甘蔗高粱花叶病毒间接ELISA检测方法的建立和应用

利用人工合成的高粱花叶病毒P3蛋白的多肽片段作为抗原,制备多克隆抗体,利用免疫印迹对抗体的特异性进行鉴定,表明抗体具有高度特异性。通过方阵滴定法确定抗原和抗体的最佳工作浓度,并分别对包被时间、二抗工作浓度、孵育条件、底物显色时间等进行优化,从而建立了高粱花叶病毒(Sr MV)的间接ELISA高通量检测方法。通过测试确定了阴阳性结果判定的临界值,评估了该方法的灵敏度以及与RT-PCR检测法的符合度。所建立的间接ELISA检测方法的抗原、一抗、二抗最佳稀释度分别为1:4、1:600和1:5 000;最佳抗原包被条件为4℃、12 h;抗原抗体最佳孵育条件为37℃、60 min;二抗最佳孵育条件为37℃、45 min;最佳显色条件为37℃、12 min;此检测方法检测速度快、灵敏度高、特异性强,与RT-PCR法的符合度为87.00%。     

柞蚕微孢子虫Nosema pernyi微管蛋白基因的克隆及系统发育分析

【目的】柞蚕微粒子病的病原为柞蚕微孢子虫Nosemapernyi,为解明柞蚕微孢子虫微管蛋白基因的序列信息,明确柞蚕微孢子虫的系统分类学地位。【方法】采用RT-.PCR、3′RACE(Rapid amplification ofcDNAends)等技术克隆得到了柞蚕微孢子虫的α、β和y-微管蛋白基因,并利用α、β-微管蛋白序列,分别采用NJ、ML法构建进化树。【结果】将克隆得到的基因序列提交NCBI(GenBank登录号:KF154086、KF023271、KF740389)。构建的系统发育树显示,微孢子虫类以一个独立群位于真菌群体中,与真菌的虫霉门关系较近,且与担子菌、球囊菌、壶菌、接合菌及部分子囊菌互为姐妹群。从部分微孢子虫的系统发育分析结果可以看出,20种微孢子虫分为2个分支,柞蚕微孢子虫与其他Nosema属聚为一类。【结论】本研究克隆得到了柞蚕微孢子虫α、β和y-微管蛋白基因,系统发育分析为更进一步了解柞蚕微孢子虫奠定了基础。     

DAS-ELISA法快速检测食品中副溶血弧菌TDH毒素

建立副溶血弧菌TDH毒素DAS-ELISA快速检测法,并运用于食品样品实际检测。以TDH+副溶血弧菌菌体及其TDH毒素制备免疫原,分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,制备兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体和鼠抗TDH毒素多克隆抗体,以鼠抗TDH毒素多克隆抗体为捕获抗体,兔抗副溶血弧菌多克隆抗体为检测抗体,建立DAS-ELISA检测法。采用间接ELISA法测定抗体效价,采用棋盘滴定法选择最佳的抗原抗体反应条件,并确定DAS-ELISA各反应条件。结果表明:鼠抗TDH多克隆抗体、兔抗副溶血弧菌多克隆抗体与TDH毒素抗原的最佳工作浓度依次为1:8 000、1:4 000和12μg/m L,酶标二抗最佳工作浓度为1:1 000,检测总时间为5 h,该法具有很强的特异性,对食品中TDH毒素的检测低限为60μg/g。与国标检测方法相比,具有检测时间短,准确度高的优点,将会得到广泛运用。     

检测猪丹毒杆菌抗体重组SpaA ELISA的建立

【目的】利用表达纯化的猪丹毒杆菌表面保护性蛋白SpaA,建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【方法】克隆扩增猪丹毒杆菌SpaA基因,并将SpaA基因与原核表达载体p GEX-6P-1连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定后,将阳性重组质粒转化入受体菌E.coli Rosetta(DE3),并利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。将SpaA重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法。【结果】利用克隆表达的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作抗原,通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为1.0 mg/L,血清的最佳稀释度为1:100,建立了检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,批内及批间变异系数均小于10%,具有较好的重复性及特异性。用建立的间接ELISA方法检测猪丹毒疫苗免疫后的健康猪血清样品,检测结果与美国TSZ公司猪丹毒杆菌抗体检测试剂盒和Western blot鉴定结果进行对比,两者总符合率分别为92.20%、92.59%。【结论】试验利用原核表达的SpaA重组蛋白作抗原建立的检测猪丹毒杆菌抗体的间接ELISA方法,特异性强、重复性好、敏感性高,可用于猪丹毒杆菌的抗体检测及流行病学调查。     

犬瘟热病毒N基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达及应用

目的:为检测犬瘟热抗体提供诊断抗原,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)N蛋白。方法:采用RT-PCR克隆CDV-N基因,构建重组杆粒BacmidCDV-N,并将其转染Sf9昆虫细胞。通过Western blot和间接免疫荧光检测N蛋白的表达。以表达的CDV N蛋白为包被抗原,建立了检测犬瘟热抗体的间接ELISA方法。结果:成功表达了CDV N蛋白。间接ELISA(iELISA)方法中,犬血清最佳稀释度1∶80,N蛋白稀释度1∶40(6.3μg/100μl)。应用该方法共检测了36份犬血清,与中和试验检测方法相比较,其特异性为81.8%,灵敏度为96.0%,符合率为91.7%。结论:表达的CDV-N蛋白具有良好反应原性,建立了快速检测CDV阳性血清的iELISA方法。     

