一株拮抗黄单胞菌的贝莱斯芽孢杆菌的分离和鉴定

【目的】为了筛选防治水稻条斑病(bacterial leaf streak,BLS)的生防细菌。【方法】以水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola,Xoc)的模式菌株RS105为靶标菌,采用平板稀释和抑菌圈法,从空心菜根际土壤中筛选到一株对RS105具有拮抗作用的细菌菌株504。通过形态学、生理生化特征以及16SrDNA和gyrA序列分析对菌株504进行了鉴定。利用牛津杯法测定504对植物病原黄单胞菌的拮抗活性及其无菌发酵液拮抗活性的稳定性。通过PCR扩增预测504编码合成脂肽类和聚酮类化合物的合成相关基因。采用苗期水稻注射接菌法来评价水稻组织中504对Xoc的拮抗活性。【结果】菌株鉴定结果表明504为贝莱斯芽孢杆菌,命名为Bacillusvelezensis504。抑菌实验显示,B.velezensis504对黄单胞菌属的细菌具有较好的抑菌活性,对水稻白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae,Xoo)的拮抗效果最显著。基因预测结果显示,B. velezensis 504含有fenA、dhbA、sfrA、bmyA、beaS、dfnA及bacA等编码脂肽类和聚酮糖类抑菌化合物的基因簇。其无菌发酵液的活性物质耐高温和蛋白酶降解,但不耐强酸、强碱,在pH值为5.5–8.9时仍具有稳定的拮抗活性。在高感水稻品种原丰早上,B. velezensis 504对Xoc在水稻叶片中引起的水渍症状具有显著的抑制作用。【结论】B. velezensis 504能够特异性拮抗黄单胞菌,在黄单胞菌引起的细菌性病害的生物防治中将具有较大的应用潜力。     

贝莱斯芽孢杆菌的分类、拮抗功能及其应用研究进展

芽孢杆菌(Bacillusspp.)作为生防细菌,已广泛应用于农作物、畜、禽、水产动物的病害防控,也是当今微生物生态防控的研究热点。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)是芽孢杆菌属的一个新种,因其能够产生多种次级代谢产物,并且具有广谱抑菌活性和促生长作用,被广泛应用于动植物病害的生物防治。本文从贝莱斯芽孢杆菌的分类地位、鉴定方法、抑菌物质、拮抗功能基因、生防作用机制及其应用等方面进行了综述,对贝莱斯芽孢杆菌在工业、农业上的应用进行展望,并对存在的问题进行了探讨,以期为贝莱斯芽孢杆菌的深入研究和应用提供参考。     

芽孢杆菌FJAT-55034的鉴定、生长特性及对梨轮纹病菌的抑菌活性

【背景】由葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)引起的梨轮纹病是梨栽培生产中的主要病害之一,造成巨大的经济损失。【目的】对梨轮纹病菌具有较高拮抗活性的菌株FJAT-55034进行鉴定、生长特性及抑菌活性评价,为梨轮纹病的生物防治提供菌种资源。【方法】采用形态学观察、生理生化测定和16S rRNA基因序列分析进行拮抗菌株FJAT-55034的鉴定;通过生长曲线、培养温度和pH测定,研究该菌株的生长特性。采用抑菌圈法测定该菌株的抑菌谱;采用共培养、显微镜观察和果实回接,测定菌株FJAT-55034对梨轮纹病菌生长的抑制作用。【结果】拮抗菌株FJAT-55034鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。该菌株在20-50℃(最适温度30℃)和pH 5.0-9.0 (最适pH值7.0)均能够生长,NaCl添加量为0-5%时,该菌株均能够较好地生长。菌株FJAT-55034对6种果树不同病原真菌均具有不同程度的抑制作用,抑菌圈直径范围为19.8-29.1 mm;与梨轮纹病菌共培养后,菌株FJAT-55034对菌丝生长的抑制率为77.2%。菌株FJAT-5...     

