人胰岛素样生长因子Ⅰ在大肠杆菌中的表达研究

胰岛素样生长因子Ⅰ（ＩＧＦ－Ⅰ）是一种多功能细胞增殖调控因子,它对许多疾病有较好的治疗作用．为了获得大量的ＩＧＦ－Ⅰ产品,在测定了ＩＧＦ－Ⅰ全长序列的基础上,构建了ＩＧＦ－Ⅰ表达载体ｐＢＶＩＧＦ,经热诱导表达后,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明：含有重组表达质粒的菌株可表达出７．６ｋＤ的蛋白．研究了不同菌株对ＩＧＦ－Ⅰ表达的影响．ＩＧＦ－Ⅰ的表达水平可达１５ｍｇ／Ｌ．重组蛋白主要以包涵体形式存在,进行了初步纯化和复性研究,Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹表明重组蛋白具有ＩＧＦ－Ⅰ的抗原性．并初步建立了ＩＧＦ－Ⅰ生物活性测定方法．     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达

 为构建草鱼 (Ctenopharyngodonidellus )胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )大肠杆菌表达质粒 ,对已克隆到的草鱼IGF Ⅰ基因进行改造 .改造后的基因去除了原cDNA的信号肽和E区序列 ,并在基因的两端分别加入起始密码子和终止密码子 .将改造后的编码草鱼IGF Ⅰ成熟肽基因亚克隆到pBV 2 2 0中 ,构建成表达质粒pBVgIGF7.转化大肠杆菌 (Escherichiacoli)进行表达 .SDS PAGE显示 ,含重组表达质粒的菌株经热诱导后表达出一约 7 5kD的特异蛋白 .表达量占菌体总蛋白的2 0 0 3% ,表达产物主要以包涵体形式存在 .重组蛋白经纯化和复性后 ,采用MTT法测定其对草鱼吻端成纤维细胞PSF和草鱼卵巢细胞CO的促增殖作用 .结果表明 ,所获得的重组草鱼IGF Ⅰ具有生物活性     

胰岛素样生长因子-Ⅰ受体和LH受体mRNA在黄体中的表达及调节

研究了大鼠卵巢黄体中胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)与促黄体激素受体(LHR)的表达关系及调节. 在动情周期中, LHR阳性黄体能表达高水平的IGF-ⅠR mRNA. 动情期黄体的LHR表达水平降低, 而IGF-ⅠR表达仍较高. 假孕第1天黄体中LHR表达较低,第8天达最高水平, 第14天表达已降低到检测不到的程度. 与LHR表达不同, 在第1天假孕黄体中IGF-ⅠR的表达已较高, 此后至第14天在黄体中均检测到IGF-ⅠR信号. 孕鼠黄体同时表达LHR 和IGF-ⅠR mRNA. IGF-Ⅰ刺激LHR mRNA在黄体中的表达. 前列腺素(PG)F抑制IGF-ⅠR和LHR的表达. PGE2能消除PGF对IGF-ⅠR和LHR mRNA表达的抑制作用. 上述结果提示:IGF-Ⅰ可能通过其受体的表达变化参与调节黄体功能、维持黄体结构. PGF抑制IGF-ⅠR的表达可能是黄体萎缩的机制之一.     

大鼠胰岛素样生长因子Ⅰ基因的克隆及表达

以大鼠染色体DNA为模板,PCR分别扩增胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因外显子2编码区和外显子3编码区,并使外显子2编码区的3′端与外显子的3编码区的5′端有相同的40个碱基,采用外显子拼接法,以两种扩增产物为模板再次进行PCR,得到210bp的大鼠IGF-Ⅰ基因编码序列,将此序列克隆入pUC18质粒进一步构建表达型重组粒pGEX-IGF-Ⅰ,并在大肠杆菌DH5α中进行诱导表达。表达产物经SDS－PAGE分析及Western blot检测,并经体外实验证明其具有刺激细胞增殖的生物活性。     

“胰岛素－类胰岛素生长因子－Ⅰ片段”杂交分子的促生长活性研究

“胰岛素－类胰岛素生长因子－Ⅰ片段”杂交分子的促生长活性研究张新,唐月华,冯佑民,景乃禾（中国科学院上海生物化学研究所,中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,２０００３１）关键词胰岛素,类胰岛素生长因子－Ⅰ,杂交分子,促生长活性胰岛素...     

