鸭疫里氏杆菌CH-1株B739_RS03695基因的功能鉴定

【背景】鸭疫里默氏杆菌是一种可引起鸭传染性浆膜炎的革兰氏阴性病原菌。对于该菌的铁离子转运系统已有大量研究，但有关该菌铁硫簇装配基因的功能知之甚少。【目的】序列分析表明，鸭疫里默氏杆菌CH-1株B739＿RS03695编码铁硫结合蛋白，但其具体功能未知。本研究旨在鉴定鸭疫里默氏杆菌CH-1株B739＿RS03695基因在抗氧化应激及耐药中的功能。【方法】构建B739＿RS03695缺失株，通过测定生长曲线、氧化应激存活率探究其在抗氧化应激中的功能；通过最小抑菌浓度、杀菌试验探究其在耐药中的功能。【结果】与亲本株相比，RA CH-1ΔB739＿RS03695在GCB培养基中生长不受影响，但在铁限制性培养基中的生长受到明显抑制；与亲本株相比，RA CH-1ΔB739＿RS03695对H₂O₂的敏感性增加；与亲本株相比，RA CH-1ΔB739＿RS03695对庆大霉素的抵抗力显著增加；荧光定量PCR结果表明，与对照组相比，B739＿RS03695基因的转录水平在铁限制性条件和存在过氧化氢条件下显著上调。【结论】B739＿RS03695基因缺失后会损...     

鸭疫里氏杆菌hemH基因功能初步鉴定及其缺失株的转录组学分析

血红素是绝大多数细菌生长繁殖所必需的一种营养物质,其参与了细菌多种重要的生理过程。细菌可以通过自身合成和从外界摄取2种方式获得血红素。然而过多的血红素对细菌是有毒性的,细菌则会利用外排、螯合和降解等多种方式减轻血红素毒性。鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)是一种感染禽类的革兰氏阴性菌,前期研究表明该菌可通过转运的方式从外界环境摄取血红素。然而,是否该菌也可以自身合成血红素未知。基因组分析发现鸭疫里氏杆菌ATCC11845菌株中的基因RA0C＿RS08070编码铁螯合酶(ferrochelatase) HemH,是参与将铁插入卟啉中心,形成血红素的关键酶。hem H缺失后会导致铁离子和卟啉的积累,对细菌造成毒性。【目的】为鉴定Hem H在合成血红素中的功能及查找参与鸭疫里氏杆菌铁离子和卟啉解毒相关基因。【方法】本研究构建了RAATCC11845Δhem H缺失株,并检测亲本株和hem H缺失株在GCB以及GCB添加血红蛋白液体培养基中的生长情况;随后对亲本株和hem H缺失株进行转录组测序并进行比较分析。【结果】RAATCC11845Δhem H缺失...     

鸭疫里氏杆菌hemH基因功能初步鉴定及其缺失株的转录组学分析

血红素是绝大多数细菌生长繁殖所必需的一种营养物质,其参与了细菌多种重要的生理过程。细菌可以通过自身合成和从外界摄取2种方式获得血红素。然而过多的血红素对细菌是有毒性的,细菌则会利用外排、螯合和降解等多种方式减轻血红素毒性。鸭疫里氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是一种感染禽类的革兰氏阴性菌,前期研究表明该菌可通过转运的方式从外界环境摄取血红素。然而,是否该菌也可以自身合成血红素未知。基因组分析发现鸭疫里氏杆菌ATCC11845菌株中的基因RA0C_RS08070编码铁螯合酶(ferrochelatase)HemH,是参与将铁插入卟啉中心,形成血红素的关键酶。hem H缺失后会导致铁离子和卟啉的积累,对细菌造成毒性。【目的】为鉴定Hem H在合成血红素中的功能及查找参与鸭疫里氏杆菌铁离子和卟啉解毒相关基因。【方法】本研究构建了RAATCC11845Δhem H缺失株,并检测亲本株和hem H缺失株在GCB以及GCB添加血红蛋白液体培养基中的生长情况;随后对亲本株和hem H缺失株进行转录组测序并进行比较分析。【结果】RAATCC11845Δhem H缺失株不能在GCB培养基中生长,而在GCB培养基补充血红蛋白后生长良好。转录组测序及比较分析发现,与亲本株相比,hem H缺失株中有354个显著差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)。基因本体论(gene ontology,GO)功能富集分析发现差异表达基因主要富集在催化活性、生物调节和代谢过程等途径,京都基因和基因组百科全书(Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes,KEGG)通路富集分析发现差异表达基因主要富集在氨基酸代谢、氧化磷酸化和三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA cycle)等途径。【结论】Hem H参与了血红素的合成,hem H缺失后导致大量的基因表达改变来适应代谢的改变,为进一步研究鸭疫里氏杆菌的Hem H的功能奠定基础。     