芽孢杆菌拮抗苹果树腐烂病菌的筛选、鉴定及抑菌活性初探

【背景】苹果树腐烂病发生面积广、危害严重,目前对于该病的防治以化学防治为主,但存在一定的弊端,因此迫切需要寻找一种对该病高效、安全的防治措施。【目的】从敦煌地区盐碱土壤中筛选出对苹果树腐烂病有良好抑制作用的芽孢杆菌菌株。【方法】采用平板对峙培养法和菌丝生长速率法对盐碱土中分离筛选的芽孢杆菌进行拮抗苹果树腐烂病菌的筛选,并对优良拮抗效果菌株进行离体组织防效测定、发酵培养基选择以及结合培养形态、生理生化及16S rRNA基因序列分析进行菌种鉴定。【结果】初筛阶段菌株7-2-1-2对病原菌的抑制率为86.18%,复筛试验中发酵液对病原菌的抑制率为73.2%;在离体枝条创面涂抹菌株7-2-1-2发酵原液后,苹果树腐烂病菌的生长可被完全抑制;菌株7-2-1-2的最优生长培养基为NBY培养基;经初步鉴定,菌株7-2-1-2为枯草芽孢杆菌亚种(Bacillus subtilis subsp. spizizenii)。【结论】菌株7-2-1-2对苹果树腐烂病有较好的生防效果,为该病生防菌剂的选择提供了必要的菌种资源。     

一株具有防病促生功能的贝莱斯芽孢杆菌SF327

【目的】筛选植物根际促生贝莱斯芽孢杆菌,分析菌株的生防潜力和全基因组特征。【方法】通过温室小青菜促生试验以及植物益生表型的分析,明确具有促生功能的菌株SF327。用滤纸片法测定菌株SF327对5种植物病原真菌以及4种植物病原细菌的拮抗活性。通过大田喷雾接种的方式评价菌株SF327对水稻白叶枯病的防治潜力。利用antiSMASH分析预测菌株SF327产生的二次代谢产物。通过比较基因组分析SF327与2株植物根际益生贝莱斯芽孢杆菌的代表性菌株FZB42和SQR9的亲缘关系、核心基因以及二次代谢产物合成基因簇。【结果】菌株SF327能够产生生长素吲哚-3-乙酸,是一株有益的根围促生菌;对稻瘟病菌、黄瓜枯萎病菌、辣椒疫霉菌、橡胶树胶孢炭疽菌、尖孢炭疽病菌都具有明显的拮抗作用;也具有防治水稻白叶枯病的生防潜力。菌株SF327基因组全长4.08 Mb,GC含量为46.49%,共编码4 033个基因,含有13个潜在的次生代谢产物编码基因簇,不含有质粒。SF327与FZB42和SQR9具有较近的亲缘关系,有87%以上的核心基因相同,但与SQR9的亲缘关系较近。【结论】B. velezensis SF327是一株具有宽广拮抗谱的多功能菌株,具有较好的生防应用潜力。     

贝莱斯芽孢杆菌GDND-2对烟草镰孢根腐病菌生长发育的影响

【背景】尖孢镰孢(Fusariumoxysporum)引起的烟草根腐病在世界烟区普遍发生,严重影响烟草产量和质量,化学农药无法有效防治病害,利用生防菌防治该病成为研究热点。【目的】明确贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelenzensis)GDND-2对尖孢镰孢生长发育的抑制作用。【方法】制备含10%和20%GDND-2发酵滤液的PDA培养基,涂在玻片上,接种尖孢镰孢分生孢子,观察滤液对尖孢镰孢孢子萌发、菌丝生长、孢子形成和色素产生的影响,应用扫描和透射电镜观察菌体超微结构的变化。【结果】贝莱斯芽孢杆菌GDND-2发酵滤液延迟孢子萌发2h以上,造成芽管膨大畸形,促使菌丝提早分枝,抑制菌丝延伸,使菌丝产生畸形球状结构,10%和20%发酵滤液对菌丝生长抑制率达53.41%和61.58%。滤液延迟病菌产孢,显著抑制产孢量,影响孢子形态,刺激病菌产生色素。10%和20%发酵滤液延迟产孢20h和28h,对产孢量的抑制率为52.11%和78.85%,滤液促使病菌形成小型分生孢子。观察尖孢镰孢的超微结构,部分菌丝膨大、畸形,细胞壁变薄,细胞膜消失,细胞质渗出,胞内呈空腔结构;部分菌丝严重皱缩、扭曲、...     

沙福芽孢杆菌GX-H6的分离鉴定及对水稻细菌性条斑病的防病效果

水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak, BLS）由稻黄单胞菌稻生致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc）侵染引起,已成为我国南方水稻种植区的一个重要病害。为了筛选防治BLS的生防菌,以Xoc野生型菌株GX01为指示菌,采用含菌平板稀释法和牛津杯法,从花生根际土壤中筛选到一株对Xoc具有拮抗作用的细菌,编号为GX-H6。根据形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA和进化树分析,鉴定该菌株属于沙福芽孢杆菌（Bacillus safensis）。拮抗实验表明,B. safensis GX-H6菌株能够对多种黄单胞菌以及植物病原真菌具有较好的拮抗活性,尤其对引起水稻发生白叶枯病（bacterial blight, BB）的稻黄单胞菌稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）的拮抗效果最显著。温室和田间水稻植株试验表明,GX-H6菌株能较好地防治BLS和BB。对GX-H6菌株的基因组进行分析,发现该菌株的基因组中拥有与抗真菌、环境竞争相关的基因,同时也拥有地衣杆菌素（lichenysi...     