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、IGF结合蛋白-2和LH受体mRNA在卵泡闭锁过程中的表达及调节

研究了IGF-Ⅰ、IGF结合蛋白-2(IGFBP-2)和促黄体激素受体(LHR)mRNA在卵泡闭锁过程中的表达及调节.给26日龄大鼠注射15 IU PMSG,经检测,证实PMSG处理48 h后,一些小窦状卵泡的颗粒细胞已发生凋亡;96 h在排卵前卵泡中已可检测到凋亡细胞;120 h大多数的排卵前卵泡中均出现大量的凋亡细胞.48～120 h IGF-Ⅰ主要在窦前卵泡和小窦状卵泡表达;48与96 h,窦前与窦状卵泡的膜细胞均表达高水平的IGFBP-2.在48 h,颗粒细胞中有LHR的强信号,但在96和120 h,颗粒细胞的LHR表达减弱(P＜0.001).表皮生长因子(EGF)和IGF-Ⅰ均抑制窦前和窦状卵泡颗粒细胞凋亡.同时观察到EGF促进IGF-Ⅰ mRNA表达,IGF-Ⅰ刺激排卵前卵泡表达LHR mRNA.上述结果表明,各级卵泡的闭锁可能均受EGF和IGF-Ⅰ相互作用的调节.     

头鲂胰岛素样生长因子-Ⅰ基因克隆与分析

胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)是一单链多肽。在脊椎动物中，IGF-Ⅰ通过介导生长激素达到促进生长的作用。为研究鲤科鱼类IGF-Ⅰ的结构功能及在水产养殖中的潜在应用前景，采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从团头鲂(Megalobrama amblycephala)肝脏的总RNA中扩增出IGF-ⅠCdna。测定了该基因序列，推导其编码的蛋白质序列。克隆 的Cdna序列编码包括信号肽和B、C、A、D、E 6个区域的161个氨基酸。E区域分析结果表明所克隆的团头鲂IGF-Ⅰ序列属于IGF-ⅠEa-2亚型。     

力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析

MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/ des(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。再对融合蛋白EK酶切, rpHPLC分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE电泳及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。     

胰岛素样生长因子1及其在组织和器官生长发育中的作用

胰岛素样生长因子1(IGF1),具有调节组织细胞增殖、分化、有丝分裂等功能。研究表明IGF1不仅参与众多疾病的发生,还参与了不同组织和器官的发育过程。对IGF1信号通路及其在机体发育中的作用进行了综述。     

人血管形成素在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定

RT-PCR获取的血管形成素Angiogenin cDNA片段,克隆入融合表达载体pRSETB中,表达产物为N端融合了His6的融合蛋白,以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的10%。用8mol/L脲溶解包涵体,利用His6与过渡态金属离子Ni⁺²高亲合力结合的性质,经Ni+2NTA亲和树脂一步法纯化,获得纯度达98%以上His6-ANG融合蛋白,Western-blot结果表明在相应分子量处有一条特异性条带。重组蛋白复性后活性测定表明,在体外可促进鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管形成,并可降解tRNA。     

截短型人胰岛素样生长因子-Ⅰ 在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴定

利用PCR、删除突变和基因重组技术构建了N端缺失3个氨基酸的人胰岛素样生长因子-[des(1-3)IGF-]的表达载体pExSec/IGF,在大肠杆菌蛋白酶缺陷株BL21(DE3)中,通过用IPTG于超常规的12℃低温诱导16h,des(1-3)IGF-获得了可溶性表达。表达水平达到可溶性细菌总蛋白约15%。经超滤和SephadexG-50凝胶过滤,des(1-3)IGF-纯度分别达到49%和82%,且表现出明显的免疫学活性和刺激Balb3T3细胞增殖的生物学活性。     

