MAT2A基因小干扰RNA诱导人肝癌细胞凋亡的分子机制

为探讨甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)小干扰RNA对人肝癌细胞生长和细胞凋亡的影响及其机 制,采用脂质体转染法将MAT2A小干扰RNA质粒表达载体转染人肝癌细胞系Bel 7402细胞、HepG 2细胞和 HepG3B细胞.半定量RT PCR检测MAT2A mRNA表达,Western印迹检测MAT2A 蛋白质表达, M TT法观察MAT2A小干扰RNA对肝癌细胞生长的影响,流式细胞仪及DAPI染色检测siRNA对肝癌细 胞凋亡的影响.为探讨其作用机制, 进一步检测转染后肝癌细胞MAT的活性、MAT1A mRNA表 达及SAM、SAH含量.结果发现, MAT2A小干扰RNA特异性抑制人肝癌细胞MAT2A mRNA和蛋白质 的表达, 刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变, 降低了肝癌细胞中MATⅡ活性（P<005） ,从而诱导肝癌细胞凋亡; MAT2A小干扰RNA诱导Bel－7402细胞、HepG 2细胞、 Hep 3B细胞凋亡 指数分别为19．3%±2．8%、22．8%±3．5%、21．8%±4．2%, 较对照组siRNA(凋亡指数为5 2%±19%)具有明显差异(P<005).DAPI染色显示, MAT2A小干扰RNA转染组可见多个细胞核 浓缩、碎裂成蓝色的小块状,染色质凝聚,形成典型的凋亡小体, 而对照siRNA转染组未发现典型的 凋亡小体.肝癌细胞的生长也受到抑制,MAT2A小干扰RNA转染Bel 7402细胞、HepG 2细胞 、HepG3B细胞72 h后,细胞生长抑制率达高峰,分别为39．62%、41．27%、38．84%.肝癌细胞 中SAM含量明显升高(P<001),而SAH含量改变不明显, SAM/SAH变化伴随SAM含量变化而改 变.提示靶向MAT2A基因的siRNA通过升高肝癌细胞中SAM含量,刺激MAT表达由MAT2A向MAT1A转变, 从而诱导肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长.     

5-脂氧合酶激活蛋白小干扰RNA诱导人乳腺癌细胞凋亡的初步研究

目的：研究5-脂氧合酶激活蛋白（FLAP）的表达抑制对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用。方法：通过小干扰RNA（siRNA）抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231中FLAP的表达,用流式细胞仪检测膜联蛋白（annexin）-V标记的早期凋亡细胞,用Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白的水平。结果：转染了FLAP siRNA的乳腺癌细胞,24h后FLAP的表达被抑制,17％的细胞出现早期凋亡;48h时早期凋亡细胞增加到32．1％;72h时早期凋亡细胞下降到13．8％,而死亡或凋亡晚期细胞占到61．3％。在细胞凋亡过程中,Bcl-2水平下降,而细胞色素c、胱冬蛋白酶（caspase）-3的水平逐渐增高。结论：FLAP的表达抑制可以诱导乳腺癌细胞通过Bcl-2和胱冬蛋白酶-3途径发生凋亡。     

靶向VEGF小干扰RNA协同5-FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

探讨慢病毒介导的靶向VEGF小干扰RNA联合应用化疗药物5 FU诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的机制。以携带VEGF siRNA的慢病毒载体感染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Western blot分别检测各组VEGF mRNA、VEGF蛋白及凋亡相关蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡。结果表明,慢病毒VEGF siRNA干扰组细胞VEGF mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组,凋亡相关蛋白P53及P21表达上调,而SIRT1、Bcl-2及Survivin表达下调。流式细胞术检测显示慢病毒干扰组及5-FU组细胞凋亡率显著升高,联合治疗组的协同作用更为明显。上述结果表明：慢病毒介导的RNA干扰能明显抑制MCF-7细胞VEGF的表达,通过下调SIRTI蛋白的表达,导致P53蛋白表达上调,并调控其下游P21、bcl-2和Survivin的表达,从而诱导MCF-7细胞的凋亡,并且提高了MCF-7对5-FU的敏感性。     

甲壳胺诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的:通过体外实验探讨甲壳胺是否对人肝癌细胞HepG2具有生长抑制及诱导凋亡作用.方法:在HepG2细胞培养液中加入不同浓度的甲壳胺,培养48 h,于倒置相差显微镜下观察甲壳胺处理组及对照组细胞形态学变化;用流武细胞术(FCM)检测HepG2细胞的凋亡率,Western印迹检测甲壳胺处理组及对照组Bcl-2和p53蛋白...     

