血小板生成素改构体基因的克隆和序列分析

采用PCR技术,根据文献报道的鼠TPO成熟肽基因序列,设计并合成两对引物,以鼠TPO cDNA为模板,扩增获得mTPO N端153个氨基酸的478bp cDNA片段及鼠TPO全长1032bp cDNA片段,mTPO153片段与合成的碱性成纤维生长因子序列中Lys119-Lys135as的51bp肝素结合位点DNA片段连接,克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序;同时将扩增的鼠TPO全长cDNA片段克隆到M13mp18及M13mp19载体中进行双向测序。证明获得鼠血小板生成素与肝素结合位点基因及鼠TPO全长基因,继之以pMAL-C2X为表达载体构建表达质粒,并经PCR及酶切鉴定。     

用酵母双杂合系统筛选与人血小板生成素受体c-Mpl相互作用的蛋白质

血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是调节血小板生成最主要的细胞因子,其生物学效应由其受体c-Mpl介导.利用酵母双杂合系统(two-hybrid system)筛选与c-Mpl相互作用的蛋白质因子.首先将c-Mpl膜内部分cDNA克隆至pAS2双杂合载体中,重组质粒命名为pASMM;然后以pASMM为靶蛋白质粒,筛选了人胎盘cDNA文库.在1.5×106个转化子中筛选到7个阳性克隆.序列测定表明,分离到编码人波形纤维蛋白(vimentin)的第611 bp至C末端的cDNA顺序(包括3'非翻译区),从而发现波形纤维蛋白可与TPO受体相互作用,这提示细胞骨架蛋白在TPO的信号转导过程中可能起着重要的作用.     

TPO内含子Ⅴ可显著增强人血小板生成素基因在乳腺细胞中的表达

人血小板生成素（thrombopoietin,TPO）基因组包括6个外显子和5个内含子,内含子在其表达过程中可能扮演着重要作用.为了研究人TPO基因组中不同内含子对TPO表达的影响,构建可在转基因动物乳腺中高水平表达人TPO的乳腺特异性表达质粒.本研究以65 kb的山羊β-casein启动子为调控元件,构建了包括人TPO cDNA(pTPOA)、TPO intronⅠ-TPO cDNA (pTPOB)、ΔTPO intronⅠ-TPO cDNA (pTPOC)、TPO intronⅤ-TPO cDNA (pTPOD)和TPO gDNA (pTPOE)等5种TPO乳腺特异性表达质粒,并在人乳腺细胞HC-11细胞上进行了瞬间表达研究.在转染48 h后,通过双抗体夹心的ELISA方法定量分析上述质粒在HC-11细胞上的表达水平.结果表明,含有内含子Ⅴ的 pTPOD的表达量最高,而含有整个基因组TPO的pTPOE表达水平最低.为了进一步证实pTPOD可在乳腺细胞中高水平表达,将pTPOD经脂质体包埋后注射到泌乳期山羊的乳腺中.结果显示,在山羊乳汁中可连续14 d检测到人TPO的表达.上述实验证实,人TPO基因组中的内含子V可显著提高TPO在HC-11细胞内的表达水平,并提示内含子Ⅴ中可能含有特殊的调控序列.     

血小板生成素功能区段基因的克隆与表达

血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是由巨核细胞产生的一种细胞因子,早期认为它在血小板生成晚期发挥作用。1994年TPOcDNA克隆成功,从而使得对血小板生成素的研究更加深入。TPO cDNA全长1774 bp,其中编码区为1059 bp,编码353个氨基酸,从其结构上看,它可以分为N端区和C端区两部分,其N端区与EPO同源性较高,称为EPO样结构区(EPO-like domain),而且仅此结构区即具有完整TPO分子的功能。TPO与EPO不但在     

TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列,合成了该模拟肽的DNA序列,分别连接至4种不同长度的人IgG1 Fc基因片段的5′端,并克隆至质粒表达载体pET28a( ),转化大肠杆菌BL21（DE3）,筛选获得了4种重组工程菌,其中3种分别高效表达了3种不同长度的融合蛋白,而第4种工程菌未表达,表达的3种融合蛋白的分子量分别约为28kD,12kD和12kD。表达量约占菌体蛋白总量的30％左右,纯化获得了3种TPO模拟肽融合蛋白,3种融合蛋白均有较好的体外活性,维持TPO依赖细胞Ba/F3-mp1生长的EC50分别为：13,10,10nmol/L,用血小板减少症小鼠动物模型,测定了它们的体内活性,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能,分别比TPO模拟肽活性提高了18,8,8倍,而对白细胞及红细胞无显著影响,分别用3种融合蛋白免疫BALB／c小鼠,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体,并显示了较好的应用潜力。     