猪链球菌2型Orf207基因缺失菌株的构建及其生物学特性检测

【背景】猪链球菌2型(streptococcus suis type 2, SS2)可引起人、猪的脑膜炎、关节炎及败血症等,不仅给养猪业带来巨大的经济损失,同时严重威胁公共卫生安全。本团队前期通过噬菌体展示文库技术发现Orf207编码蛋白可能参与SS2诱导的脑膜炎发生,然而其在SS2致病过程中的具体作用尚不清楚。【目的】探究Orf207基因对SS2致病性的影响。【方法】采用温敏性自杀质粒介导的同源重组系统,构建SC19 Orf207基因缺失菌株ΔOrf207及其回补菌株CΔOrf207,系统比较缺失菌株与野生株间在生长特性、形态、组织定殖能力、毒力情况、细胞黏附与侵袭及抗巨噬细胞吞噬能力等生物学特性方面的差异。【结果】与野生株相比,缺失菌株链长变短,生长速度略慢;而且Orf207缺失显著增加了小鼠的存活率,降低了细菌在血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑组织的定殖能力和对肺组织的病理损伤并显著减弱SS2对HeLa细胞的黏附与侵袭能力及抗巨噬细胞吞噬能力。【结论】Orf207基因可以显著降低SS2对宿主的致病能力,本研究结果不仅丰富了SS2的致病机制,也为SS2疫苗等研发提供了新靶点。     

地衣芽孢杆菌9945a转运蛋白YdgF1的功能鉴定

【目的】本研究对地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 9945a菌株中ydgF1基因编码的转运蛋白进行功能鉴定。【方法】分别构建ydgF1基因过表达株9945a/pHY300-Shu-ydgF1和敲除株9945aΔydgF1,设计了以D-丙氨酸为唯一氮源的磷酸盐D-丙氨酸(phosphate D-alanine, PDA)培养基来考察菌株的生长能力,并进行细胞吸收实验。利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)评价菌株9945a与9945aΔydgF1在LB培养基中不同生长时期ydgF1的相对表达量,然后对9945a与9945aΔydgF1后期的培养基平板活菌计数,计算菌落形成单位(colony-forming units, CFU)。【结果】在PDA培养基中,9945aΔydgF1的比生长速率始终低于9945a,而9945a/pHY300-Shu-ydgF1最大比生长速率为0.336h–1,是9945a/pHY300-Shu的1.98倍,并且培养15 h后9945...     

T3SS1和T3SS2影响副溶血弧菌生物学特性及细胞致病性的比较

【目的】探究两套Ⅲ型分泌系统T3SS1和T3SS2影响副溶血弧菌生物学特性及细胞致病性的差异和相关性。【方法】以T3SS1和T3SS2主要结构基因vcrD1和vcrD2为研究对象,利用同源重组技术分别构建单基因和双基因缺失株ΔvcrD1、ΔvcrD2、ΔvcrD1-vcrD2,以及互补株CΔvcrD1和CΔvcrD2;分析各菌株的生长特性、生物被膜形成能力、运动性的差异;比较各菌株对细胞毒性以及对细胞炎性因子转录水平的影响。【结果】与野生株相比,各缺失株的生长速度无显著差异。缺失株ΔvcrD1生物被膜形成能力、运动性和细胞毒性均极显著下降;缺失株ΔvcrD2主要表现为细胞炎性因子IL-1β和IL-6转录水平的显著上调,同时对细胞毒性作用下降。双基因缺失株ΔvcrD1-vcrD2在缺失株ΔvcrD1的基础上,生物被膜形成能力、运动性、细胞毒性均进一步显著下降,但在细胞炎性因子的转录水平上,则与ΔvcrD1一致,与野生株相比均无显著差异。【结论】T3SS1和T3SS2对副溶血弧菌生物学特性和细胞致病性的影响存在差异。T3SS1主要影响细菌的生物被膜形成、运动性及细胞毒性作用;T3SS2不影响生物被膜形成、运动性等生物学特性,参与细菌对细胞炎性反应中的负调控作用,同时具有一定的细胞毒性作用。T3SS1有助于副溶血弧菌在环境中的生存,而T3SS2可有利于细菌在宿主体内免疫逃避的过程。T3SS1和T3SS2对副溶血弧菌生物学特性和细胞致病性的影响可能存在一定的相关作用,具体机制有待进一步研究。     