RNA干扰抑制麻疹病毒体外复制的实验研究

为了研究短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰对麻疹病毒体外复制的抑制作用,构建靶向与麻疹病毒复制密切相关的宿主细胞基因Rab9 GTPase基因特异性shRNA表达载体,分别转染Vero-E6和B95a细胞后感染麻疹病毒Edmonston株和野生株。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)检测转染细胞内Rab9 GTPase基因表达水平;标准蚀斑试验测定麻疹病毒滴度。结果显示转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平同对照组相比明显降低,标准蚀斑试验显示麻疹病毒的复制受到显著抑制,抑制率达到90%以上。结果表明载体介导的shRNAs能通过特异性下调Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒体外复制,Rab9 GTPase可能成为治疗麻疹病毒感染的RNA干扰靶。     

RNA干扰抑制人乙型肝炎病毒复制的研究

采用表达shRNA的载体构建了表达针对病毒HBsAgmRNA保守区的shRNA的质粒psiHBs,利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价RNA干扰对HBV复制和基因表达的抑制作用。通过Western印迹检测细胞内的HBsAg,用ELISA检测细胞培养上清和血清中的HBsAg,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,最后通过免疫组化的方法检测肝组织切片中HBcAg的表达情况。结果显示pHBV1.3和psiHBs共转染HepG2后,与对照组相比病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平下降了90%以上,并且shRNA的作用效率存在序列特异性和剂量依赖性。在高压注射小鼠模型中,psiHBs表达的shRNA使小鼠血清中HBsAg的水平下降了80%以上,免疫组化检测显示,小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了75.1%,而且shRNA的抑制作用至少能持续4d。研究显示载体表达的shRNA无论是在细胞或是在小鼠模型中都能对HBV的复制和基因的表达发挥序列特异性的抑制作用。本研究为我们下一步实现由RNAi介导的基因治疗提供了理论和技术支持。     

RNA干扰抑制人乙型肝炎病毒复制的研究

采用表达shRNA的载体构建了表达针对病毒HBsAg mRNA保守区的shRNA的质粒psiHBs,利用细胞模型和高压注射小鼠模型评价RNA干扰对HBV复制和基因表达的抑制作用.通过Western印迹检测细胞内的HBsAg,用ELISA检测细胞培养上清和血清中的HBsAg,采用Southern印迹检测HBV的复制中间体,最后通过免疫组化的方法检测肝组织切片中HBcAg的表达情况.结果显示pHBV1.3和psiHBs共转染HepG2后,与对照组相比病毒HBsAg和HBeAg的表达和病毒复制中间体的水平下降了90%以上,并且shRNA的作用效率存在序列特异性和剂量依赖性.在高压注射小鼠模型中,psiHBs表达的shRNA使小鼠血清中HBsAg的水平下降了80%以上,免疫组化检测显示,小鼠肝组织内HBcAg阳性细胞数减少了75.1%,而且shRNA的抑制作用至少能持续4d.研究显示载体表达的shRNA无论是在细胞或是在小鼠模型中都能对HBV的复制和基因的表达发挥序列特异性的抑制作用.本研究为我们下一步实现由RNAi介导的基因治疗提供了理论和技术支持.     

