一种从凝胶简单快速回收核酸的好方法

从凝胶中分离DNA或DNA片断是基因工程中常用的手段.在重组DNA、分子杂交、基因诊断等实验中,经常需要从凝胶中分离并回收核酸或核酸片断.目前分离DNA片断的方法很多.常用的如电洗脱法、冻融法等操作烦琐且得率较低;低融点琼(王旨)糖法得率较高,但价格昂贵,特别是回收的DNA片断常混有细小琼(王旨)糖颗粒,影响以后的酶切、连接等.我们摸索了一种简便方法,能够从琼(王旨)糖凝胶中高纯度、高得率地分离核酸或核酸片断,回收所得的DNA片断可以直接用于各种酶切反应和基因重组实验.现以分离P~(ZB24)重组质粒中2.3kb的大R蠖核多角体基因片断为例,说明如下:     

植物生物技术讲座（一）：原生质体培养

植物原生质体是指通过质壁分离,能够和细胞壁分开的那部分细胞物质。换言之原生质体就是除去全部细胞壁的“细胞”,或是一个为原生质膜所包围的“裸露细胞”。植物原生质体由于失去细胞壁,更由于单个原生质体即包含一个物种的     

长豇豆花药和花粉的发育

长豇豆花药壁的发育为基本型。绒毡层周原质团型,小孢子母细胞减数分裂粗线期至末期Ⅱ,相邻小孢子母细胞间存在胞质通道。四分体多为四面体型,少数为左右对称型。生殖细胞刚形成时,壁呈ＰＡＳ负反应,以后为ＰＡＳ正反应。生殖细胞游离在营养细胞质内后,壁消失。成熟花粉为２细胞型。在小孢子早期,首次观察到在周原质团型绒毡层细胞外切向壁的外方,有很多直径约２－４μｍ,含不溶性多糖、蛋白质和抗乙酰解物质的球形颗粒,以后这些颗粒沿绒毡层细胞的径向壁进入药室,同时在小孢子壁和原生质体之间也出现了同样的颗粒。小孢子外壁增厚的同时,颗粒消失。关于这些颗粒的作用,有待进一步深入探讨。     

运用生物技术开展水稻育种

近年来,许多学者报道水稻原生质体培养成功并获得其再生植株。这一成就必然打破水稻育种与发展中的生物技术之间的隔墙。本文将介绍这些技术是如何发展的,以及这些技术将如何有助于推动水稻育种。水稻原生质体培养和植株再生许多学者用培养的水稻细胞,能容易地分离得到原生质体,并成功地使分离的原生质体经培养、壁再生、细胞分裂而再生成植株。在此研究中,用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞的质量极为重要,因为水稻原生质体的分离和培养     

空间细胞电融合关键技术的地基研究——烟草细胞的电融合

本文针对建立空间细胞电融合技术存在的三个主要问题进行了研究。结果表明,用低温(4℃)、融合介质(0.55 mol/L甘露醇)并添加0.1%纤维素酶保存原生质体,72 h内可以使约94%细胞维持无壁状态,同时并未使细胞丧失再生能力,基本满足从地面制备亲本细胞到在微重力条件下进行电融合,对亲本细胞保持无壁状态的要求。为减少剪切力环境对亲本细胞造成的损伤,一方面用超速离心方法对亲本细胞之一去液泡,另一方面用电泳代替蠕动泵混合亲本细胞。而且,由于原生质体壁生长与其膜电位之间存在负相关性,因此利用电泳方法可以有效地富集和优化亲本细胞。根据地面实验结果推测,空间有/无液泡亲本细胞电融合的较适合参数可能为:交流电场强度90V/cm,频率0.8 MHz,排列时间20 s,直流脉冲1.0—1.3 kV/cm,幅宽40μs,两次脉冲。     

应用荧光增白剂VBL研究原生质体细胞壁的再生

对新分离和培养的烟草(Nicotiana tabacum)叶肉原生质体用荧光增自剂VBL染色,于波长3600～4400光源的荧光显微镜下观察表明,新分离的烟草叶肉原生质体没有发绿色荧光的细胞壁存在,只见发微弱深红色荧光的叶绿体,而培养4～6天以上的原生质体再生壁发绿色荧光,证明含纤维素成分。这种方法亦可用于观察原生质体的出芽分裂和细胞分裂。     

元麦叶肉原生质体细胞壁再生过程中的扫描电镜观察及过氧化物酶活性

元麦叶肉原生质体在MS培养基(附加2,4-D 1mg/L,6-BA 0.25 mg/L)中,进行液体浅层培养。用荧光增白剂(VBL)染色,培养1天出现再生壁。通过扫描电镜观察,发现随着培养时间的延长,原生质体表面逐渐出现短棒状突出物和纤维状结构;培养第5天,原生质体表面覆盖较厚的纤维层,与未脱壁的元麦叶肉细胞表面形态结构相似。用愈创木酚作氢供体测定原生质体胞壁再生过程中过氧化物酶活性,发现随着壁再生率提高,过氧化物酶活性明显下降。用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离阳极向过氧化物酶同工酶酶谱,酶带也随着培养时间的延长而减少。由刚分离的原生质体中的8条减少到培养4天的2条,反映胞壁再生和过氧化物酶活性呈负相关。     