人胰岛素样生长因子Ⅱ在甲醇营养型酵母P.pastoris中的表达、分泌和性质研究

为获得ＩＧＦ－Ⅱ的高效表达,构建了其多拷贝、分泌型表达载体：含有５个串联的ＩＧＦ－Ⅱ表达单元;由受甲醇诱导的醇氧化酶启动子控制表达;利用啤酒酵母α因子的前导肽引导分泌．线形化表达载体转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ蛋白酶缺陷型菌株后,筛选到有ＩＧＦ－Ⅱ表达和分泌的阳性转化子;进一步优化表达、培养条件后,ＩＧＦ－Ⅱ在高密度发酵上清中的产量可达６０ ｍ ｇ／Ｌ．对Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ产生的ｒｈＩＧＦ－Ⅱ的性质分析表明,其具有正确的分子量,Ｎ 端和较好的生物活性．     

重组人胰岛素样生长因子1的原核可溶性表达及活性鉴定

目的:原核可溶性表达人胰岛素样生长因子1(hIGF-1)并进行生物活性测定。方法:PCR扩增hIGF-1核酸序列,克隆至融合表达载体pET-DsbC中,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导、表达和纯化,对融合蛋白DsbC-hIGF-1分别进行酶切、Western印迹和生物活性测定。结果:融合蛋白DsbC-hIGF-1在原核系统内经IPTG诱导,主要以可溶性形式表达,其表达量占菌体总蛋白量的30%～35%,Western印迹和MTT法测定结果证明重组DsbC-hIGF-1蛋白具有较强的抗原活性和明显的促NIH/3T3细胞增殖作用。结论:融合蛋白DsbC-hIGF在大肠杆菌中以可溶性表达形式存在并具有类似天然hIGF-1的生物活性,这对进一步研究hIGF-1的结构和功能,开发相应的基因工程产品具有重要意义。     

绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎的制备

利用含有红色荧光和Neor基因双选择标记的IGF1毛囊特异表达载体pCDsR-KI转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得具有红色荧光的IGF1转基因细胞.核移植操作前,通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离,确定20h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间.比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激活效率和孤雌胚早期发育的影响,结果表明：IA23187＋6-DMAP组的激活效率和囊胚率（88.7%＆21.6%）均稍高于乙醇＋6-DMAP组（86.4%＆20.4%）,但二组相应数据之间差异均不显著（P〉0.05）,选择前者作为转基因核移植胚的激活方案;SOFaa和CR1aa两种体外培养体系中,孤雌胚卵裂率（86.8%vs83.9%）和囊胚率（23.1%vs17.2%）均差异不显著（P〉0.05）,选择结果较好的SOFaa组.比较了不同电融合参数的融合效果,结果表明：190V/mm处理组结果（62.4%）显著高于130V/mm（32.8%）和200V/mm（42.9%）组（P〈0.05）.通过T-SCNT获得转基因重构胚胎203枚,48h卵裂率为79.3%（161/203）,第7~9天囊胚发育率为15.3%（31/203）.所得到的31枚囊胚中,较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17枚（阳性率为54.8%）.随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为转基因阳性.以上结果显示：（i）表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因细胞和阳性转基因胚胎;（ii）所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白,说明即使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性,在囊胚期进一步筛选是必要的;（iii）通过TSCNT操作及优化,成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1基因的绒山羊胚胎,为绒山羊的转基因研究提供基础数据.     