维甲酸诱导的人大肠癌细胞凋亡

本研究应用光镜、电镜技术、DNA凝胶电泳、流式细胞术及末端脱氧核苷酰转移酶原位标记(TUNEL法),观察全反式维甲酸ATRA诱导的人大肠癌CCL229细胞凋亡特征。RA诱导CCL229细胞凋亡,光、电镜下观察到凋亡小体形成等典型的形态学改变,琼脂糖凝胶电泳上呈现特征性的DNA ladder,DNA直方图上显示亚二倍体峰。10-8mol/L-105mol/L范围内,RA诱导CCL229细胞凋亡表现出时间和剂量依赖性。     

曲古霉素A诱导人膀胱癌细胞周期阻滞和凋亡的研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)对人膀胱癌T24细胞周期和凋亡的影响。方法:以不同剂量TSA(0.1μM,0.3μM和1μM)处理T24细胞。采用MTT法检测细胞存活率,AnnexinV-PI染色检测细胞凋亡,流式细胞仪检测caspase-3活性,Western blot法检测P21蛋白表达。结果:TSA剂量依赖性降低膀胱癌细胞存活率,促进细胞凋亡,表现为AnnexinV阳性细胞明显增多,同时活化的caspase-3水平增高。TSA还可通过诱导膀胱癌细胞周期阻滞于G2/M期抑制细胞生长,且呈剂量依赖性。结论:TSA通过促进caspase-3激活诱导膀胱癌细胞凋亡,同时诱导细胞阻滞于G2/M期。     

过表达PKCε和PKCη在HCC1806细胞中的抗凋亡作用

为探讨PKCε、PKCη对乳腺癌细胞中TNFα诱导凋亡的影响,采用PCR技术,从人肌肉cDNA文库中克隆了全长PKCε和PKCη序列,亚克隆至pcDNA3,转化HCC1806细胞,并选择出稳定的转化细胞株.然后用流式细胞仪检测了PKCε、PKCη过表达对DNA断裂的影响,用Western印迹方法检测了PKCε、PKCη过表达对PARP、caspase 3和caspase 8水解的影响,以及对Bcl-2,Bax表达的影响,和对MAPK磷酸化的影响.流式细胞仪分析DNA含量的结果表明：TNFα处理后,HCC1806/PC、HCC1806/ε、HCC1806/η的sub_G1状态的DNA含量分别为：57.7%、23.3%、14.6%.Western印迹结果表明,当用0.01nmol/L TNFα处理,HCC1806/η中PARP、caspase3、caspase8的水解程度最低,HCC1806/ε中次之,HCC1806/PC最严重;与HCC1806/PC比较,无论用不用TNFα处理,HCC1806/ε都表达更高的Bcl_2,而HCC1806/η不影响Bcl_2的表达.过表达PKCη而不是PKCε抑制了由TNFα引起的p38和JNK的磷酸化,并且是JNK的抑制剂SP600125而不是p38的抑制剂SB220025抑制了PARP的裂解.以上结果显示,过表达PKCε、PKCη可能通过不同的信号途径在HCC1806中起抗凋亡作用,PKCε上调了bcl_2的表达,而PKCη抑制了JNK的磷酸化.     

去甲斑蝥素诱导人红白血病K562细胞凋亡的实验研究

体外实验证明１０μｇ．ｍｌ－１去甲斑蝥素作用于人红白血病Ｋ５６２细胞２４ｈ,可诱导Ｋ５６２细胞发生凋亡。提取加药组细胞ＤＮＡ进行琼脂糖凝胶电泳呈现典型的ＤＮＡ“梯子”,同时加药组细胞出现核固缩、碎裂及胞浆浓缩等形态学变化。流式细胞测试结合形态学观察,特别是细胞超微结构观察,证明去甲斑蝥素诱导的Ｋ５６２细胞凋亡大部分发生在细胞周期的Ｍ期,也有部分发生在间期。免疫细胞化学结果表明,１０μｇ．ｍｌ－１去甲斑蝥素作用于人红白血病Ｋ５６２细胞２４ｈ,与对照组相比,加药组细胞中ｂｃｌ┐２蛋白表达增强,而Ｂａｘ蛋白表达减弱,两组间有显著性差异（Ｐ＜０．００１）。     