关于“分子筛”提法的一点意见

凝胶层析(又称为凝胶过滤或分子排阻层析)是近年来发展起来的一种研究生物大分子的相当普遍的技术。它是根据被研究物质的分子量的不同,因而从凝胶柱上流出的先后次序不同的原理,来分离由不同分子量的物质组成的混合物,所以人们又称之为“分子筛层析”,把凝胶介质在层析中的物理作用称为“分子筛作用”。在涉及到凝胶层析技术的一些文献中,“分子筛”的提法是比较普遍的,但是从凝胶层析分离大分子物质的过程看,“分子筛”这一提法似乎不够确切。     

梭梭原生质体快速制备方法的建立及其在亚细胞定位中的应用

梭梭是中国西北荒漠半荒漠地区防沙治沙首选建群树种。目前梭梭蛋白亚细胞定位采用洋葱表层细胞以及鹰嘴豆和拟南芥原生质体等进行,但采用不同体系进行亚细胞定位,可能会出现不同结果,这与同源或异源表达的植物细胞特性有关。因此,梭梭蛋白采用其原生质体进行亚细胞定位结果更真实可信。通过对酶种类及配比、质壁分离时间、酶解液pH、酶解时间等的优化,本研究拟建立梭梭原生质体快速制备方法,并探讨其在亚细胞定位中的应用。结果表明:以2～3 cm长的幼嫩同化枝,置于pH值5.6的CPW酶解液(10%甘露醇, 0.1%MES, 1.0%纤维素酶, 0.4%离析酶)中,黑暗条件下27℃恒温水浴45 r/min酶解10～11 h,为梭梭原生质体快速制备最佳条件,原生质体产量可达0.41×10~7个/g·FW,存活率为70.32%;所得原生质体应用于亚细胞定位研究效果良好。本制备方法可应用于梭梭原生质体培养、细胞研究、基因瞬时表达等领域。     

固定化原生质体产谷氨酸脱氢酶的研究

本文报道了用海藻酸钙凝胶包埋法制备固定化谷氨酸捧杆菌T6—13原生质体及其用于生产谷氨酸脱氢酶(GDH,E．C．1．4．1．4)的研究。在一定条件下游离细胞和固定化细胞胞内可积累谷氨酸脱氢酶,但并不分泌到胞外。对数生长前期的细胞经蛋清溶菌酶处理14h后分离得到原生质体,游离原生质体和固定化原生质体可产胞外GDH。用3％海藻酸钙凝胶包埋10%的原生质体制备的固定化原生质体具有较高的产酶性,分批培养72h后发酵液中GDH活力可达到1．64×10^-2u／ml,为游离细胞胞内产酶的205％。固定化原生质体可用溶菌酶处理固定化细胞而制得,与直接固定化原生质体制备的固定化原生质体具有同样的产酶能力,且制备方便。固定化原生质体可重复使用6批次(约18天),且具有良好的贮藏稳定性。     

我国水稻原生质体再生完整植株取得重要突破

水稻细胞成株一直是生物技术中一个难题,国内外生命科学科工作者多年以来试图攻克这一难关,最近中国科学院遗传研究所科学工作者继日本(BN.17/V,85)利用 水稻原生质体再生完整植株取得成功以后终于成功地实现了中国水稻原生质体(去壁的细胞)再生葱缘茁壮的完整植株,这是在我国植物细胞工程研究的一次重要突破,有其重要意义:①通过水稻原生质体成株的事实证明,这项技术路线用于研究其他有经济价     

星球藻属Asterocapsa二新种

原植体球形,亚球形或长圆形,细胞单生或2, 4个细胞组成小群体,再由小群体组成大群体,群体直径8~17μm。细胞球形,不包括胶被直径为2~2.2μm,含胶被时直径为4~5.5μm,个体及群体胶被宽厚、坚硬、黄色、层理明显,密生黄色疣突状棘刺。原生质体均匀或具细小颗粒体,蓝绿色。     

灵芝原生质体分离与再生研究

首次详细、系统地探讨了灵芝原生质体分离与再生的条件,结果表明：用0．6mol／L甘露醇配制成含2％溶壁酶和0．5％崩溃酶的复合酶,在30℃,pH为6.0时酶解3小时,可得到最高的原生质体得率。但考虑到原生质体的再生,以酶解2．5小时为最适。酶解2．5小时所得原生质体经精制,用纤维二糖培养基（以0.6mol／L甘露醇为渗透压稳定剂）进行双层平板（上层平板含0．2％琼脂）培养法再生,原生质体的再生率最高。本研究为以后进行灵芝原生质体的融合以及灵芝的转基因研究打下了基础。     