血小板生成素基因治疗血小板减少症的研究

血小板生成素 (TPO)有望成为特异性治疗血小板减少症的理想药物 .对TPOcDNA离体细胞表达和基因治疗血小板减少症进行了初步尝试 :构建了pcDNA3 TPO高表达质粒 ,基因转移离体细胞 ,检测表达产物rhTPO具有完整的生物学活性 ;pcDNA3 TPO分别注射正常小鼠和血小板减少症小鼠 ,小鼠血浆中检测到rhTPO的表达 ,并且正常小鼠血小板水平上升至 1 .9倍 ,血小板减少症小鼠血小板降低的幅度减小、恢复的速度加快并达到原来值的 1 .8～ 2 .0倍 .该结果为TPO基因治疗血小板减少症提供了实验依据 .     

血小板缺陷型动物血浆的制备

血小板减少症至今尚无特效约。肿瘤患者在接受放疗、化疗后往往由于血小板过低而中断治疗;骨髓患者也常常出现同样问题。巨核细胞的血小板生成受多方面因素的控制。其中血小板生成素(Thrombopoietm,TPO)是调节巨核细胞成熟,促进血小板生成的重要因子,是治疗血小板减少症的一种很好的潜在药。目前。国外重组TPO(rTPO)已进入临床试验阶段,国内未见报道。为配合rTPO的研究,特制备血小板缺陷型血浆。血小板最低值时。血浆TPO活性最高。文献已报道了用抗血小板抗体或用~(137)Csγ射线照射引起动物血小板减少的方法。我们采用~(60)Coγ射线照射引起动物血小板缺陷以刺激TPO的产生,进而制备有促进血小板增生活性的血浆即TPO。     

TPO模拟肽与人IgG1 Fc片段的融合表达及其生物学特性研究

依据本室获得的人TPO模拟肽序列,合成了该模拟肽的DNA序列,分别连接至4种不同长度的人IgG1 Fc基因片段的5′端,并克隆至质粒表达载体pET28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选获得了4种重组工程菌,其中3种分别高效表达了3种不同长度的融合蛋白,而第4种工程菌未表达。表达的3种融合蛋白的分子量分别约为28kD、12kD和12kD,表达量约占菌体蛋白总量的30%左右,纯化获得了3种TPO模拟肽融合蛋白。3种融合蛋白均有较好的体外活性,维持TPO依赖细胞Ba/F3-mp1生长的EC50分别为：13、10、10 nmol/L。用血小板减少症小鼠动物模型,测定了它们的体内活性,3种融合蛋白均有升高血小板和缩短血小板恢复时间的功能,分别比TPO模拟肽活性提高了18、8、8倍;而对白细胞及红细胞无显著影响。分别用3种融合蛋白免疫BALB/c小鼠,均未刺激小鼠产生抗TPO模拟肽抗体,并显示了较好的应用潜力。      

血小板、红细胞生成素双功能融合蛋白的构建

为探索TPO- EPO融合蛋白在肿瘤化疗中作为辅助治疗药物 ,同时纠正红细胞贫血和血小板减少症的可能性 ,首先通过PCR分别扩增了TPON -端 1 5 3肽和EPO成熟肽的编码cDNA ,并构建成功TPO -EPO融合基因 .融合基因在COS- 7细胞和CHO细胞中的表达产物能够维持TPO依赖株Ba/F3 mpl细胞和EPO依赖株Bet -2细胞的生长 ,能够在半固体培养体系中刺激巨核系集落和红系集落的形成 ,表明它同时具有TPO和EPO的生物活性 .初步体内实验表明 ,含有融合蛋白的培养上清可以使小鼠血小板数目升高 40 % ,对红细胞的作用有待进一步确定 .以上结果初步表明融合蛋白构建成功 ,为进一步探讨融合蛋白的体内活性和应用前景打下了基础 .     

