亮氨酸脱氢酶与葡萄糖脱氢酶高效共表达制备L-叔亮氨酸北大核心CSCD

【目的】通过不同双基因共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶基因在大肠杆菌中表达影响的研究,获得具有高辅酶再生效率的双酶共表达重组生物催化剂,实现L-叔亮氨酸"一锅法"高效不对称合成。【方法】以来自于蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)的亮氨酸脱氢酶(LDH)和来自芽孢菌属(Bacillus sp.)的葡萄糖脱氢酶(GDH)为模板,考察单质粒共表达,双质粒共表达和融合表达等3种共表达策略对重组细胞中亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活的影响,比较不同酶活比例和不同催化剂形式对三甲基丙酮酸不对称还原制备L-叔亮氨酸效率的影响。【结果】研究发现不同共表达策略对亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的影响存在明显差异。亮氨酸脱氢酶在不同策略下均能够正常表达,而葡萄糖脱氢酶在融合表达时没有活力,当C端含有组氨酸标签时,表达蛋白活性低。通过表达优化,获得3株亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶高效表达且具有不同酶活比例的重组菌。比较粗酶液和全细胞形式下的催化效率,发现酶活比例及催化剂形式对不对称还原反应效率具有重要影响。确定单质粒串联表达C端不含His标签重组菌E.coli BL21/p ET28a-L-SD-AS-G为最佳催化剂,以粗酶液进行转化时,完全转化0.5 mol/L底物所需菌体量为15 g/L,辅酶量为0.1 mmol/L。【结论】采用单质粒共表达策略,成功构建出1株具有较高亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶活性的重组菌,实现高效催化TMP合成L-Tle。     

丙酮酸和乙酰-CoA协同促进L-亮氨酸的合成

【目的】通过理性改造柠檬酸合酶(citrate synthase,CS)、丙酮酸脱氢酶系E1p (pyruvate dehydrogenase complex,PDHC,编码基因aceE)和ATP-柠檬酸裂解酶(ATP-Citrate lyase,ACL),有效供应胞内丙酮酸和乙酰-CoA,以提高L-亮氨酸产量。【方法】以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为底盘细胞,分析不同CS和PDHC酶活水平对L-亮氨酸合成的影响。随后,考查协同改造CS和PDHC或引入绿硫菌(Chlorobium tepidum)中ACL对L-亮氨酸合成的影响。【结果】低强度的CS酶活(即重组菌XL-3 P_(dapA-R2)gltA)有利于L-亮氨酸的合成,L-亮氨酸产量达到17.5±0.6 g/L。而改变PDHC酶活水平不利于L-亮氨酸的合成。此外,以启动子P_(dapA-R2)控制CS表达,而以启动子P_(gapA)控制PDHC表达时(即重组菌XL-4),可实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA的有效供给,L-亮氨酸产量达到20.2±1.7 g/L,且显著降低副产物产量。若在重组菌XL-4中引入C.tepidum,ACL会显著抑制菌体生长而不利于L-亮氨酸合成,而引入到出发菌XL-3中因胞内丙酮酸和乙酰-CoA得到有效供给,目标重组菌XL-5L-亮氨酸产量达到18.5±1.2 g/L,比出发菌株XL-3增加了14.2%。【结论】重组菌XL-4中因协同控制CS和PDHC酶活,从而实现胞内丙酮酸和乙酰-CoA有效供给,促进L-亮氨酸的合成。该研究结果对后续利用代谢工程技术强化微生物合成L-亮氨酸等支链氨基酸具有重要的参考价值。     

黄色短杆菌TK0303的L-亮氨酸生物合成途径分析

应用途径分析方法分析了在拟稳态时黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)TK0303由葡萄糖发酵生产L-亮氨酸的代谢途径,确定了L-亮氨酸合成的最佳途径和最大理论产率。通过比较途径分析所获得的反应模型,确定了丙酮酸和乙酰辅酶A是L-亮氨酸合成途径的关键节点。在此基础上改变外界环境因子,强化L-亮氨酸生物合成途径中丙酮酸和乙酰辅酶A两个关键节点的代谢流,以期进一步提高L-亮氨酸产率。结果表明,经过谷氨酸以及醋酸铵的调节,代谢途径流量发生显著变化,L-亮氨酸产量有明显提高。     

亮氨酸对细胞影响的研究与应用

作为支链氨基酸之一的亮氨酸,不能在哺乳动物体内合成,只能在微生物或植物体内从头合成。亮氨酸是一种调节因子,可以调控细胞内信号通路,并对细胞内蛋白合成、周转及机体免疫和氧化功能等方面有着重要的生物学作用。近年来,随着亮氨酸在营养方面的应用日益广泛,科技的不断发展进步,对亮氨酸的研究也随之深入。因此,本研究主要针对亮氨酸对细胞影响的研究与应用方面进行阐述,为深入、系统的研究亮氨酸的作用机理提供理论参考。     