kpsE和kpsD双基因缺失显著降低肠道外致病性大肠杆菌的毒力

【目的】探究荚膜对肠道外致病性大肠杆菌致病作用的影响。【方法】选取负责荚膜多糖转运的基因kpsE和kpsD,利用λRed重组系统构建APEC E058和UPEC U17荚膜缺失株E058ΔkpsED和U17ΔkpsED,并通过一系列的体内及体外试验对其生物学特性及致病性进行研究。【结果】双基因缺失株的生长速度较野生株没有明显差异,但缺失株抗血清补体杀菌能力和抗鸡巨噬细胞HD-11细胞吞噬能力显著下降。1日龄雏鸡LD50致病性试验结果显示,缺失株E058ΔkpsED和U17ΔkpsED对鸡失去致病力,而回复株毒力恢复至野生株水平;35日龄SPF鸡体内动态分布和竞争试验显示ΔkpsED缺失株在鸡体内定殖能力和竞争性生长能力显著下降,表明kpsED双基因的缺失能显著降低APEC E058和UPEC U17的致病力。【结论】荚膜与肠道外致病性大肠杆菌的致病性相关,是其重要的毒力因子。     

副溶血弧菌Ⅲ型分泌系统vscG基因缺失株的构建及其生物学特性

【背景】副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种重要的食源性病原微生物,Ⅲ型分泌系统(TypeⅢSecretionSystem,T3SS)在致病过程中发挥重要作用。vscG基因编码的Vsc G蛋白是Ⅲ型分泌系统的伴侣蛋白。vscG基因在副溶血弧菌中的生物学功能尚未确定。【目的】构建副溶血弧菌vscG基因的缺失株和回补株,研究vscG基因对副溶血弧菌生物学特性的影响。【方法】在副溶血弧菌POR-1菌株基础上利用同源重组法构建vscG基因的缺失株ΔvscG和回补株CΔvscG,分析比较POR-1、ΔvscG和CΔvscG在生长性能、生物被膜形成能力、运动性、溶血活性、细胞黏附和细胞毒性等方面存在的差异。【结果】与POR-1菌株相比,缺失株ΔvscG和回补株CΔvscG的生长特性和溶血活性无明显差异,缺失株ΔvscG的生物被膜形成能力下降,运动性较POR-1菌株和回补株CΔvscG增强。细胞感染试验显示,vscG基因的缺失明显降低了副溶血弧菌对HeLa细胞的黏附和毒性作用。【结论】vscG基因影响副溶血弧菌生物被膜的形成和运动性,在该菌黏附细胞和发挥细胞毒性过程中具有重要作用,为进一步探讨副溶血弧菌T3SS的致病机理奠定基础。     

马克斯克鲁维酵母GX-UN120糖转运蛋白基因的克隆及表征

【背景】马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有完整的木糖代谢途径,可以高效利用木质纤维素中的木糖,因此对其糖转运蛋白基因的研究或可有效解决酵母木糖转运的相关问题。【目的】根据马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042中KLMA＿70145和KLMA＿80101基因位点的功能预测,获得马克斯克鲁维酵母GX-UN120相应的糖转运蛋白基因序列并探究其功能。【方法】将转运蛋白基因分别克隆表达至酿酒酵母EBY.VW4000中考察重组菌株生长特性,以此间接评价对应转运蛋白的转运能力。【结果】Km＿SUT2基因编码的糖转运蛋白可有效提高宿主细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖、果糖、蔗糖和半乳糖。类似地,Km＿SUT3基因编码的糖转运蛋白可提高细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、半乳糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖和果糖。然而在葡萄糖存在的条件下,重组菌株对各种碳源的利用均受抑制,但Km＿SUT3转运木糖和核糖过程中受葡萄糖的抑制作用较小。【结论】马克斯克鲁维酵母GX-UN120中转运蛋白Km＿SUT2和Km＿SUT3可...     