贝莱斯芽孢杆菌对果蔬土传病害的抑菌效果研究

本文以贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis CX-2为研究对象,采用平板对峙法测定其对辣椒疫霉病菌、香蕉枯萎病菌、番茄早疫病菌、西瓜枯萎病菌4种果蔬土传病害病原真菌的抑菌效果,利用菌丝生长速率法进一步研究了其无菌发酵液及挥发性气体的抑菌作用,以及该菌的耐盐特性和产吲哚乙酸(IAA)能力。结果表明:CX-2菌株对4种病原真菌均有拮抗作用,对番茄早疫病菌发挥的抑菌作用最大,抑菌率达66.39%;CX-2菌株的无菌滤液和挥发性气体同样具有抑制病原真菌生长的作用,其中无菌滤液对4种病原真菌的抑菌率均在70%以上,挥发性气体对香蕉枯萎病菌抑菌效果最好,抑菌率为82.04%;CX-2菌株可在含盐量高达10%的LB平板上生长,耐盐性强;CX-2菌株的IAA产量为7.85 mg/L,可促进植物生长。     

贝莱斯芽孢杆菌L-1对梨灰霉和青霉病菌的抑制作用评价及全基因组分析

【目的】明确贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)L-1对梨灰霉和青霉病菌的抑制作用,明确菌株L-1无菌发酵液拮抗活性的稳定性及可能的拮抗机制。【方法】通过离体测定、活体测定和病原菌菌丝形态观察,评价菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的拮抗活性。以梨灰霉病菌为供试病原菌,利用牛津杯法测定菌株L-1无菌发酵液拮抗活性的稳定性。利用Pacbio RSII三代测序技术测定L-1的全基因序列,将全基因序列与基因蛋白质序列数据库进行BLAST比对分析,预测菌株L-1可能产生的次生代谢产物及潜在的作用机制。【结果】菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的活体抑制率分别为92.88%和77.47%,能引起病原菌菌丝膨大、畸形。菌株L-1在含10%Na Cl的培养液中仍能正常生长,其无菌发酵液耐高温、酸、碱、紫外照射和蛋白酶降解,对病原菌具有稳定的拮抗活性。全基因序列分析结果显示菌株L-1有112个基因参与了多种碳源的代谢,可以利用多种碳源进行生长;含有参与亚精胺、海藻糖等与菌株抗逆性相关化合物合成的基因;次生代谢产物预测结果显示:L-1含有合成surfactin、fengycin、bacillibactin、bacillaene、macolactin、difficidin、bacilysin等多种肽聚糖和聚酮糖类抗性化合物的基因簇,以及能够降解病原菌细胞壁的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶相关的基因;此外菌株L-1含有生成乙偶姻等能够诱导植物抗性的基因。【结论】菌株L-1能有效拮抗多种梨果采后病害,抗逆性强,拮抗活性稳定,预测菌株L-1能够通过产生多种拮抗活性化合物和细胞壁水解酶类以及诱导植物抗性实现防病效果,具有很大的应用潜力。     

高产杀粉蝶菌素的链霉菌鉴定及其拮抗水稻白叶枯菌活性研究

【目的】为保证农业生产可持续性发展,研发和使用环境友好的生物农药受到全社会的高度重视。微生物代谢产物农药是我国目前应用最广的生物农药,也是未来发展绿色农药的一个重要方向。【方法】利用包含水稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo) PXO99A的NA培养基琼脂平板,从水稻根际土壤中筛选能抑制Xoo生长的链霉菌。通过高效液相色谱和质谱分析活性代谢产物的化学结构;采用剪叶法接种Xoo到水稻叶片后,再喷施杀粉蝶菌素溶液(0.1 g/L),2周后测定叶枯症状;采用响应面分析法优化高产杀粉蝶菌素的发酵培养基;采用PacBio SMRT测序平台+Illumina HiSeq X Ten平台开展全基因组测序。平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)用于比较HSW2009与其他链霉菌在全基因组水平的亲缘关系。【结果】分离到一株对Xoo生长有强抑制活性的链霉菌HSW2009,其活性代谢产物为杀粉蝶菌素A1(piericidin A1,简称PIE);喷施PIE可以减轻Xoo在水稻叶片内的侵染;优化HSW2009高产PIE的发...     