人血小板生成素的研究进展

血小板生成素是新近发现的一个非常重要的造血调控因子。经过40多年的不懈努力,基本上阐明了血小板生成素及其受体系统（TPO/c-Mpl)在造血调控方面的作用。并在此基础上,研制了重组血小板生成素,以治疗放疗和化疗引发的血小板减少症,本综述了近年TPO及其受体c-Mpl系统对造血调控的研究进展,涉及TPO和c-Mpl的基因和蛋白分子结构。基因表达调控、可能经历的信号传导途径、TPO/c-Mpl系统主要的生理作用、TPO在血液循环中的代谢过程以及目前重组血小板生成素的临床研究现状等六个方面。深入理解TPO/c-Mpl系统的结构和作用。将加深人们对机体的造血调控和血液病的认识,并将有助于相关疾病的临床治疗。     

人血小板因子4基因cDNA的克隆与序列测定

为研究人血小板因子4（hPF4)的生物学性能和用于肿瘤生物治疗的可能性,运用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）从人工白血病细胞系HEL细胞总RNA中扩增出hPF4基因cDNA序列,将其克隆至pUC18载体中。序列分析证实克隆片段与献报道的hPF4基因cDNA序列完全一致,说明已成为克隆到hPF4基因cDNA。     

血小板生成素双体分子的融合构建、原核表达及其分子结构特性预测

目的：为了研制更稳定、高效、低毒的血小板生成素(TPO),拟设计构建TPO的双体分子(T-T)并在原核中表达,同时预测其融合蛋白的分子结构特性。方法：采用分子克隆方法分别构建TPO单体分子与双体分子的原核表达载体pFT32/TPO和pET32／T-T,并在大肠杆菌中进行表达,以Western blot鉴定表达产物;用生物信息学方法DS Gerie1.1和ProtScale软件,对该融合蛋白的结构特征如电点、柔性、抗原性及亲水性等进行模拟分析。结果：成功构建TPO双体分子pET32／T-T的原核表达载体,并经NcoⅠ和NotⅠ双酶切电泳及测序证实。通过转化origami^TM(DE3)感受态茵及IPTG诱导获得高效表达,其产量在40％以上;Western blot显示表达产物能与抗TPO单克隆抗体特异性结合。对T—T双体分子融合蛋白的结构特性预测表明,其融合蛋白中的两个TPO单体分子等电点、抗原性及亲水性均无显著改变,接头处具有高柔性。与TPO的原始序列相比,T-T的一级结构中有2个氨基酸发生改变,在接头(L)后插入一段34个氨基酸的新序列(N)。此序列具有一定的抗原性和亲水性,呈现B片层结构。结论：本研究所构建表达的TPO单体和T-T双体分子均可在大肠杆菌中获高效表达,T-T双体分子的结构预测符合设计要求,为进一步研究新型T-T双体分子融合蛋白的生物学特性提供了基础。     

血小板生成素及其研究进展

血小板生成素(TPO)是最近被描述的一种新型细胞因子,相对分子质量在35×10³以上,是一种糖蛋白.人和鼠TPO成熟蛋白分别由332和335个氨基酸残基组成.TPO的受体与造血生长因子受体超家族成员c-Mpl相关.TPO不仅对巨核系祖细胞的增殖、分化具有明显的调控作用,而巨对血小板的生成同样具有促进作用.     

人血小板生成素基因乳腺特异表达载体的构建和表达

目的为了获得能在转基因动物乳汁中高效表达人血小板生成素（TPO）的特异表达载体。方法将山羊β-乳球蛋白基因5’端上游-3.9kb和-1.9kb调控序列及β-酪蛋白启动子分别与人TPO基因连接,构建了pB3.9T、pB1.9T和pPT3个乳腺特异表达载体。将上述载体分别进行瞬间转染和稳定整合筛选实验,从mRNA及蛋白水平检测TPO基因的表达。结果BLG3.9、BLG1.9和PlA3 3种调控元件都可以启动人TPO在乳腺细胞中特异表达。瞬时转染时3种载体表达水平依次为pPT〉pB3．9T〉pB1.9T。但当外源基因稳定整合入细胞基因组后,TPO表达量持续升高,且pB3.9T表达量明显超过另外两种载体。结论证实了BLG转录子去阻遏和激活转变调节的存在,可能在其5’端-3.9kb与-1.9kb之间存在这一调节区域。并且与BLG1.9相比,BLG3.9能更有效地启动人TPO基因在乳腺细胞中的表达,也说明在-3.9至-1.9kb之间可能存在特殊的增强序列。     

血小板生成素cDNA体内转送促进血小板生成的研究

血小板生成素(TPO)是巨核-血小板系分化和生长的特异调控因子,在临床骨髓抑制症的治疗中有很大的应用价值。重组多肽细胞因子一般因难以避免的污染,体内半衰期短等因素,造成其生物活性不能有效发挥或产生毒副作用。若相关基因经适当途径转送后在体内表达,可克服此类不良因素,同时为研究细胞因子对机体长期作用提供了比较理想的模型。我们曾观察到把hTPO cDNA通过质粒载体转送到小鼠体内后,使小鼠对环磷酰胺的毒性作用产生明显的耐受。另外还注意到接受该基因的     