灵芝原生质体分离与再生研究*

首次详细、系统地探讨了灵芝原生质体分离与再生的条件,结果表明：用0．6mol／L甘露醇配制成含2％溶壁酶和0．5％崩溃酶的复合酶,在30℃,pH为6.0时酶解3小时,可得到最高的原生质体得率。但考虑到原生质体的再生,以酶解2．5小时为最适。酶解2．5小时所得原生质体经精制,用纤维二糖培养基（以0.6mol／L甘露醇为渗透压稳定剂）进行双层平板（上层平板含0．2％琼脂）培养法再生,原生质体的再生率最高。本研究为以后进行灵芝原生质体的融合以及灵芝的转基因研究打下了基础。     

凝胶色谱法制备寡糖

采用已知结构的多糖,控制其水解条件,使之产生所需寡糖片断。用聚丙烯酰胺凝胶色谱(BiO-6el P-4)分离,对中性糖可以分离到含十一个糖残基的寡糖。对氨基糖可分离到含七个糖残基的寡糖。用薄层色谱和快原子轰击质谱鉴定了它们的纯度。     

植物原生质体培养方法

1　植物原生质体培养的简史植物细胞原生质体 ,在植物学上指植物细胞通过质壁分离后 ,可以和细胞壁分开的那部分细胞物质。原生质体分离纯化后 ,须在适当的培养基上应用适当的培养方法 ,才能再生细胞壁 ,并启动细胞持续分裂 ,直至形成细胞团、长成愈伤组织或胚状体、分化和发育成苗 ,最终再生完整植株。其中 ,选择合适的培养方法始终是原生质体培养中最基础也是最关键的一环。植物原生质体培养方法起源于植物单细胞培养方法。早在 190 2年 ,Haberlant通过实验就预言 :体外培养单个细胞可通过其分裂得到培养组织。直到 1954年 ,植物单细胞培…     

完整植物细胞的电击基因转移

本文研究了高压电脉冲对大白菜悬浮细胞通透性和成活率的影响。与原生质体比较,完整细胞可以耐受更高幅值的电脉冲。采用45℃热激,酸性介质(pH4.0)或巯基乙醇预处理黄瓜、水稻和小麦完整植物细胞,有效地提高了导入率。于黄瓜和水稻未去壁的完整细胞,成功地实现了外源 cAT(氯霉素乙酰转移酶)基因的电击导入和瞬间表达。     

黑麦叶肉原生质体的分离、培养与幼小愈伤组织的形成

黑麦叶肉原生质体系用纤维素酶溶去壁后分离出来的。酶液混合液为:纤维素酶(2％)、果胶酶(0.5％)溶于0.65M的甘露醇中,保温在24～26℃。将生长5—6天的黑麦叶片在酶掖中处理2—3小时后,就可使90％以上的原生质体分离下来。将每毫升含有5×10~4—10~5密度的原生质体培养在液体培养基中(表1),其中附加2,4-D(1毫克/升)、6BA(0.5毫克/升)、CH(1克/升)和0.56M蔗糖。培养条件为光照800—2000米烛光,温度23—26℃。培养48小时后长出新壁。第3天出现第一次分裂,4—7天进行第二、三次分裂,9天后形成细胞团,25天后长成大细咆团。此后,定期加等体积的新鲜培养液,继续培养一个时期后便形成了幼小愈伤组织。     

高效转移基因组DNA的阳离子法

目前把外源基因引入植物的方法通常是只利用克隆基因作为供体DNA.然而,许多重要的农艺性状是由多基因或未知基因所控制.借助于原生质体融合或染色体转移已完成了未克隆基因组DNA对原生质体的转移,获得了含多基因大片段DNA的转移.但是,这些方法太难且复杂,常常只能采用限定量的基因型. Metapontum Agrobios的N.M.Antonelli和依阿华州立大学的J.Stadler开发了把未克隆基因转移到植物细胞的简便方法.此方法(以前曾用于哺乳动物细胞转化)过程是:(1)先用聚合阳离子Polybrene(Aldrich)预处理原生质体,然后加入DNA或(2)将     

植物资源开发利用新信息——国外有关植物的专利摘要(十三)

361.培养大戟细胞制造栎精葡糖甙酸 据欧洲1992年专利记载。栎精葡糖是一种生物可以接受的食品黄色染料。用大戟(Euphorbia milli)细胞培养制成。大戟的无菌叶子碎块培养在含2×10~(-6)M2,4-D的MS培养基中直至形成愈伤组织。 362.用香蜂花种子制造原生质体 据日本1992年专利记载。用香蜂花(Melissaofficinalis)种子制造原生质体比用叶子制造可大大缩短时间。其方法为在含生长素的培养基中培育种子,以诱导愈伤组织,然后用愈伤组织用纤维素酶、果胺酶、远志乳化酶(polygalacturonase)、CaCl_2·2H_2O和糖的混合物制备原生质体。(译者注香蜂花供药用)。