解脂耶氏酵母表面展示β-淀粉酶与α-葡萄糖转苷酶及一步法由淀粉合成低聚异麦芽糖

低聚异麦芽糖(IMO)所具有的良好理化性质和生理功能,使得其在食品、医药、饲料、化妆品等领域得到广泛应用。但目前工业上采用多酶协同法由淀粉合成低聚异麦芽糖,步骤繁琐、成本较高。因此开发出更加经济简便的方法生产低聚异麦芽糖具有重要的应用价值。通过将β-淀粉酶(βa)和耐热α-葡萄糖转苷酶(GT)以不同的方式进行融合,并利用表面展示系统固定在食品安全微生物解脂耶氏酵母细胞表面,实现自我表达与固定。筛选得到高产菌株Yβa-GT29。大量培养获得细胞,转化液化的淀粉可实现一步法合成IMO,50℃转化20h即可得到纯度为75.3%的低聚异麦芽糖,方便了低聚异麦芽糖的生产。     

葡萄糖苷转移酶生产菌种的筛选

用甲基葡萄糖及麦芽糖为底物,对５０多株黑曲霉α－葡萄糖苷酶活性作了测定,结果表明各菌株对这二类底物之水解能力并不一致,甲基葡萄糖水解活性高的,其麦芽糖水解能力未必也高。通过ＴＬＣ测定这些菌株生成异麦芽低聚糖之能力,结果表明甲基葡萄糖和麦芽糖为底物的水解能力并不能正常反映转苷反应的能力。酶活力高的,生成异麦芽低聚糖的能力未必比活性低的为强,造成上述结果的原因,或许是胞外酶中存在着仅有水解作用的α－葡     

一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选*

对筛选到的菌株ZX99产生的一种新型淀粉酶 (异麦芽低聚糖酶 )进行了分析鉴定。ZX99菌株能产生一种胞外淀粉酶 ,该酶能催化淀粉的降解产生异麦芽低聚糖。对原产酶菌株ZX99多次进行紫外线照射诱变后 ,获得了优良、稳定的变异菌株BS3.232 ,其产酶水平为原株的160 %。产物薄层层析证明 ,该酶能催化淀粉的降解 ,产生异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖和异麦芽四糖等低聚糖 ,但对普鲁兰基本不起作用 ,由此证明它是一种不同于新型普鲁兰酶 (neopullulanase)和传统淀粉酶 (amylase)的一种新型     

共表达N-乙酰转移酶提高Aspergillus nidulans α-葡糖苷酶在毕氏酵母中的表达研究

葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1,4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1,6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活。以实验室保藏的P. pastoris KM71/pPIC9K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22. 56U/ml和0. 52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1. 92倍和1. 27倍。在此基础上进行3. 6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1%的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128. 12U/ml和1. 81mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1. 96倍和1. 50倍。     

黑曲霉α-葡萄糖苷酶cDNA的克隆及表达

研究黑曲霉(Aspergillus niger)M-1菌株的α-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的克隆及表达。以M-1菌株的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增α-葡萄糖转苷酶的cDNA,重组到Trc启动子控制下的表达载体pSE380中,构建重组质粒pSE-αtg,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。初步研究表明:重组蛋白具有葡萄糖苷酶活性,最适pH为6.0,最适温度为45℃,金属离子Cu2 和Mn2 对酶活力有明显的促进作用。添加1.6mmol/L IPTG对重组菌的诱导作用最大,在培养中添加麦芽糖,对重组菌产酶有显著的促进作用。     

α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立及其应用

【目的】针对人α-麦芽糖苷酶这个糖代谢途径中重要的靶蛋白,建立α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。【方法】采用毕赤酵母表达系统克隆和表达人α-麦芽糖苷酶。利用酶的催化特性建立α-糖苷酶抑制剂筛选模型。应用该模型对放线菌代谢产物库进行高通量筛选。通过构建16SrRNA系统发育树分析阳性菌株的分类地位。【结果】首次成功克隆、表达了具催化活性的人α-麦芽糖苷酶N端结构域。针对人α-麦芽糖苷酶N端催化结构域,建立α-糖苷酶抑制剂的筛选模型。对包含近2000株放线菌代谢产物的天然产物库进行高通量筛选,最终得到20株α-麦芽糖苷酶抑制剂生产菌株。其中19株放线菌为链霉菌属,且在分类学上具有丰富的多样性。【结论】本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖苷酶抑制剂类降糖药物的开发。     

α-葡萄糖苷酶菌株的选育及发酵条件的研究

从2株芽胞杆菌中通过筛选获得了一株产α-葡萄糖苷酶活力较高的嗜热脂肪芽孢杆菌U2,以嗜热芽孢杆菌U2为菌种,优化发酵培养基后,在温度45℃、初始pH6.8、转速200r/min和10%接种量条件下,发酵20h,菌株U2产酶水平可达到2.62U/mL,比出发菌提高了4倍。     

低聚异麦芽糖醇的工艺研究

以低聚异麦芽糖浆IMO-50为原料,又应用纳滤分离技术生产低聚异麦芽糖浆IMO-90,再采用特殊的氢化工艺技术生产高纯度低聚异麦芽糖醇IMO-H。     

低聚异麦芽糖生产工艺研究

摘要：低聚异麦芽糖是一种功能性低聚糖,因其具有多种独特生理功能,被广泛地应用于食品、医药、饲料等领域,市场前景十分广阔,但是目前低聚异麦芽糖生产工艺中存在许多不足之处。本文首先介绍了低聚异麦芽糖的性质和生理功能,其次阐述了低聚异麦芽糖的生产工艺,并对如何构建和利用基因工程菌生产低聚异麦芽糖提出展望。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析

从木霉属、曲霉属、担子菌等17种试验菌株中筛选出一株产β-葡萄糖苷酶活性较高的黑曲霉A.niger-nl-1。该菌株在适宜的培养条件下,β-葡萄糖苷酶的最高活力达到4.7U/mL,适宜的产酶周期为4d。制备的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为55℃、最适反应pH为5.0。该菌株除能产生β-葡萄糖苷酶外,还能产生内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶,滤纸酶活达到0.62IU/mL。