组氨酸氨解酶HutH对副溶血弧菌生物学特性及致病性的影响

组氨酸氨解酶(HutH)作为组氨酸代谢通路上的第一个代谢酶,控制细菌内部组氨酸的代谢。HutH在多数细菌中高度保守,参与细菌的能量代谢平衡。【目的】选取HutH作为研究对象,探究其对副溶血弧菌生物学特性以及致病性的影响。【方法】利用同源重组的方法构建缺失株ΔhutH和回补株CΔhutH。研究HutH对副溶血弧菌生长特性、组氨酸利用能力、组氨酸代谢相关基因表达水平、运动性、生物被膜、环境耐受、细胞毒性以及对小鼠毒力的影响。【结果】与野生型菌株相比,hutH基因缺失不影响副溶血弧菌的生长特性、耐酸耐碱能力、耐盐能力和群集运动。但ΔhutH在组氨酸作为唯一碳源的M9极限培养基中生长受到显著抑制。另外,我们证实,hutH基因缺失使组氨酸代谢操纵子内的相关基因转录水平显著下降,基因VP0889的表达水平提高。hutH基因缺失导致副溶血弧菌生物被膜形成能力下降、泳动能力下降、对HeLa细胞的毒性降低、对ICR小鼠的致死率显著降低。【结论】本研究表明,hutH基因缺失影响副溶血弧菌代谢组氨酸的能力,而且首次证实,HutH在副溶血弧菌的生物被膜形成、运动性和对小鼠毒力等方面具有重要作用,为从调控组氨酸...     

江苏地区10株鹅源鸭疫里默氏杆菌的耐药性及致病性特征分析

[背景] 鸭疫里默氏杆菌感染是危害水禽业最严重的细菌传染性病之一,鹅源鸭疫里默氏杆菌病的发病率有逐渐增高趋势,给养鹅业带来了巨大经济损失。[目的] 为更好地预防控制鹅源鸭疫里默氏杆菌病、解决鹅养殖场临床用药问题及进一步探究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系。[方法] 对江苏地区的发病鹅进行鸭疫里默氏杆菌的分离培养、多重PCR方法鉴定及生化试验,并对分离获得的10株鸭疫里默氏杆菌进行药敏试验、血清型鉴定及雏鸭致病性试验。[结果] 药敏试验结果显示,鹅源分离菌株对大观霉素、磺胺异噁唑、头孢曲松、头孢拉定、氟苯尼考最敏感,对新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素和克林霉素耐药性最高且多重耐药性严重。血清型鉴定表明,江苏地区分离的10株鹅源鸭疫里默氏杆菌主要以血清型2型为主。雏鸭致病性试验表明,鹅源鸭疫里默氏杆菌分离株均引起雏鸭不同程度发病,其中3株鹅源临床分离株经1×10⁷ CFU/羽攻毒后可引起雏鸭100%的致死率。[结论] 为鹅源鸭疫里默氏杆菌的预防控制、临床治疗及进一步研究鸭源和鹅源鸭疫里默氏杆菌之间的关系提供依据。     