促血小板生成素受体——原癌基因c—Mpl蛋白的研究进展

促血小板生成素(TPO)专一性促进巨核细胞的生长发育和血小板的生成,其生物学功能由其受体c-Mpl介导。c-Mpl的发现源于其同源对应物v-Mpl的克隆。c-Mpl是位于造血干细胞、巨核细胞、血小板表面的跨膜蛋白。其表达专一而保守。c-Mpl属于造血因子受体超家族,保守的造血功能区决定结合TPO的能力,其膜内结构具有一些与传导细胞生长、增殖和分化信号相关的保守结构。TPO的信号传导途径涉及c-Mpl自身及部分相关蛋白的磷酸化,除了Jak-STAT途径和Ras途径外,TPO可能还激活其他与c-Cbl有关的途径。     

血小板生成素研究进展

血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是近几年发现的一种造血生长因子,其功能是促进巨核细胞的发育成熟,调节血液中血小板的水平。由于它在临床上纠正较难对付的血小板减少症方面具有较好的应用前景,短短两年时间其开发研究已进入了Ⅰ/Ⅱ期临床试验,据称初步结果比较乐观;在理论研究方面,TPO基因的克隆大大丰富了人们对巨核细胞发育过程和调控机制的认识,出现了大量相关文献。本文根据最新文献,综述人们在有关TPO的表达调控、信号转导、生物活性、临床应用等方面的认识。     

抗栓肽(Decorsin)在大肠杆菌中的克隆及表达

将人工合成的寡核苷酸片段进行体外连接 ,得到编码抗栓肽 (decorsin)的cDNA .将此cDNA克隆到表达载体pMAL p2x中 ,经核苷酸序列测定结果正确 .在大肠杆菌TB1中通过IPTG进行诱导表达 ,融合蛋白的表达量为 8%左右 .融合蛋白通过亲和柱一步纯化 ,SDS PAGE显示为一条主要蛋白质电泳条带 .血小板聚集实验表明 ,融合蛋白具有较强的抑制血小板聚集的功能 ,抑制常数IC50为 3 70nmol L .     

血小板生成素与白介素-11治疗胃癌术后辅助化疗后血小板减少症时效及安全性的比较

目的:比较血小板生成素与白介素-11治疗胃癌患者术后化疗血小板减少症的时效和安全性。方法:术后辅助化疗出现血小板计数低于75×109/L的进展期胃癌患者68例,将其分为TPO组与IL-11组,分别为35例和33例。分别皮下注射rhTPO 15000U,每日1次;rhIL-11 1.5 mg,每日1次,当血小板计数125×109/L或比用药前上升50×109/L,即停止给药,疗程最长为14天。每3天抽取外周静脉血2 m L,通过全自动血液分析仪测定血小板计数,密切观察出现的不良反应并记录。比较两组患者不同临床病理资料、血小板计数、血小板计数升至75×109/L和125×109/L的时程、药物不良反应。结果:两组患者年龄、性别、化疗方案、血小板最低值出现的化疗周期及临床病理分期的比较均没有统计学差异(P值均0.05)。TPO组与IL-11组血小板动态值的比较,第9天出现显著差异(P=0.032)。TPO组与IL-11组血小板计数恢复至75×109/L和125×109/L所需的时间,有显著差异(P=0.041,P=0.013)。TPO组中,有3例(8.6%)患者发生不良反应,IL-11组中,有13例(39.4%)患者发生不良反应,TPO组患者出现的不良反应少且较轻微(P=0.006)。结论:rhTPO治疗胃癌患者术后化疗血小板减少症时效快,安全性好。     

Study of thrombopoietin for gene therapy of thrombocytopenia

Thrombopoietin (TPO) is likely to be a potent, specific and reliable medication in the treatment of thrombocytopenia. A TPO-highly-expressed plasmid pcDNA3-TPO was constructed and a primary study was made on the expression of TPO cDNA in vitro and gene transfer study for thrombocytopenia in vivo. rhTPO showed complete and stable bioactivity by a series of indicators. High expression of TPO was detected in plasma from healthy mice or thrombocytopenia mice model receiving direct intramuscular injection of pcDNA3-TPO. And the platelet level of healthy mice peaked to 1.9-fold of baseline. Mice with CTX-induced thrombocytopenia achieved profound nadirs, acceleration of recovery, even 1.8—2.0-fold supranormal levels of peripheral platelet counts. The results offered experimental support for clinical application of gene therapy for thrombocytopenia via direct intramuscular injection of TPO cDNA.