关于第Ⅷ因子浓缩物是否有传播HAV危险的研究进展

本文介绍了近年来一些国家在使用高纯度第Ⅷ因子浓缩物治疗血友病时，有患者发生甲型肝炎病毒（ＨＡＶ）感染的情况；并从流行病学、分子生物学以及病毒灭活方法等方面对第Ⅷ因子浓缩物是否有传播ＨＡＶ的可能性进行了简要的论述。     

人凝血因子Ⅷ工艺研究进展

人凝血因子Ⅷ(Human coagulation factorⅧ,FⅧ)是人血浆中重要的蛋白质,是人体内源性凝血途径的主要成分,血液中FⅧ过低会导致不同程度的凝血功能障碍。目前国内FⅧ大多以血浆冷沉淀为起始原料,采用离子交换层析纯化获得"#$。在此工艺中,血浆的采集、血浆融化、冷沉淀离心、冷沉淀的溶解、层析前样品的预纯化、离子交换层析条件、病毒灭活、冻干工艺均对FⅧ的质量影响较大,因此主要从这几方面进行了综述。     

用β-丙内酯/紫外线照射灭活血浆和血浆衍生物中的肝炎病毒和HIV

<正>1956年,由LoGrippo和Hartmann介绍的人血浆冷灭菌法结合了化学试剂β-丙内酯/(β-PL)与紫外线照射的光化学灭菌效果。在不稳定血浆蛋白中所含病毒灭活的主要问题是破坏病毒和保留血浆蛋白的大部分活性。β-PL/UV灭菌过程导致活性的丢失对各蛋白是不同的。用该灭菌工艺对白蛋白和免疫球蛋白的活性不受影响。凝血因子的大部分活性降低。因为冷沉淀是生产FⅧ的原材料,对该物质用β-PL/VV的灭菌条件不同于对血浆的灭菌条件,Ⅷ浓缩物冷灭菌法的大规模生产至今还没有解决。Blotest静注免疫球蛋白制品用β-PL进行灭菌,未经UV照射。     

浓制因子Ⅷ的热处理效能

<正> 作者分别以68℃干热处理2和24小时的两组浓制因子Ⅷ,发现含有抗HIV阳性血浆。现已证明,在浓制人凝结因子中有能传播人免疫缺陷病毒( HIV)。用酶联免疫试验法检测抗HIV抗体,用免疫污班法确定执HIV抗体。经鉴定两组热处理的浓缩Ⅷ各含有HIV阳性血浆的浓制Ⅷ。A组为68℃干热处理 2小时; B组为68℃干热处理24小时。结果表明,A组接受FⅧ的10名病人中有4名病人治疗前为抗HIV血清阳性,因此对6名接受A组平均输注41.3瓶 FⅧ的     

用1,10-二氮杂菲灭活病毒

<正>用大量混合人血浆制备血液制剂诸如凝血因子浓缩物可能含有诸如HBV、NANBHV或HIV等内源性病毒已被完全确认。因此,对血浆蛋白处理以便达到有效地灭活各类病毒,减少血液制剂传播疾病的危险是非常重要的。     

用单克隆抗体纯化血浆蛋白排除病毒污染物

<正>血友病A和B是威胁生命失调的遗传性疾病,它们分别由于血浆凝血因子Ⅷ和Ⅸ缺乏所致。用从人血浆中分离的这些组分浓缩物治疗对于患者的保护起着十分重要的作用。Pool等人的发现是一个重要的突破。即治疗制品可用冰冻血浆和收集沉淀物以及融化沉淀的上清液制备。由此方法制备的浓缩物是现时适用的许多治疗制品的基础。然而,自从1964年的这种发现,制品纯度的改善是迟缓的。     

生产无病毒危害的血液制品的战略

<正>分别使用FⅧ和FⅨ是治疗甲型和乙型血友病的标准疗法。但与输血浆组分物特别是输凝血因子浓缩物相关的一个不好解决的严重问题是;传播人类致病性病毒。该情况是由血友病人中诱发高感染率(50-90％)的AIDS病毒反映出来的。不仅AIDS能由输血液制品传播,血清性肝炎(乙肝)长期来一直被认为是与输血危险相关。自二十世纪七十年代初以来,还遇到一种新型的血清性肝炎一即所谓NANBH。后者只能用象转氨酶(ALT,AST)升高     

亮氨酸拉链提高小鼠血浆中剪接的凝血因子Ⅷ凝血活性

培养细胞实验表明,亮氨酸拉链通过改善内含肽(intein)的蛋白质剪接效率,提高双载体转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)基因细胞剪接FⅧ蛋白的分泌量和活性.本文从C57BL/6小鼠门静脉注射含亮氨酸拉链和Ssp DnaB内含肽融合的BDD-FⅧ的重链和轻链基因双表达载体,48 h后,检测到血浆的重链分泌量和FⅧ活性分别为(298±67)μg/L和(1.15±0.29)U/mL,明显高于不含亮氨酸拉链的双载体转BDD-FⅧ基因对照小鼠((179±59)μg/L和(0.58±0.19)U/mL).结果表明,亮氨酸拉链通过改善蛋白质反式剪接,提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因小鼠血浆的凝血活性,为进一步双腺相关病毒(AAV)载体转BDD-FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了依据.     

