核定位信号筛选系统的构建

建立了一酵母克隆系统用于克隆含核定位信号 (NLS)的蛋白质的基因 .用表达转录因子GAL4 DNA结合域 - p53(GAL4- DBD- p53)融合蛋白的质粒转化酵母 HF7c,使 GAL4- DBD- p53可结合于报告基因的启动子但因无转录激活域而不能激活转录 .构建一酵母穿梭载体 ,可表达无NLS的 GAL4转录激活域 -大 T抗原 (GAL4- AD- LT)融合蛋白 .融合蛋白基因的下游插入一多克隆位点 .将 c DNA文库插入多克隆位点后 ,如果 c DNA片段可编码 NLS,则 GAL4- AD- LT分子可进入细胞核 ,并通过 LT与 p53的相互作用而使 GAL4- AD结合于启动子和激活报告基因的转录 .构建了这一克隆系统的各质粒 ,并用绿色荧光蛋白 (GFP)验证了其对核内蛋白和胞浆蛋白的甄别能力 .这一系统将有助于从 c DNA文库中筛选编码带有 NLS的蛋白质的基因     

RU486诱导调控载体的构建及体外表达

构建可经RU486诱导表达载体,并证实其对基因表达的调控作用。通过分子生物学技术,改造了含有GLP65反式作用调控因子和GAL4杂合启动子的PRS质粒。PCR扩增BGHpolyA片段,并引入需要的酶切位点。在GLP65调控区上游添加了hCMV启动子,在GAL4杂合启动子下游加入了荧光素酶报告基因。同时,为减少两个转录单元之间的潜在干扰,加入了1.2 kb的小鸡β珠蛋白绝缘子。经PCR和限制性酶切及测序证实了载体的正确性。在体外转染HEK293细胞后,运用双荧光素酶报告基因技术鉴定了该系统的调控能力。加入诱导剂RU486后,可以诱导表达荧光素酶,并在一定范围内两者呈正比,最高可以实现荧光素酶的40余倍的表达,而没有RU486时,几乎没有报告基因的表达,表明RU486诱导调控载体构建成功,可实现对目的基因的表达时间和表达水平的精确调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗提供了良好的工具。     

噬菌体T7溶菌酶工程菌的构建

将噬菌体T7溶菌酶基因克隆到含有可诱导性启动子LacUV 5的表达载体pARl206中。在没有诱导剂存在情况下,LacUV 5启动子的转录受到抑制。当带有重组质粒的转化菌生长到适当浓度,向培养液中加入0．4mmo1／L IPTG,LacUV 5启动子受到诱导,从而使插入的基因高水平表达,并积累大量具有生物活性的溶菌酶。噬菌体T 7溶菌酶在大肠杆菌中表达的产量平均约22mg／L。     

苜蓿根瘤菌nodA蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

基因标记、转化、表达与检测

922444 通过诱导T7 RNA聚合酶强烈抑制氯霉素乙酰转移酶的表达[英]/Kim,H.B.…∥Biotechnol.Lett.-1991,13(10).-751～754[译自DBA,1991,10(25),91-14511] 通过诱导大肠杆菌中的噬菌体T7表达系统强烈抑制氯霉素乙酰转移酶的表达。消化了质粒pYEJ001(含带有大肠杆菌核糖体结合位点序列的无启动子cat基因)和质粒pGEM3(带有T7和SP6启动子),将连接混和物导入大肠杆菌。含由T7和SP6启动子调控的cat基因的质粒分别称为pT7CAT和pSP6CAT。即使在无RNA聚合酶条件     

苜蓿根瘤菌nod A蛋白在细胞中的定位

应用噬菌体T7 RNA聚合酶/启动子表达系统,质粒pT7—6作为载体,构建了带有首蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)nod A基因的重组质粒pBF3.nod A在T7启动子的控制下,经诱导在大肠杆菌JAKE中得到表达,产物为21.5kD多肽.对nod A基因在大肠杆菌中的翻译产物(NodA)进行细胞定位分析表明,NodA同时存在于细胞质和细胞膜中.     

耐碱性木聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质

摘要：【目的】从耐碱性木聚糖酶高产短小芽孢杆菌中克隆得到带有自身启动子的木聚糖酶基因,将其在巨大芽孢杆菌中进行表达,并对表达产物进行性质分析。【方法】将克隆得到的木聚糖酶基因xynA以及带有自身启动子序列的结构基因, 构建在芽孢杆菌表达载体pWH1520和改造后的载体pWG03中,得到重组质粒pWTEJX和pWGXYN,分别转化到巨大芽孢杆菌BM70中,获得重组巨大芽孢杆菌BMJXH9和BMGpp12;经过诱导产酶培养,均得到分泌表达。【结论】重组巨大芽孢杆菌BMGpp12比BMJXH9产酶活力提高了三倍     