基于响应面分析的高抗原活性鸭疫里默氏杆菌疫苗培养基的研制及其效果评价

【背景】鸭疫里默氏杆菌广泛存在于养殖场,引起雏鸭发生传染性浆膜炎,严重危害养鸭业的发展。【目的】提高鸭疫里默氏杆菌发酵培养水平和抗原活性,为鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的研制提供技术指引。【方法】利用单因素及响应面的试验设计方法,针对鸭疫里默氏杆菌进行疫苗培养基的研制,并探究不同发酵时间点该菌的抗原活性,选择抗原活性最高点时制备灭活疫苗,通过动物免疫保护试验评价疫苗免疫效果。【结果】使用研制的疫苗培养基发酵培养鸭疫里默氏杆菌,其活菌数能够达到4.68×1010 CFU/mL,较市面上该菌专用的培养基提高2.29倍。该菌发酵12 h后抗原活性达到最高,在此时制备的灭活疫苗诱导小鼠产生的抗体水平显著高于商品化灭活疫苗,攻毒保护率达到了100%。【结论】本研究研制的培养基具有优异的增菌效果,可作为生产鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗抗原的发酵培养基,疫苗生产过程中可选择菌株抗原活性达到最高时收集菌体。     

布鲁氏菌入侵相关基因IalB缺失株的构建及生物学特性分析

入侵相关基因(invasion-associated locus B, ialB)的同源基因在布鲁氏菌所属的根瘤菌目中是广泛保守的,但其在布鲁氏菌中的功能研究几乎为空白。根据有限的报道资料,猜测ialB的功能可能与布鲁氏菌入侵细胞以及适应胞内环境胁迫有关。【目的】探究ialB在布鲁氏菌中的生物学功能,揭示其在布鲁氏菌黏附和入侵细胞以及胞内存活中的作用。【方法】以猪种布鲁氏菌S2株为亲本,运用同源重组的方法构建布鲁氏菌ialB缺失株ΔialB,并通过表达质粒转化的方法构建其回补株CΔialB,比较3种菌株的生长特性、对体外应激的敏感性;通过扫描电镜观察ialB缺失对布鲁氏菌形态的影响,通过实时荧光定量PCR检测3种菌株极性延长相关基因的表达;通过免疫荧光和平板计数的方法分析ialB缺失对布鲁氏菌黏附、入侵RAW264.7细胞以及胞内存活的影响。【结果】成功构建了菌株ΔialB和CΔialB;ΔialB与布鲁氏菌S2株相比,生长受限,活力降低,在酸应激、高渗应激、低渗应激、多黏菌素B应激条件下存活率降低,在氧化应激条件下存活率上升;而且,ΔialB的菌体形态发生改变,菌体变短,直径增加,极...     

硫氧还蛋白Lmo1903介导单增李斯特菌抵抗氧化应激的生物学功能研究

【目的】以单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)硫氧还蛋白Lmo1903为研究对象,研究其在细菌环境适应过程中的抗氧化应激生物学作用。【方法】使用生物信息学方法分析Lmo1903的进化关系和关键活性位点,使用酶切连接的方法构建Lmo1903蛋白表达载体,获得纯化的重组蛋白,以胰岛素为底物分析其氧化还原酶学活性;同时制备鼠源多克隆抗体,分析其在细胞内的定位;采用核苷酸定点突变技术构建CX1X2C基序中的半胱氨酸点突变蛋白,分析关键位点半胱氨酸对Lmo1903酶活的影响;采用同源重组原理构建lmo1903基因缺失株Δlmo1903和回补株CΔlmo1903,研究lmo1903在单增李斯特菌生长、运动和抗氧化应激方面发挥的功能。【结果】生物信息学分析显示,Lmo1903含有CX1X2C基序,与枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的TrxA的亲缘关系较近,属于硫氧还蛋白家族成员,主要定位在细菌细胞质中,具有较强的还原酶学活性,突变CX1X2C基序中的半胱氨酸残基会显著降低Lmo1903的还原酶活能力。缺失lmo1903不影响单增李斯特菌的生长能力,但显...     

猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶介导细菌应激与致病作用

【背景】硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase,TRR）是硫氧还蛋白系统关键组成部分,对病原菌应对体内外氧化应激、调节细菌稳态和介导致病过程具有重要作用。【目的】探究硫氧还蛋白还原酶TRR在人畜共患猪链球菌2型感染过程中参与的生物学效应。【方法】同源重组法构建猪链球菌2型硫氧还蛋白还原酶trr基因缺失株（Δtrr）及回补株（cΔtrr）,通过细菌染色、点板计数、体外细胞和动物感染模型等试验比较分析trr基因对细菌形态、抗应激反应及致病过程的影响。【结果】缺失trr对猪链球菌2型形态与生长特性的影响不大,但可增强细菌抗热应激、氧化应激和酸应激能力,缺失株对上皮细胞黏附力下降,侵袭进入脑血管内皮细胞作用显著降低,易于被吞噬细胞吞噬清除,对小鼠模型致病效应显著减弱。【结论】猪链球菌2型TRR因子参与细菌应激反应,介导细菌黏附、侵袭等致病过程,是猪链球菌2型新的潜在毒力因子。     

毒力基因yqeH功能分析及对禽致病性大肠杆菌致病性的影响

【背景】禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)可引起禽类急性或亚急性感染,在近年新发现的大肠杆菌Ⅲ型分泌系统2 (Escherichia coli type III secretion system 2,ETT2)中,毒力基因yqeH对其致病性的影响尚不明确。【目的】探究yqeH在APEC致病过程中的作用,为后期深入研究ETT2致病机制奠定基础。【方法】利用Red同源重组技术构建yqeH缺失株ΔyqeH及其回复株CΔyqeH,通过运动性、生物被膜形成能力、抗逆性、抗血清杀菌能力等试验分析yqeH对APEC生物学功能的影响,并通过细胞黏附、侵袭试验、致病力测定及荧光定量PCR检测细胞炎性因子转录水平,探究yqeH对APEC感染宿主的影响。【结果】构建了缺失株ΔyqeH和回复株CΔyqeH;生物学特性试验结果表明,与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH生物被膜形成能力、运动能力降低,对酸、碱、渗透压、氧化休克的耐受力降低,抗血清杀菌能力及致病力显著降低;与野生株APEC81相比,缺失株ΔyqeH对鸡气管黏膜上皮细胞的黏附及侵袭能...     

转录组分析罗伯茨绿僵菌精胺合成酶MrSPS介导真菌血腔定殖功能

【背景】精胺在植物应对逆境胁迫、动物抵抗疲劳和衰老、真菌生长代谢等过程中发挥重要作用,但目前在昆虫病原真菌中的研究未见报道。【目的】在分子水平上探究罗伯茨绿僵菌精胺合成关键酶——精胺合成酶在昆虫血腔定殖中的作用机制。【方法】显微注射法测定Mrsps敲除株ΔMrsps的致病力变化,并观察血腔中ΔMrsps生长状态;收集ΔMrsps和野生型WT注射侵染30 h后的大蜡螟血淋巴进行转录组测序,分别与罗伯茨绿僵菌和大蜡螟参考基因组进行比对分析,并结合定量PCR进行验证。【结果】与WT和回补株ΔMrsps-cp相比较,ΔMrsps致病力显著下降,而且随着注射浓度的降低,ΔMrsps致病力下降越显著。侵染36 h后WT和ΔMrsps孢子都能正常萌发且开始以类酵母状态生长,60 h后,相较于WT,ΔMrsps的生长繁殖数量较少。转录组共检测到3 202个罗伯茨绿僵菌基因,其中1 769个基因在ΔMrsps中表达上调,922个基因表达下调;差异表达基因涉及碳水化合物代谢、运输、分解代谢、翻译和氨基酸代谢等多条途径;筛选出28个血腔致病相关基因全部在ΔMrsps中表达下调;定量PCR检测发现在整个血腔定殖阶段免疫逃避蛋白Mcl1基因和血腔定殖Colonization of hemocoel 1基因在WT和ΔMrsps-cp中的表达量高于ΔMrsps。共检测到13 249个大蜡螟基因,其中4 026个差异表达基因;KEGG注释分析显示大量差异表达基因富集到内分泌系统和免疫系统等途径;深入分析发现22个差异表达基因归属于Toll和Imd信号通路,其中18个基因在ΔMrsps侵染的大蜡螟中表达上调,表明ΔMrsps侵染大蜡螟过程中更易引起免疫系统的激活。【结论】揭示了Mrsps在罗伯茨绿僵菌血腔定殖阶段作用的分子机制,为进一步揭示精胺在真菌中的作用机理提供了理论基础。     

鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及生物学特性

【背景】鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭、鹅、火鸡等多种家禽、野禽发生传染性浆膜炎的病原,在全世界范围内广泛存在,危害养禽业发展,造成严重的经济损失。【目的】了解国内RA的流行现状,探究该菌的生物学特性,更好地指导防控鸭疫里默氏杆菌病。【方法】对2020-2021年从山东省、河北省、广东省、山西省等地分离的RA疑似菌株进行PCR、生化和血清型鉴定,并根据药物敏感性结果分析耐药现象,根据半数致死量(median lethal dose,LD₅₀)测定结果分析致病力差异。【结果】共鉴定78株RA分离株,其中,血清1型4株、2型21株、10型11株、6型3株、7型17株,1株有交叉凝集现象,21株血清型未定型;药敏结果显示78株分离株对多粘菌素B、磷霉素、克林霉素等的耐药性最强,对头孢拉定、多西环素、呋喃唑酮、氟苯尼考等抗生素最为敏感,并且78株分离株均存在多重耐药性,其中77株耐药5重及以上;动物试验结果显示,RA的分离株致病力普遍较强,而且不同地区分离株、同地区不同分离株之间均存在差异,数株RA分离株的LD₅₀在10⁴-10⁷ CFU不等。【结论】RA在国内流行表现了强致病力及严重耐药情况,本研究结果为更好地预防控制、临床用药及后续致病机制研究提供了参考依据。     

鸭疫里默氏菌DnaK、OmpA和OmpA-DnaK蛋白的免疫原性

【背景】鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)可引起鸭等多种禽类败血症和浆膜炎,给禽养殖业造成严重经济损失。蛋白疫苗是预防RA感染的重要策略之一。目前,有关RA重组蛋白免疫原性报道较少,且其应用也受到单一蛋白抗原诱导的特异性免疫反应不足的限制。【目的】探究分子伴侣DnaK、外膜蛋白A (outer membrane protein A,OmpA)和OmpA-DnaK蛋白疫苗在鸭体内诱导的免疫应答,评估其免疫原性,为RA疫苗抗原研发提供依据。【方法】克隆DnaK和OmpA基因并分别与pET-32a(+)载体相连,利用限制性酶切位点Nco I和Bam H I将OmpA连接至DnaK基因上游,经原核表达和纯化制得重组蛋白DnaK、OmpA和OmpA-DnaK。3种重组蛋白分别皮下免疫雏鸭2次,检测其血清抗体滴度、淋巴细胞增殖和细胞因子(IL-2和IL-4)水平;以RA-GH5肌肉注射攻毒,检查其组织病理学变化及免疫保护率。【结果】成功表达了DnaK、OmpA和OmpA-DnaK重组蛋白,分子量分别约为90、60和130 kDa。3种蛋白疫苗均能诱导宿主产生体液...     

AsSlt2基因对茄链格孢细胞壁完整性的调控

【背景】由茄链格孢(Alternaria solani)引起的马铃薯早疫病被普遍认为是马铃薯生产上的第二大叶部病害,在马铃薯各产区普遍发生,给马铃薯生产造成了巨大的经济损失。【目的】明确AsSlt2基因对茄链格孢细胞壁完整性的影响。【方法】在含有刚果红、细胞壁降解酶和十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate,SDS)等细胞壁胁迫的培养基上观察ΔAsSlt2缺失突变株的生长情况,计算相对生长抑制率;通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)方法检测ΔAsSlt2菌株中细胞壁合成相关基因的表达情况;进一步检测ΔAsSlt2细胞壁中几丁质的含量及胞外酶活性。【结果】ΔAsSlt2缺失突变株对SDS、刚果红、细胞壁降解酶等细胞壁胁迫的敏感性增强,在加入细胞壁降解酶后突变株原生质体释放量显著增多;ΔAsSlt2对外源氧胁迫更敏感,突变株胞外过氧化物酶和漆酶活性均显著降低;进一步研究发现,ΔAsSlt2细胞壁中几丁质含量减少,几丁质合成相关基因与漆酶合成相关基因的表达量均明显降低。【结论】AsSlt2基因在茄链格孢细胞壁的完整性及抵御外界胁迫方面发挥重要作用。