关于血液制品灭活试验的指示病毒及灭活指标问题的商榷

<正>一、血液制品灭活的重要性和必要性 由于血液制品在急救、治疗和防病中具有良好的效用,在临床上已受到十分广泛的大量应用。对于皿液制品的高质量要求,特别是保证使用安全已成为当前大家所关注的首要问题。 制备血液制品的原料是人的血浆,因而通过血液传播的病原体特别是某些病毒是导致不安全的主要因素。自七十年代以后,人们先后发现大批量制备的未经病毒灭活的凝血因子Ⅷ制剂,使甲型血友病患者大多数感染了乙型肝炎、丙型肝炎或AIDS病。     

人凝血因子Ⅷ遗传工程研究进展

早在一千七百多年前,人们就认识到甲型血友病是一种出血性絮乱。直到1937年才证实FⅧ在血友病发病中起关键作用。然而有关FⅧ的详细生化特征和结构特征在最近的10年才搞清楚。 治疗甲型血友病主要采取多次输入从人血浆中浓缩的FⅧ。虽然这种替代治疗能有效地控制阵发性出血,但还存在如下严重问题。首先,患者有感染病毒性疾病如病毒性肝炎和艾滋病的危险。通过增加灭活病毒步骤以及运用单克隆抗体进一步纯化FⅧ已显著降低了患者感染病毒的危险。然而这一制备FⅧ的过程却提高了成本,从而使治疗费用大为增加。其次,由于血浆FⅧ存在时间的限制,患者需要经常地预防性治疗。这种治疗法能导致关节慢性出血,组织损伤。此外,频繁地静脉输入FⅧ,还会引起诸如寻找外     

内含肽介导三段vWF基因真核细胞转移的翻译后连接及其功能性多聚体形成

vWF(von Willebrand factor)是一种超大分子质量的血浆多聚体糖蛋白,在血栓形成和生理凝血过程中发挥重要作用,其质和/或量的缺陷导致血管性血友病(VWD),由于VWD为单基因病,且vWF为分泌性蛋白,基于基因转移的基因治疗无需特异的靶器官,因此VWD特别适合于基因治疗,但vWF基因过大(8.4 kb),难以为多数病毒载体特别是优点较多的腺相关病毒(AAV)载体承载.运用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能,研究了三重载体真核细胞共转断裂3段的vWF基因,以期通过转基因翻译后的蛋白质剪接作用形成完整的功能性vWF蛋白.将vWF的cDNA于满足剪接所需的保守性氨基酸Cys1099、Ser2004的密码子前断裂为3段,分别与2种不同的内含肽即Ssp DnaE内含肽和Ssp DnaB内含肽编码序列融合,构建到真核表达载体pcDNA3.1(+),得到3个分别融合内含肽的vWF片段基因真核表达载体,共转染培养的293细胞,通过瞬时表达,电泳观察培养上清中的vWF多聚体形态,分析vWF蛋白量和凝血Ⅷ因子(FⅧ)结合力;通过共转FⅧ基因,分析了培养上清中的FⅧ蛋白量及生物活性.结果显示,通过内含肽的蛋白质反式剪接作用,共转内含肽融合的三片段vWF基因细胞上清,表现与正常人血浆和转vWF基因阳性对照细胞相似的vWF多聚体模式和FⅧ结合力,而且可明显提高转FⅧ基因后表达的FⅧ蛋白的分泌量和活性,提示剪接vWF蛋白的FⅧ载体功能的恢复.结果表明,内含肽可作为一种有效的技术手段进行三重载体共转断裂的vWF基因,为进一步基于内含肽的三重AAV转断裂vWF基因应用于VWD基因治疗研究、克服AAV的容量限制提供了依据.     