基因工程

将启动子和结构基因插入质粒,构成表达载体,用之转化受体菌,如大肠杆菌,从而使干扰素得到大规模生产。用仙台病毒诱导BALL一1细胞后,从这些细胞中制备出两种a一干扰素。这两种干扰素也可以从克隆的质粒载体转化     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP,用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白。同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体．pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133．3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高。生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的。     

氯霉素乙酰基转移酶基因在家蚕核型多角体病毒P10基因启动子控制下的表达

昆虫核型多角体病毒(NPV)P10基因属于晚期基因,为强启动子所控制,又是病毒复制所非必需的基因。我们对前报的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)P10基因,应用PCR技术进行ATG区定点突变,在ATG被突变的同时形成一个BglⅡ酶切位点,得到一个不含ATG的BmNPV P10基因启动子。将长为230bp的经突变后的BmNPV P10基因5’端(包括启动子所有特征)片段克隆进pMMTV·CAT质粒中,构建成一个CAT基因在BmNPV P10基因启动子控制下的pBmPl0·CAT瞬间表达质粒。该质粒通过转染进入经野生型BmNPV感染的BmN细胞中,CAT得以表达。证明BmNPV P10启动子是比较强的启动子,可以在BmN细胞表达外源基因,具备了作为表达载体启动子的特性。     

邻苯二酚氧化酶基因在根癌农杆菌中的表达——多用途基因载体的构建

来源于假单胞杆菌的邻苯二酚氧化酶结构基因与质粒四环素抗性基因的启动子相拼接构成的融合基因,不仅能在大肠杆菌中表达,而且也能在根癌农杆菌中表达。带有这融合基因作为标记的重组质粒pBZ 731,具有EcoR Ⅰ,Hind Ⅲ,BamH Ⅰ,Kpn Ⅰ,Hpa Ⅰ等多个单一的酶切位点,因而可作为常规的基因载体。重组质粒pBZ 732还可作为中间载体将外源基因引入植物基因工程载体pGV 3850,利用pBZ731和pBZ 732可以研究任何其它来源的启动子是否能在根癌农杆菌中发挥作用。以pBZ731和pBZ 732作为基因载体、检测方便而且极其迅速。     

携带苏云金芽胞杆菌cry1Ac10基因重组杆状病毒的构建及其杀虫活性

用Bac-to-Bac系统,构建了包含极晚期基因ph启动子驱动的带有全长苏云金芽胞杆菌cryIAc10基因和完整多角体基因的重组质粒pFCP, 用该重组质粒感染昆虫Sf9细胞,得到了带有多角体和能够表达cry1Ac10基因的重组杆状病毒vFcph,并在昆虫细胞中表达了Cry1Ac10蛋白.同时构建了含cry1Ac10的穿梭载体pHTC,并分别转化大肠杆菌、枯草杆菌和苏云金杆菌晶体缺陷型菌株,结果表明此三种工程菌均表达了分子量为133.3kDa的原毒素蛋白,其中在苏云金芽胞杆菌中的表达量最高.生物测定表明重组杆状病毒vFcph的表达产物具有杀虫活性,能增加杆状病毒力,加快杆状病毒杀虫速度,说明利用杆状病毒极晚期基因启动子驱动苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白表达,从而改善杆状病毒的杀虫特性是可行的.     

甘露碱合成酶基因启动子调控的萤光素酶基因在转化烟草中的表达

利用我们自己分离的甘露碱含成酶基因启动子与萤光素酶结构基因、胭脂碱合成酶基因’3末端结构相拼构成一融合基因,并在带有此融合基因的中间载体PBZ7610插入Ti质粒T区的tmr基因,构成中间载体pBZ7621。利用改建的Ti质粒载体PGV3850,将萤光素酶融合基因引入了烟草植株,结果表明,萤光素酶融合基因在转化烟草中能表达。中间载体pBZ7610还带有PstⅠ,HindⅢ,XbaⅠ等多个单一的酶切位点,外源基因极易插入。利用中间载体pBZ7621,还可研究启动子在高等植物不同发育阶段中的功能特征。     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET-CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET-L1E7CTA2B.在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR-TATA盒与T7启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB-T7杂合启动子.最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir-16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir-16L1E7.Western blot结果证实以上质粒nirB-T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7融合蛋白.口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础.     