植物根际益生细菌代表性菌株贝莱斯芽孢杆菌FZB42对松材线虫的抑杀性

[目的]由松材线虫导致的松树萎蔫病是松树的毁灭性病害,也是我国最主要的林业病害之一.本研究测评了在农业上广泛使用的、我国微生物肥料行业主要菌种资源之一——贝莱斯芽孢杆菌,对松材线虫的潜在抑杀性能.[方法]选用贝莱斯芽孢杆菌的代表性菌株FZB42为材料,测定对不同条件下的菌液上清、不同菌株的菌液上清、细菌素plantaz...     

转鞭毛蛋白基因水稻细菌性条斑病抗性研究

该研究从生防菌枯草芽胞杆菌Bs-916中克隆了鞭毛蛋白基因,利用转基因载体pCAMBIA1300转入水稻,筛选得到98株阳性转基因植株。分子检测结果表明,有12个转基因株系可检测到目的基因的表达。随后抗病性鉴定表明,有3个转基因株系对水稻细菌性条斑病具有较高的抗性。该研究为目前水稻抗细菌性条斑病转基因研究拓宽了可应用基因资源的范围。     

基于xkdB假基因座位的瓦雷兹芽孢杆菌FZB42超折叠GFP标记研究

【目的】利用一个GFP的超折叠变体SfGFP(superfolder GFP)对瓦雷兹芽孢杆菌(Bacillus velezensis)FZB42菌株进行标记,以期确立一种瓦雷兹芽孢杆菌及近缘芽孢杆菌通用的高亮GFP标记手段,同时,为了方便后续生物膜和分子互作的相关研究,测试SfGFP基因插入位点,假基因xkdB,作为外源基因表达座位的可行性。【方法】利用基因工程技术构建了一系列质粒,然后通过同源重组的方式,分别获得xkdB敲除菌株FBS373和SfGFP标记菌株FBS374,分别测试这些菌株在生长速度、碳源利用、荧光亮度、生物膜形成、swarming运动性等方面的差异。【结果】本研究成功构建了SfGFP标记的瓦雷兹芽孢杆菌FZB42,其荧光亮度是gfp+变体标记菌株的5倍以上;xkdB基因敲除对瓦雷兹芽孢杆菌FZB42生长速度、不同碳源利用、生物膜形成和运动性等方面无明显影响。【结论】通过本研究我们确认了xkdB基因位点作为瓦雷兹芽孢杆菌FZB42基因组上外源基因表达的中性位点的可行性,同时,通过在xkdB基因座位表达了SfGFP基因,成功对FZB42进行了高亮标记,对同类菌株的标记...     

贝莱斯芽孢杆菌BG-2对厚皮甜瓜贮藏品质及防御酶活性的影响

【背景】厚皮甜瓜白霉病主要由尖孢镰刀菌引起,严重影响厚皮甜瓜品质,从而造成经济损失。【目的】研究贝莱斯芽孢杆菌BG-2对尖孢镰刀菌的抑制作用,以及对采后厚皮甜瓜贮藏品质的影响。【方法】以贝莱斯芽孢杆菌为供试菌株,研究其对2种不同贮藏温度（25℃和4℃）下厚皮甜瓜果实腐烂率、失重率、果肉硬度、可滴定酸、可溶性固形物含量和维生素C含量的影响,同时测定过氧化氢酶（catalase,CAT）、过氧化物酶（peroxidase,POD）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）防御酶活性,进而探究Bacillus velezensis BG-2对尖孢镰刀菌的抑制作用及对厚皮甜瓜贮藏品质的影响。【结果】贝莱斯芽孢杆菌BG-2菌悬液能有效抑制尖孢镰刀菌的生长,菌悬液浓度为1×10⁷ CFU/mL时抑菌圈直径为（20.45±0.39） mm,抑菌效价为144.48 mm/mL;同时,B. velezensis BG-2能有效减缓果肉硬度、维生素C含量、可溶性固形物含量和可滴定酸的下降,抑制果实失重和腐烂,能较好地保持果实的品质,抑制防御酶活性的下降。【结论】B. velezensis BG-2能显著抑制尖孢镰刀菌的生长,延缓厚皮甜瓜的后熟,维持采后甜瓜果实较高的品质和防御酶活性,对甜瓜腐烂有较好的防治效果。     