不同碳源生物转化合成L-亮氨酸的代谢计量分析

目的:建立黄色短杆菌利用不同碳源生物合成L-亮氨酸的代谢网络模型,并进行代谢网络计量分析.方法:通过对所构建的L-亮氨酸代谢网络模型进行途径分析,确定以果糖、葡萄糖、蔗糖或木糖为碳源时L-亮氨酸生物合成的基元模型、最大理论产率和不同模型的呼吸熵.结果:通过途径分析得到了L-亮氨酸生物合成的基元模型.以果糖、葡萄糖、蔗糖和木糖为碳源时L-亮氨酸的最大理论产率均为66.7%,其对应的最大呼吸熵分别为18、16、19、18.结论:L-亮氨酸理论得率与碳源种类无关;呼吸熵增加,能够有效提高L-亮氨酸合成代谢流,限制菌体量的过量生成.与其他碳源相比,蔗糖能够避免碳架溢流出现,合成L-亮氨酸能量代谢需求低;而葡萄糖能够较好地满足菌体生长和产酸的需求.     

光学活性丙氨酸和叔亮氨酸的不对称合成

α-酮酸1a-b与R-或S-α-苯乙胺反应,然后经过还原和氢解,生成光学活性的丙氨酸(4a)和叔亮氨酸(4b)。当采用Pd/C催化氢化和NaBH4还原时的立体选择性不同。在NaBH4还原的条件下,e.e.值达80%以上。     

mTORC1信号通路亮氨酸感受器——Sestrin2

正亮氨酸是重要的蛋白质合成原料,同时也可作为信号分子参与调节包括饱感、胰岛素分泌、骨骼肌合成代谢等多种生理活动。mT OR复合物1(mT OR complex 1,mT ORC1)蛋白激酶是调节亮氨酸功能的关键调控分子,通过控制蛋白质、脂质合成、自噬等过程调控细胞发育。然而,mT ORC1上游的亮氨酸相关信号通路尚不清楚。近期来自麻省理工学院的David M.Sabatini实验室在《科学》杂志上报道了最新研究:Sestrin2在mT ORC1信号通路中发     

L—亮氨酸Schiff碱的锌（Ⅱ）配合物的合成及抑菌活性

本文合成了尚未见报道的Ｌ—亮氨酸Ｓｃｈｉｆｆ碱的锌（Ⅱ）配合物,并进行了性质表征和抑菌活性实验。     

亮氨酸脑啡肽抑制培养大鼠主动脉平滑肌细胞增殖

实验以培养的ＳＤ大鼠胸主动脉平滑肌细胞为模型,用四唑盐比色地及＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入技术动态观察发现亮氨酸脑啡肽可显著抑制血管平滑肌细胞的增殖及ＤＮＡ的合成,阿片受体阻断剂纳洛酮对ＶＳＭＣｓ的增殖及ＤＮＡ的合成无影响,但ＮＡＬ可拮抗亮氨酸脑啡肽对ＶＳＭＣｓ增殖的抑制作用。     

支链氨基酸的代谢

<正> 支链氨基酸包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。因为在它们的碳链中都有分支,故总称这三种氨基酸为支链氨基酸或分支氨基酸。它们都属于体内不能合成而必需从食物中获得的必需氮基酸。在支链氨基酸中最早发现的氨基酸是亮氨酸。但一直到30年代后     

A useful route to (R)- and (S)-tert-leucine

Resolution of 1-(2-furyl)-2,2-dimethylpropylamine, an intermediate on a synthetic route to tert-leucine, followed by oxidation of the respective enantiomers, constitutes an interesting and useful strategy to (R)- and (S)-tert-leucine.     

Preparative resolution of the enantiomers of tert-leucine derivatives by simulated moving bed chromatography

The enantiomers of two different derivatives of tert-leucine were separated by continuous chromatography on chiral stationary phases applying the simulated moving bed technique. About 1 kg of racemic N-carbobenzoxy-tert-leucine was resolved on the cellulose-based phase Chiralcel OD using a mixture of heptane/ethanol and 0.1% of trifluoroacetic acid modifier as the mobile phase, while 520 g of the N-Boc-tert-leucine-benzylester was resolved on the amylose-based phase Chiralpak AD with a mixture of heptane/2-propanol as the mobile phase. In both instances the corresponding enantiomers were obtained in high yield and high optical purity.     