抗辐射菌属-大肠杆菌间的穿梭载体的构建及荧光基因的表达

摘要：【目的】构建抗辐射菌属一大肠杆菌间的穿梭载体,通过此载体使荧光素酶基因在大肠杆菌中得到表达。【方法】以质粒pUE30、pGBM5及pKatCAT为基础,构建抗辐射菌属一大肠杆菌间的穿梭载体,将groEL启动子和荧光素酶基因lux+插入到构建的穿梭载体中得到穿梭表达载体,并将该载体转化大肠杆菌诱导荧光素酶基因的表达。【结果】成功构建了大小约为5.8 kb的抗辐射菌属一大肠杆菌间的穿梭载体pZT17,该载体在没有抗生素的非选择性培养基中能稳定存在。在穿梭载体pZT17的EcoRV部位插入含有groEL启动子和荧光素酶基因lux+的DNA片段,构建得到了穿梭表达载体pZTGL2;利用该表达载体在大肠杆菌中可诱导表达荧光素酶基因。【结论】构建的穿梭表达载体为以后用大肠杆菌高效表达来源于抗辐射菌的基因、特别是DNA损伤修复蛋白基因,提供了可能。     

地衣芽孢杆菌α—淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达

采用PCR技术扩增了sacB基因的启动子-信号序列,并将扩增的序列重组进含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的质粒载体上构建了含α-淀粉酶基因的分泌型表达载体pSA60。将pSA60转化枯草芽孢杆菌QB1098后,α-淀粉酶基因在sacB基因启动子-信号序列的调控和蔗糖的诱导下获得表达,表达产物分泌至胞外。     

HPV16重组减毒沙门氏菌表达质粒的构建及其诱导免疫

将人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)16 L1E7基因插入携带霍乱毒素基因的pET CTA2B载体,获得HPV16L1E7与CTA2B融合表达质粒pET L1E7CTA2B。在此基础上,通过PCR基因克隆技术,将pET载体的T7启动子与pTETnir15载体的大肠杆菌硝酸盐还原酶基因B启动子nirB进行分割重组,将nirB启动子的厌氧调控元件和启动子基本元件FNR TATA盒与T7 启动子的核糖体结合位点(SD)序列融合,形成nirB T7 杂合启动子。最后获得HPV16重组减毒沙门氏细菌疫苗表达载体pNir 16L1E7CTA2B,并进一步构建对照质粒pNir 16L1E7。Western blot结果证实以上质粒nirB T7杂合启动子能够在沙门氏细菌中表达L1E7 融合蛋白。口服免疫接种小鼠可成功诱导小鼠生殖道产生HPV16 特异性粘膜免疫,且霍乱毒素CTA2B可以增强粘膜免疫诱导能力,为开发廉价有效的HPV16预防性疫苗打下了基础。     

人精子蛋白17放射诱导表达细胞模型的构建

目的:构建pEgr-Sp17重组质粒,并检测其在人卵巢癌细胞系HO8910中的辐射诱导表达,探索Egr-1基因调控序列辐射诱导下游基因表达的功能,建立放射诱导表达人精子蛋白Sp17的细胞模型。方法:用双酶切、粘端连接的方法构建含有辐射诱导特性的早期反应因子Egr-1和人Sp17基因的pEgr-Sp17重组质粒,利用脂质体介导其转染人HO8910细胞,用免疫细胞化学方法检测X线照射后被转染细胞中Sp17的表达。在确证Sp17能瞬时表达后,继续用含G418的RPMI1640培养基培养细胞,筛选稳定表达Sp17的细胞株。结果:测序结果和酶切鉴定均证实pEgr-Sp17重组质粒构建正确;免疫细胞化学试验表明pEgr-Sp17重组质粒转染的人HO8910细胞表达Sp17蛋白。结论:X线可诱导pEgr-Sp17重组质粒在人HO8910细胞中表达Sp17蛋白,构建了Sp17蛋白放射诱导表达的卵巢癌细胞模型。     

多酶单一切点Tac启动子质粒pTL的组建与应用

本工作组建了一个含Tac启动子(promoter)的表达载体质粒pTL。pTL带有Trp-35区、Lac-10区及两个终止区(t_1t_2),并带有EcoRⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ、PstI及HindⅢ等单一酶切点,可以在这些切点中插入各种基因片段,由Tac启动子促进基因的表达。在Ap抗性基因中无PstⅠ切点,故在PstⅠ切点插入外源基因后,Ap抗性不受影响。用pTL表达人干扰素αD基因,获得较高的产率,每立升菌液约得8.2×10~7单位,相当于每立升4mg干扰素。     

乳链菌素生物合成基因启动子的结构、功能与应用研究

乳酸乳球菌 (Lactococcuslactis)中的乳链菌素 (Nisin)的生物合成由含 1 1个基因的基因簇nisA(或Z)BTCIPRKFEG控制。在这个基因簇共有 3个启动子 :nisA启动子 ,nisF启动子和nisR启动子 ,科学家已经克隆了它们并对其结构与功能进行了研究 .nisR启动子是组成型表达的 ,而nisA/nisF启动子由应答调控蛋白NisR和组氨酸激酶NisK所组成的双组分调控系统调控表达 :NisK接受外源nisin信号 ,自身磷酸化后将磷酸基团递给NisR ,NisR激活nisA/nisF启动子 ,进行下游基因的转录。利用这种特点 ,开发出了能在革兰氏阳性菌中可诱导表达的质粒载体 ,包括单质粒载体系统和双质粒载体系统 ,它们在理论及应用研究上具有很大的价值。