水稻条斑病菌pilT基因在致病性中的功能分析

【目的】本实验室前期研究发现水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105菌株中pil T基因Tn5转座子插入突变体在寄主水稻上致病性明显降低,在非寄主烟草上激发过敏反应(hypersensitive response,HR)的能力也明显减弱。为了揭示pilT基因在Xoc菌株中的功能,本文进行了深入研究。【方法】本实验通过无标记双交换敲除的方法获得Xoc RS105菌株pil T基因缺失突变体RΔpilT,并对该突变体的游动性以及生物膜等表型进行了检测。【结果】与野生型RS105菌株相比,敲除突变体RΔpilT不仅在感病水稻IR24上的致病性显著降低,在非寄主烟草上产生过敏反应的能力减弱,而且突变体游动性降低,生物膜含量增加,互补子能够恢复上述缺陷至野生型水平。qRT-PCR结果显示,在RΔpil T中,hrpG、hrpX、hrcC、clp、rpfG、pilA、pilC基因表达量明显降低。【结论】Xoc中pilT为重要的毒性相关基因,其致病性与游动性和生物膜含量变化相关,并且受clp、rpfG、pilA、pilC等基因调控。pil T基因编码的Pil T蛋白是构成IV型菌毛的亚基之一,为菌体运动提供能量。本文对pilT基因的功能研究,为进一步分析IV型菌毛在Xoc中的功能提供了线索。     

贝莱斯芽孢杆菌CC0955发酵培养基优化及其泡腾颗粒的研制

【背景】植物病害的生物防治及生防产品的开发一直是植物保护研究的重点方向,但现有的生防产品多为可湿性粉剂和水剂,存在剂型单一、货架期短及运输和使用不便等问题。【目的】优化贝莱斯芽孢杆菌CC0955菌株发酵培养基,并利用其开发出一种容易使用和保存的新生防产品——泡腾颗粒。【方法】采用Plackett-Burman设计、中心组合设计和响应面分析等方法,优化了贝莱斯芽孢杆菌CC0955的发酵培养基成分;采用L₉（3³）正交设计,以溶液pH和活菌数为指标,优化了贝莱斯芽孢杆菌CC0955泡腾颗粒配比,并评价了其物理性质和抑菌效果。【结果】贝莱斯芽孢杆菌CC0955最优发酵培养基成分为（g/L）:蛋白胨12.00,酵母粉1.00,葡萄糖15.00,MgSO₄·7H₂O 0.40,K₂HPO₄ 0.05。用此培养基发酵48h,发酵液对立枯丝核菌的抑制率达到89.78%。泡腾颗粒最佳配比为:碱酸摩尔比为2.00,白炭黑1.50 g,黄腐酸钾0.03 g。泡腾颗粒的平均崩解...     

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) JJYY防控土传病害效果评价及其全基因组测序分析和抗菌成分鉴定

【背景】土传病害是世界农业可持续发展的关键限制因子,在我国蔬菜和中药材上发生日趋严重,引起严重的连作障碍。生物防治对环境和农产品安全,是目前研究的热点和重点。【目的】明确对土传病原菌具有广谱抗菌活性菌株JJYY的种类及其防控效果和主要抗菌产物,为新型生物农药开发奠定基础。【方法】结合扫描电镜观察、生理生化分析和16S rRNA基因扩增测序技术鉴定菌株JJYY。分别利用比浊法和菌丝生长抑制法测定该菌提取物对4种土传病原细菌和5种土传病原真菌的EC₅₀,利用盆栽试验评价对番茄青枯病等病害的防控效果。利用二代Illumina NovaSeq与三代PacBio Sequel相结合测序技术对菌株JJYY进行全基因组测序,使用PGAP等软件进行基因注释等分析,利用反相制备液相色谱和质谱初步分离鉴定抗菌物质。【结果】菌株JJYY是一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）,该菌提取物对4种土传细菌和5种土传真菌的EC₅₀分别为0.940-1.092 mg/mL和2.733-3.678 mg/mL。对番茄青枯病、菊花根腐病和辣椒枯萎病的最高防效在80.00%-87.74%之间,与化学药剂链霉素或噁霉灵无显著差异（P>0.05）。该菌基因组大小为3 929 792 bp,编码3 895个基因,与B.velezensis JS25R和B.subtilis 168具有3 445个和2 997个同源编码基因。预测该基因组共有12个次级代谢产物合成功能基因簇。从该菌株提取物中共分离出9种抗菌组分,其中2个初步判定为已知大环内酯类抗生素macrolactin D和7-O-malonyl-macrolactin A。【结论】菌株JJYY是一株对土传病原细菌和真菌病害均有较高防效的贝莱斯芽孢杆菌,该菌基因组与已知贝莱斯芽孢杆菌不同,并产生多种已知和未知的抗菌物质,继续深入分析鉴定其抗菌物质和抗菌机制将为开发新型高效的生物农药奠定良好基础。