Short, solubilized polyalanines are conformational chameleons: exceptionally helical if N- and C-capped with helix stabilizers, weakly to moderately helical if capped with rigid spacers

Isolating spacers introduced between solubilizing lysine regions and a polyalanine core permit rigorous characterization of context-free alanine helices. The preferred building blocks for isolating spacers are amino acids with rigid, extended conformations such as proline, isonipecotic acid, and tert-leucine. Replacing isolating spacers by conventional N- and C-caps dramatically increases the helicity of dodecaalanine. Solubilized, isolated polyalanines provide optimal tools for testing polypeptide helicity algorithms, central to resolution of the protein folding problem.     

DNA合成技术及应用

DNA从头合成技术是指以寡核苷酸链为起始的合成DNA片段的技术,其不断进步是合成生物学快速发展的基石之一。常规使用的连接介导的DNA合成技术和PCR介导的DNA合成技术日益成熟,精确合成长度已经达到0．5—1kb。微阵列介导的DNA合成技术不断发展,其低成本、高通量的特点吸引了人们的注意;而酵母体内DNA合成技术的成功探索也为体外DNA合成提供了一种补偿方法。DNA合成在优化密码子用于异源表达、构建异源代谢途径、合成人工基因组以及合成减毒病毒用于疫苗研制等方面有广泛应用。综述了DNA从头合成技术的研究进展,并介绍了DNA合成的前沿应用。     

P1 and P3 optimization of novel bicycloproline P2 bearing tetrapeptidyl alpha-ketoamide based HCV protease inhibitors

With the aim of discovering potent and selective HCV protease inhibitors, we synthesized and evaluated a series of 1a based tetrapeptidyl ketoamides with additional modification(s) at P1', P1, and P3 positions. As a result of this effort, we found that replacement of the P3 valine with tert-leucine resulted in the discovery of a series of inhibitors (e.g., 3a, 3c, and 4c) endowed with improved enzyme and/or cellular activity relative to 1a. When dosed to F-344 rats orally at 50mg/kg, 3a achieved 2.5x higher liver and plasma exposure in comparison to that detected with 1a.     

基因合成技术研究进展

基因合成是生物学中一项最基本的、最常用的技术.对DNA调控元件、基因、途径乃至整个基因组的合成是验证生物学假设和利用生物学为人类服务的有力工具.合成生物学的快速发展对基因合成能力提出了日益迫切的需求.近年来,基于微芯片基因合成技术取得了很多令人振奋的新进展,正在向着高通量、高保真、自动化的方向发展.文中综述了DNA化学合成和基因组装及相关技术的最新研究进展和发展趋势,这些新技术正在推动着合成生物学向着更高的水平发展.     

Inclusion volume solid-phase synthesis

Solid-phase synthesis of peptides was carried out using only the volume of the solvent included in the swollen solid-phase resin beads [inclusion volume synthesis]. This approach enables (i) the use of higher concentrations of activated amino acids, resulting in increased coupling rates, (ii) drastically decreased consumption of solvents, and (iii) the construction of multiple peptide synthesizers having virtually no reaction vessels.     

Synthesis of RNA by Rhodomicrobium vannielii swarmer cells

Abstract Protein synthesis in Rhodomicrobium vannielii swarmer cells, incubated anaerobically in the dark, is dependent upon a rifampicin-sensitive step, indicating a dependence upon de novo RNA synthesis. In addition, toluene treatment has shown that the motile, non-differentiating swarmer cells have the capacity to initiate and sustain RNA synthesis. The major form of the DNA-dependent RNA polymerase responsible for this RNA synthesis has been identified.     

从DNA合成技术角度阐述合成生物学

合成生物学是一个拥有巨大潜力的新兴学科,合成生物学技术的发展将会对未来生物、医药、农业、能源、材料和环保等方面产生巨大的推进作用。基因合成是合成生物学中最基本和使用最多的一种技术手段,合成生物学的快速发展对基因合成能力提出了空前需求。综述基因合成技术的发展历史、现状和未来趋势,探讨基因合成技术存合成生物学以及整个生命科学研究中的应用和重要意义。     

工业生物技术中DNA合成发展现状及展望

DNA合成是生命科学领域的共性支撑技术和合成生物学的关键使能技术。以合成生物学为基础的工业生物技术持续快速发展,迫切需要更加便捷、经济、安全的DNA来源以满足其日益增长的大规模DNA合成需求。工业化DNA合成在通量、成本、速度等方面的优势日益凸显,有力推动了工业生物技术研发效率的提升和研发成本的下降。但是现有技术在生产过程中还存在着使用大量有机试剂、资源浪费等问题。随着DNA合成规模的持续快速提升,有毒化学品危害、成本负担、环境负担等问题日益突出。本文结合我们的工作实践,对工业生物技术中DNA合成需求、合成策略以及可持续发展面临的问题和解决方案研究进展进行探讨。