兔抗弓形虫CorA家族Mg~(2+)转运蛋白多肽抗体的制备及鉴定

目的:制备并鉴定兔抗弓形虫CorA家族Mg~(2+)转运蛋白(TgMg)的特异性多克隆抗体。方法:设计并合成一段的具有较好免疫原性的、来源于TgMg氨基酸序列的短肽,短肽与KLH偶联后免疫新西兰大耳白兔,收集兔血清并分离纯化TgMg多克隆抗体,利用间接ELISA、Western印迹、间接免疫荧光等多种分子生物学方法鉴定多抗的效价、特异性及TgMg蛋白的亚细胞定位。结果:间接ELISA测定多抗效价为1∶160000;Western印迹显示该多抗能识别相对分子质量约为174×103的单一条带,表明抗体的特异性较好;用间接免疫荧光法发现TgMg定位于细胞质,与预期结果相符。结论:运用人工合成多肽结合经典的多克隆抗体制备技术制备了抗TgMg多克隆抗体,为深入研究TgMg蛋白的生物学特性及代谢功能提供了有效工具。     

黄瓜细菌性白枯病菌特异性抗体制备及其ELISA检测方法的建立

目的:制备黄瓜细菌性白枯病菌特异性抗体,建立其酶联免疫吸附分析(ELISA)的检测方法.方法:分别以黄瓜细菌性白枯病菌胞内蛋白和菌体为免疫原,制备两再种抗体,优化间接ELISA检测条件.结果:间接ELISA法测定两种纯化的菌体抗体(J4)和胞内蛋白抗体(P2)效价分别为1:32000和1:4000,二抗的最佳稀释度为1:3000,方阵试验表明J4的工作浓度为1:16000,抗原的最佳包被浓度为10<'6>cfu/ml,P2的工作浓度为1:2000,抗原的最佳包被浓度为10<'7>cfu/ml,两种抗体的灵敏度均为10<'5>cfu/ml,与黄瓜细菌性角斑病菌等26个菌株无交叉反应,特异性强.结论:成功制备了黄瓜细菌性白枯病菌特异性抗体,建立了ELISA检测方法.     

家兔支气管败血波氏杆菌重组百日咳杆菌粘附素（PRN）蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的表达支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）PRN蛋白,并以此建立检测Bb抗体的间接ELISA方法。方法参照GenBank公布的猪源支气管败血波氏杆菌prn基因序列（AY376325）设计了一对特异性引物,PCR扩增出相应的核苷酸片段。将PCR扩增产物连接至原核表达载体pGEX-4T-1中,以E.coli BL21（DE3）为表达菌株进行诱导表达,以纯化重组蛋白PRN作为诊断抗原,通过探索最佳抗原包被量和抗体血清稀释倍数等,建立检测支气管败血波氏杆菌抗体的间接ELISA方法。结果成功克隆了prn全基因序列,并在E.coliBL21（DE3）中获得高效表达,经SDS-PAGE、Western blot分析显示重组蛋白PRN具有良好的抗原性。应用重组蛋白PRN为抗原建立了检测Bb血清抗体的间接ELISA诊断方法。试验确定重组蛋白PRN抗原的包被浓度为500ng/mL,最适血清稀释度为1∶40。结论建立的ELISA检测方法,不仅为Bb抗体检测提供了实用的血清学检测手段,也为进一步开发Bb检测试剂盒奠定了基础。     

粗糙脉孢菌ERG-11蛋白抗原的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备

构建p ET-28a(+)-ERG-11重组质粒,表达6×His-ERG-11融合蛋白,制备ERG-11多克隆抗体。采用PCR技术扩增目的片段,插入p ET-28a(+)原核表达载体,并转入E.coli BL21(DE3)感受态表达融合蛋白,融合蛋白经亲和纯化及分子筛纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,取血清后,采用间接ELISA法和Western blot法检测多克隆抗体的效价及特异性。成功构建了p ET-28a(+)-ERG-11表达载体,SDS-PAGE电泳显示成功诱导出以包涵体形式存在的6×His-ERG-11融合蛋白,两步纯化后得到纯度较高的抗原,间接ELISA法显示制备的多克隆抗体效价达到1∶512 000,Western blot显示具有较高特异性。成功实现了粗超脉孢菌ERG-11蛋白的原核表达,制备出一支兔抗粗超脉孢菌ERG-11的多克隆抗体。     

流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒

[目的]建立流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒(PVA)的新方法.[方法]以荧光微球为反应载体,通过在微球表面进行双抗夹心免疫反应形成微球-捕获抗体-PVA-标记FITC检测抗体的复合物,利用流式细胞仪荧光检测系统收集荧光信号.[结果]通过实验优化检测条件,最佳捕获抗体工作浓度为4μg/mL、最佳检测抗体工作浓度为1:25倍稀释、最佳反应时间为2h;与马铃薯Y病毒、莴苣花叶病毒、番茄环斑病毒等均未出现交叉反应;阳性样品经64倍稀释后依然可检出,检测灵敏度是传统微孔板ELISA的4倍.[结论]流式微球一步法能灵敏、快速、简便的检测马铃薯A病毒.