RNA干扰抑制血管内皮生长因子介导结肠癌细胞凋亡

目的应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达,并通过体外实验,观察VEGF受抑制后,凋亡情况的变化,为RNA干扰技术的临床应用奠定基础。方法通过Tunel和流式细胞计数的方法,观察VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率的变化。结果Tunel和流式细胞计数分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。结论Tunel和流式细胞计数分析显示,当VEGF受抑制后,肿瘤细胞凋亡发生率明显增加。     

华蟾素诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡

本研究旨在探讨华蟾素诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡及其机制.分别用终浓度0、60、70、80μg/L的华蟾素作用于人胃癌MKN-45细胞48 h,采用激光共聚焦显微镜观察细胞形态结构,流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位,RT-qPCR和Western blot分别检测Bax、Bcl-2、Cy tC、Caspase 9和Caspase 3基因表达水平.结果显示,与对照组相比,0、60、70、80μg/L的华蟾素作用人胃癌MKN-45细胞48h,呈现细胞皱缩、细胞核裂解、染色质凝集等形态学变化,早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞所占百分比均显著增加,线粒体膜电位(ΔΨm)显著降低.Bax、Cyt C、Caspase 9和Caspase 3基因的mRNA及蛋白表达水平随着药物浓度的升高均显著升高(P＜0.01),Bcl-2基因mRNA及蛋白表达水平随着药物浓度的升高显著降低(P＜0.01),提示华蟾素可通过上调Bax、Cyt C、Caspase 9和Caspase 3基因表达,下调Bcl-2基因表达诱导人胃癌MKN-45细胞凋亡.     

人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA的构建及功能研究

目的:构建人耐药白血病细胞多药耐药基因-1小干扰RNA并研究其功能.方法:人工合成编码mdrl小发夹状双链RNA的DNA片段,与pSilencer4.1-CMV质粒连接构建RNAi真核表达栽体,采用脂质体介导法转染人耐药白血病细胞K562/A,经潮霉素B筛选转基因阳性克隆细胞,RT-PCR和Western Blotting检测转基因细胞中mdrl基因的表达量,MTT法检测转基因细胞对阿霉素的敏感性.结果:RT-PCR结果显示,与未转基因组和阴性对照组比较,RNA干扰组mdrl基因在mRNA水平上表达量降低43.55%;Western Blotting检测显示,RNA干扰组mdrl基因在蛋白水平上表达量降低69.46%;MTT法检测显示mdrl干扰细胞对化疗药物柔红霉素的敏感性提高23倍.结论:mdrl小发夹状RNA可显著抑制K562/A细胞中的mdrl基因的表达,提高白血病细胞对化疗药物的敏感性,对白血病多药耐药性的逆转和白血病的治疗具有重要理论和实际意义.     

RNA干扰对MDA-MB-231细胞中CaSR基因表达的影响

目的:运用RNA干扰技术,观察siRNA表达载体在乳腺癌细胞MDA-MB-231中对CaSR基因表达的影响。方法:构建靶向CaSR基因的RNA干扰表达载体,用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA-MB-231,运用Real-Time荧光定量PCR,Westernblot技术分别从mRNA以及蛋白表达水平检测CaSR基因表达的变化。结果:所构建的质粒载体成功的在MDA-MB-231细胞中抑制了CaSR mRNA及其蛋白的表达。与对照组相比,psiRNA-CaSR载体对CaSR mRNA的抑制率达到65%,对CaSR蛋白抑制率约为70%。结论:实验证明所设计的shRNA片段可以有效地抑制CaSR基因的表达,为下一步研究工作奠定了基础。     

Survivin基因RNA干扰对肺癌细胞凋亡及增殖的影响

目的:探讨Survivin表达对肺鳞癌细胞的凋亡和增殖的影响.方法:利用siRNA阻抑人肺鳞癌细胞内survivin基因的表达,用RT-PCR和Western Blotting法分析survivin基因mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率,细胞集落形成实验检测细胞增殖.结果:(1)Survivin在肺癌细胞中表达.转染Survivin siRNA可在RNA和蛋白水平阻断其表达;(2)转染Survivin siRNA的肺癌细胞凋亡率显著增加;(3)转染Survivin siRNA的肺癌细胞的集落形成率显著降低.结论:阻断Survivin表达可通过增加细胞凋亡率和降低细胞增殖增加肺鳞癌细胞的放疗敏感性.     