加入中和抗体灭活病毒

<正>众所周知,由于输注全血、血细胞制品和血浆衍生物有传染因子的潜在传播,甚至从输血实践开始至今一直如此。虽然有限的传播事件仍然存在,但细菌性因子的传播已得到控制。这是对病毒因子的明显对比,特别是当一种新的病毒因子如HIV突然出现在献血员的血液中。为了减少传染性献血的数量,对病毒标记的存在进行筛检,采用大量减少但不是消除的方法,对单一献血,细胞浓缩物及类     

D.血浆组分的检定要求

<正>1.引言 对于白蛋白,血浆蛋白组分,免疫球蛋白和凝血因子浓缩物的许多共同的要求,在3-11节中已予考虑。然而,为明确起见,将凝血因子浓缩物的一些特殊要求纳入各节是适宜的。 2.术语 粘制原液材料(BulK Purified materia)由合并原材料经分级分离制备的粉状或液体材料。     

冻干凝血因子的严格热处理

<正>尽管NANBH因子作为血浆制品的病毒污染因子已认识许久,但只是在识别了后才把注意力集中在灭活病毒所需的方法上。从那时起,在血浆成分中血传病毒的灭活就成了血液制品生产者的一个中心问题,并开始对各种理化灭活病毒的方法进行普遍评价。     

人凝血因子Ⅷ基因克隆可在哺乳动物细胞株中表达

最近,美国的Genentech与Genetics Institute的二组科学家同时成功地克隆了凝血因子Ⅷ∶C的DNA,并使其在哺乳类细胞株中表达产生有活性的因子Ⅷ∶C。他们根据已纯化的来源于猪或人因子Ⅷ∶C的一小片段氨基酸序列,合成出寡核苷酸探针,用此探针从基因库中找出了因子Ⅷ的基因,并已弄清楚这段基因总长为186000bp,共有长度为69～3106bp不等的26个外显子,整个基因约占X染色体的0.1%。他们分别利用人的T细胞杂交瘤株或人肝获得了cDNA克隆,并根据cDNA的序列分析推断出成熟蛋白的2332个氨基酸序列。结果显示,多肽链中有与凝血因子V结构同源的区域以及与血浆铜兰蛋白结     

凝血因子Ⅷ和Ⅸ浓缩物病毒安全性的临床评价

<正>尽管在挑选献血者和血液筛选方法上已有进步,但传染性病毒仍能由单个献血者的血制品和大量混合的血浆衍生物传播,实际上,用凝血因子浓缩物治疗血友病病人,血生传染是一个公认的替代治疗的合并症。由于认识了这种危险,特别是AIDS传播的出现,在最近15年里,血液制品生产者已改     

美公司申请重组凝血因子的临床试验

美国Genetics Institute公司和美国Baxter Healthcare公司5月3日向美国食品与药物管理局申请用基因重组生产的血液凝固第Ⅷ因子制剂的销售许可.商品名是"Recombinate",经审定后,就能用于A型血友病的治疗.申请重组凝固因子制剂商业化这还是第一次.在以供血者的血浆为原料的凝固因子制剂中最大的问题是病毒等的病原因子和在精制     

血浆蛋白质的分级

<正> Ⅰ序言 从马血清中分离白喉及破伤风抗体和制备人白蛋白作为有效的血浆扩张剂的需要,导致了血浆蛋白质分级方法的发展。近来,人抗体和血液凝固因子也已成为治疗上有兴趣的产品。 然而,今天进行血浆蛋白质的分级,并不仅仅是为了获得治疗用蛋白质。相反,它的目的有三个方面。除了临床制品之外,还必须制备纯蛋白质(抗原),以适用于生产血浆蛋白质的抗血清,供应诊断的需要。另外还必须提供纯蛋白质用于结构分析如氨基酸顺序和X-射线的研究。例如,Rerat等(1974)已研究制作出分群力为2.5A°的人血浆前白蛋白的四级结构模型(图1略-译者)。 用于临床的制品,其纯度标准不要求这样高,因为更重要的是宁可获得好的产量。这种制品必须保证无菌,并且最后产品必须无热原质。最近,B型肝炎问题已成为一个附加的困难。用于临床制品的方法必须符合许可的要求。     

蛋白质起始的DNA病毒复制机制

DNA聚合酶在DNA合成过程中需要的引物包括RNA引物、DNA自我引物和蛋白质引物3种类型。新DNA链(如冈崎片段)的复制多是在DNA模板上合成一段RNA引物,细小病毒利用其基因组末端的反向末端重复序列(ITRs)自我折叠成DNA引物,而一些DNA、RNA病毒及真菌质粒起始复制反应的引物则是蛋白质。以感染原核生物的噬菌体Phi29和真核DNA病毒腺病毒为例,从复制过程所涉及的蛋白质、对复制原点的识别、复制起始反应、新链的延伸、复制终止过程等方面详细阐述DNA病毒由蛋白质引发的复制机制,并对已商品化的Phi29 DNA聚合酶产品多重置换扩增及单细胞测序等的应用以及基于噬菌体Phi29蛋白质起始的最小复制系统体外扩增异源DNA等最新的应用研究作相关总结介绍。     

vWF-ΔPro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FVIII基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除．前肽缺失突变体vWF (vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白．为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合Ssp DnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性．结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21 ng/mL,活性为1.78±0.18 IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12 ng/mL和1.05±0.13 IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19 ng/mL和1.95±0.22 IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性．为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据．