳表面有32个杯状凹陷, 由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A/B5和C/C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式.单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点.     

兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT—PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1．7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEM^R—T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株BHD衣壳蛋白基因片段长度为1740bp,共编码580个氨基酸。该核酸序列与其它国家报道的多株BHDV序列相互间同源性高达98．2％一99．0％,其推导的氨基酸序列同源性也达98．3％--99．1％,为极度保守片段。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa。利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92．7％和97．2％,氨基酸序列的同源性分别为96．1％和98．6％,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83．7％-97．0％之间,氨基酸序列的同源性在90．5％～99．0％之间,具有高度的同源性。进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高。在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征。三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中。与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系。运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构。NJ85 VP60的二级结构以B片层为主,三级结构稳定。病毒衣壳表面有32个杯状凹陷,由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A／B5和C／C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式。单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点。     

兔出血症病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达

将RHDVVP60基因插入酵母转移载体pPICZB中转化毕赤酵母菌GS115株 ,经筛选获得染色体基因组中整合入VP60基因的重组酵母菌。以甲醇诱导培养后经SDS-PAGE和Westernblot检测表达产物 ,在60kD处出现一特异蛋白条带 ,表明RHDV的衣壳蛋白得到了成功表达。血凝试验表明 ,表达的重组蛋白具有血凝特性 ,可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2.8,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组酵母表达的衣壳蛋白可以在酵母菌体内自聚成大小约4.0nm ,和天然RHDV病毒子在物理形态上类似的病毒样颗粒 (VLPs)。该病毒样颗粒与兔抗RHDV高免血清作用后可被凝集成团 ,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。     

N端融合外源蛋白的兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP6 0基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBACHIS2_B的 6 HIS表达标签下游 ,与线性化野生型杆状病毒基因组DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经蚀斑纯化后获克隆化重组杆状病毒pBLUEBACHIS2B_VP6 0。以重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,经SDS_PAGE和Westernblot检测显示高效表达一分子量为 6 9kD的重组蛋白 ,并且该蛋白可被兔抗RHDV高免血清识别。血凝试验表明 ,该重组蛋白可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2 1 6 ,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组病毒表达的融合有 6 HIS表达标签的衣壳蛋白仍可在昆虫细胞内自聚成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上相似的病毒样颗粒 (VLPs) ,并且该VLPs与兔抗RHDV高免血清作用后于电镜下可见凝集成团的现象 ,表明其与天然RHDV病毒粒子在抗原性上也极为相似     

在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC 4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60.在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60 与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4-VP60.以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Western blot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性.血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213.同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制.经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs).在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似.     

兔出血症病毒结构多肽分析

粗提病毒经Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ层析后,获得纯化的兔出血症病毒（ＲＨＤＶ）。提纯病毒经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ经考马斯亮蓝染色显示Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ和Ｇ７条多肽,凝胶扫描显示Ａ为ＲＨＤＶ主要结构多肽。用多抗和单抗作免疫转印分析,证实Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、和Ｇ为结构多肽,此６条结构多肽间的抗原关系十分密切。     

兔出血症病毒遗传变异分析及RT—PCR检测方法的建立

目的获得兔出血症病毒（浙江分离株）近20年间遗传变异概况,建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法对1989～2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因（VP60）进行了克隆与测序,并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析;根据兔出血症病毒株的VP60设计引物,对20只人工感染兔的实质脏器、全血和350只实验兔全血样本进行了检测。结果7株RHDV的VP60基因均由1740个核苷酸组成,编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%～99.8%。系统发生树分析结果显示,RHDV可划分为2个大的基因群,浙江（中国）的RHDV分离株主要集中于C亚群。RT—PCR检测方法表明20只实验兔全部扩出预期条带,而350只实验兔全血检测中出现13只RHDV可疑样本。经血凝抑制试验检测,13例PCR阳性样品中有10个HAI阳性,3个阴性。检测敏感度达100%,特异性为99.12%,经统计检验,kappa=0.865,表明PCR检出RHDV的结果与HAI高度一致。结论RHDV基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。我们建立的RT—PCR法可用于RHDV浙江分离株的检测,用RT—PCR检测全血中RHDV方法的建立为活体检测RHDV打下了基础。     

Oral Immunization using Tuber Extracts from Transgenic Potato Plants Expressing Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein

Rabbit hemorrhagic disease, which is caused by a calicivirus, is a lethal infection of adult animals that is characterized by acute liver damage and disseminated intravascular coagulation. In this study, we report the production of the major structural protein VP60 of rabbit hemorrhagic disease virus in transgenic tubers of potato plants and its use as an oral immunogen in rabbits.     

马尾松毛虫CPV基因组第5片段的cDNA克隆及其序列分析

通过差速离心从感染的马尾松毛虫幼虫虫体中提取质型多角体病毒.碱解法提纯病毒粒子,1%琼脂糖凝胶分离基因组dsRNA,回收纯化第五片段(S5).根据同源性设计五对引物,经RT-PCR,最终获得五个亚克隆片断,测序拼接后,得到S5全长.片断全长2851个核苷酸,包括一个2643个核苷酸的开放阅读框.推测DpCPV S5基因编码了881个氨基酸长的多肽,分子量为100.3kDa,与舞毒蛾质型多角体病毒(LdCPV-1)和家蚕质型多角体病毒(BmCPV)比较,核苷酸和氨基酸的同源性都很高.进一步分析,利用几种CPV序列绘制了系统进化树,对病毒的分类和进化做了探讨研究.     

Nucleolin interacts with the rabbit hemorrhagic disease virus replicase RdRp,nonstructural proteins p16 and p23, playing a role in virus replication

Rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) is a member of the Caliciviridae family and cannot be propagated in vitro, which has impeded the progress of investigating its replication mechanism. Construction of an RHDV replicon system has recently provided a platform for exploring RHDV replication in host cells. Here, aided by this replicon system and using two-step affinity purification, we purified the RHDV replicase and identified its associated host factors. We identified rabbit nucleolin (NCL) as a physical link, which mediating the interaction between other RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)-related host proteins and the viral replicase RdRp. We found that the overexpression or knockdown of NCL significantly increased or severely impaired RHDV replication in RK-13 cells, respectively. NCL was identified to directly interact with RHDV RdRp, p16, and p23. Furthermore, NCL knockdown severely impaired the binding of RdRp to RdRp-related host factors. Collectively, these results indicate that the host protein NCL is essential for RHDV replication and acts as a physical link between viral replicase and host proteins.     

庚型肝炎病毒（HGV）NS5区部分基因的克隆和cDNA序列测定

用RT－PCR技术从一例献血员血清标本中扩增出HGV非结构区的部分基因片段,克隆后测定。cDNA序列。该序列与国外三株HGV的核苷酸同源性在90％以上;与GBV—A和GBV—B的同源性分别为44．7％和33．17％;与已发表的23个HCV全序列的相应序列比较,同源性均小于40％。结果表明,克隆的病毒株为HGV中国株。同时,用RT—PCR检测了河北固安和南京地区的115份HCV感染者标本．HGVRNA阳性率为3．47％。表明我国某些特殊人群中HGV感染率较高,是一个不容忽视的问题。