宽鳍鱲胰岛素样生长因子-Ⅰ的克隆及繁殖期前后表达分析

为探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)对宽鳍鱲(Zacco platypus)繁殖期前后生长性状的影响, 开展了宽鳍鱲IGF-Ⅰ基因序列的克隆及表达定位分析。宽鳍鱲IGF-Ⅰ基因全长13707 bp, 包含5个外显子、4个内含子, 其中5个外显子长度分别为222、160、182、36和829 bp; 内含子长度分别为1194、7771、254和1879 bp, 推测开放阅读框为486 bp, 编码161个氨基酸。实时荧光定量PCR(Real-time qPCR, RT-qPCR)结果显示, 宽鳍鱲IGF-Ⅰ mRNA在肝脏组织中的表达水平最高, 其次是性腺、脾脏、心脏和脑, 在肾脏中表达水平最低。在7—8月, 处于繁殖期的性成熟宽鳍鱲性腺中IGF-Ⅰ表达水平显著上升, 繁殖期过后回落至最低值。在其他组织中IGF-Ⅰ表达水平在生长发育过程和繁殖期前后波动不大, 且雄鱼大多数组织中IGF-Ⅰ基因平均表达水平高于雌鱼。荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization, FISH)定位显示, 宽鳍鱲IGF-Ⅰ基因基本为胞浆阳性, 少数为核阳性, 在肝组织中呈全胞质性分布, 在性腺组织的精母细胞、卵泡膜及卵泡液中阳性表达。上述结果表明宽鳍鱲IGF-Ⅰ基因表达模式具有性别差异性, 推测精巢中IGF-Ⅰ在繁殖期的高表达是宽鳍鱲雄性成体大于雌性成体的原因之一。研究结果为宽鳍鱲的性二态和人工繁育的研究提供参考资料。     

草鱼IGF—Ⅰ cDNA的克隆和在原核生物中的表达

根据亲缘关系较近的鲤鱼胰素样生长因子－Ⅰ（IGF－Ⅰ）cDNA设计一对引物,通过RT－PCR从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）肝组织首次克隆了草鱼IGF－ⅠcDNA开放阅读框（ORF）片段,经序列分析表明克隆的草鱼IGF－ⅠcDNA为Ea－2亚型,ORF与鲤鱼有95％的同源性,与人有63％的同源性;草鱼IGF－Ⅰ蛋白与鲤鱼IGF－Ⅰ仅2个氨基酸残基不同,与人IGF－Ⅰ也仅有13个残基不同,将表达成熟草鱼IGF－Ⅰ(gcIGF-Ⅰ）蛋白的cDNA片段亚克隆至谷胱甘肽S－转移酶（GST）融合表达载体pGEX－4T－3,再将构建的重组表达载体pGEX-T-gcIGF-Ⅰ转入大肠杆菌BL21。在IPTG的诱导下,GST－gcIGF-Ⅰ融合蛋白高效表达。兔抗鲑鱼IGF－Ⅰ抗血清进行了Western Blot检测显示重组草鱼IGF－Ⅰ蛋白具有免疫活性。     