壁虎醇提物诱导人喉癌细胞Hep2凋亡的实验研究

本文研究了壁虎乙醇提取物(GEE)诱导Hep2细胞凋亡的作用.采用噻唑蓝比色法(MTT)检测了GEE对Hep2细胞增殖的抑制作用,发现GEE可呈剂量-时间依赖性的抑制Hep2细胞的增殖,GEE作用24、48、72 h后其IC50值分别为336.858、237.949、188.991 μg/mL.Hoechst 33258荧光染色后在显微镜下可观察到Hep2细胞发生了典型凋亡的形态学变化;利用Western blot法证实在Hep2细胞中GEE可诱导caspase-3和抑制VEGF蛋白的表达.这些结果表明GEE可能是通过上调Caspase-3和下调VEGF蛋白的表达诱导Hep2细胞的凋亡.     

人PrP基因体外诱导细胞凋亡的初步研究

朊蛋白为可传播性海绵样脑病的感染因子。将编码朊病毒白的ＰｒＰ标准及突变ＤＮＡ序列分别连接到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１中,并分别转入中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）。以过ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮＡｄｏｔ ｂｌｏｔ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定证实,得到了稳定表达人标准（ＣＨＯｓ）和终止密码突变ＰｒＰ基因（ＣＨＯｍ）的细胞系。对此细胞系进一步研究发现,带有标准人ＰｒＰ序列的ＣＨＯ细胞系的生长速度比其它对照细胞系     

hepaCAM通过下调p-FOXO1/PCNA调节人膀胱癌BIU-87细胞的增殖活力

探讨肝细胞粘附分子(hepatocyte cell adhesion molecule,hepa CAM)对膀胱癌细胞BIU-87增殖活力的影响以及其调节机制。将BIU-87细胞分为对照组、空载组、hepa CAM组、LY294002组及hepa CAM与LY294002联用组,噻唑蓝法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测细胞的增殖抑制率;Real-time PCR检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达;Western blot法检测p-FOXO1的表达;同时用LY294002处理BIU-87细胞后Western Blot检测p-FOXO1、PCNA的表达。结果显示,单独运用hepa CAM过表达腺病毒或LY294002均能够明显抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖活力,hepa CAM过表达腺病毒与LY294002联用更加显著的增强了单独作用的抑制效果(p0.05);Western Blot显示,hepa CAM基因的过表达使p-FOXO1的表达量显著降低(p=0.001);hepa CAM过表达腺病毒与LY294002联用后,与hepa CAM或LY294002分别作用相比,p-FOXO1(p=0.014,p=0.047)和PCNA(p=0.002,p=0.004)的表达量降低明显;Realtime PCR结果显示,LY294002处理BIU-87细胞后,PCNA的表达明显减低(p=0.003),加入hepa CAM过表达腺病毒后更为显著地增强LY294002对PCNA的抑制作用(p=0.001)。本课题得出结论,hepa CAM基因过表达后通过下调p-FOXO1从而抑制膀胱癌BIU-87细胞的增殖活力,此作用与PCNA的表达量下调有关。     

毒胡萝卜素诱导A549细胞凋亡的实验研究

目的:探讨内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin TG)对体外培养人肺泡II型细胞来源的A549细胞生长及凋亡的影响。方法:体外培养A549细胞,经不同浓度TG(1μM、5μM、10μM)干预24小时,MTT检测细胞存活率、Hochest/PI染色观察细胞凋亡形态学、Wersten-blot检测活化caspase-3水平。结果:与对照组比较,经TG作用24小时后,活化caspase-3表达显著增加,细胞存活率下降,凋亡率增加,均呈浓度依赖性,P0.005。结论:毒胡萝卜素能抑制A549细胞生长,诱导细胞凋亡。