翘嘴鲌胰岛素样生长因子-Ⅰ的克隆及序列分析

为探讨胰岛素样生长因子-Ⅰ(Insulin like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)对于翘嘴鲌(Culter alburnus)生长性状的影响, 对其DNA序列进行了克隆。翘嘴鲌IGF-Ⅰ全长14567 bp, 由5个外显子和4个内含子组成。其5个外显子长度分别为298、160、182、36 和1360 bp。推测的阅读框为486 bp, 编码由161个氨基酸组成的IGF-Ⅰ前体蛋白。前体肽由信号肽、成熟肽、E肽三部分组成, 其中信号肽44个氨基酸, 成熟肽70个氨基酸, E肽47个氨基酸。成熟肽由B、C、A、D四个区域组成, 其中B结构域和A结构域的保守性最高, 在这2个区域包含由6个半胱氨酸残基形成的3个二硫键。翘嘴鲌B区域还包含保守的IGF-Ⅰ受体识别序列(PheB23-TyrB24-PheB25)。E肽的长度表明翘嘴鲌IGF-Ⅰ属Ea-2型。同源性分析表明翘嘴鲌与鲤科鱼类的IGF-Ⅰ编码氨基酸同源性较高, 为94%—100%, 但在聚类分析中翘嘴鲌并不是首先和鲌亚科的鱼类聚集在一起。Real-time qPCR组织特异性表达结果显示IGF-Ⅰ mRNA在肝脏组织中的表达量最高, 脾、心脏、精巢、脑次之, 肾、鳃、胃和卵巢中表达量较低。翘嘴鲌IGF-Ⅰ基因4个内含子长度分别为1170、9364、251 和1746 bp。相对外显子来说, 种间内含子变异较大, 其中第三内含子变异最大。翘嘴鲌IGF-Ⅰ基因中包含6个微卫星, (GATG)₅AATAT (ATAG)₁₁位于第一内含子中, (CT)₈、(TTA)₅、(AC)₁₃、(TG)₁₂和(ATT)₅位于第二内含子中。其中4个微卫星位点具有多态性, 将它们在120尾同塘养殖的翘嘴鲌中进行基因型与生长性状的关联性分析, 均未达到显著水平(P>0.05)。结果为进一步研究该基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

基于蛋白质结构预测的胰岛素样生长因子-1的制备及活性分析北大核心CSCD

为了更经济高效地制备胰岛素样生长因子-1 (insulin-like growth factor-1, IGF-1),本研究采用计算机模拟技术对3种IGF-1融合蛋白进行蛋白质结构预测与分子对接,筛选出酶切最适配的IGF-1融合蛋白表达形式。利用基因工程技术构建并鉴定了IGF-1融合蛋白原核表达载体,并转化大肠杆菌Origami B(DE3)菌株,获得重组子;经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导表达后,对菌体的破菌上清进行亲和层析、脱盐、凝血酶酶切及酶切产物亲和层析纯化得到目的蛋白;通过3T3细胞增殖法建立活性评价体系并对获得的IGF-1进行活性测定。结果显示,构建的IGF-1融合蛋白原核表达载体序列正确,获得的重组子在25℃、0.05 mmol/L IPTG诱导16 h时融合蛋白为可溶性表达,经初步纯化、凝血酶酶切、再次纯化后可获得纯度大于90%的IGF-1目的蛋白,在建立的活性评价体系下测得制备的IGF-1比活为2.47×10^(5)U/mg,与市售标准品接近。本研究建立了一条用于制备IGF-1的完整工艺路线,为IGF-1药物的研制及工业化生产奠定基础。     

甲状旁腺素、胰岛素样生长因子-Ⅰ对骨特征性标志蛋白的影响

为了阐明甲状旁腺素（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ,ＰＴＨ）、胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－Ⅰ,ＩＧＦ－Ⅰ）在促成骨样细胞ＲＯＳ１７／２．８增殖的同时对其分化状况的影响,研究了ＰＴＨ、ＩＧＦ－Ⅰ对骨特征性标志蛋白碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ,ＡＬＰ）活性、骨钙素（ｏｓｔｅｏｃａｌ－ｃｉｎ）ｍＲＮＡ表达及骨胶原蛋白（ｃｏｌａｇｅｎ）合成的影响．结果表明,ＰＴＨ、ＩＧＦ－Ⅰ均可抑制ＡＬＰ活性,ＰＴＨ的抑制作用强于ＩＧＦ－Ⅰ,抑制作用具有时间剂量依赖性;ＰＴＨ、ＩＧＦ－Ⅰ均可诱导骨钙素ｍＲＮＡ表达增加;ＰＴＨ能够促进３Ｈ－脯氨酸参入新生小鼠颅骨组织,既ＰＴＨ能够骨胶原蛋白合成增加．这些结果提示,ＰＴＨ、ＩＧＦ－Ⅰ在促成骨样细胞ＲＯＳ１７／２．８增殖的同时也促进其分化,表明在成骨细胞的生发成熟过程中,增殖、分化现象相辅相成,相伴而行．