谷氨酸棒状杆菌异源合成萜类化合物的研究进展

萜类化合物具有可观的商业价值,但生产过程复杂,产量低,利用微生物异源合成萜类化合物已成为热点。谷氨酸棒状杆菌内含合成萜类色素的途径,具有异源合成萜类化合物的天然优势和研究前景。首次对谷氨酸棒状杆菌合成萜类化合物进行了综述,从萜类合成途径、关键酶和全局调控机制三个方面进行了途经介绍。概述了谷氨酸棒状杆菌中单萜、倍半萜、四萜类化合物的异源合成,并对利用谷氨酸棒状杆菌高效合成萜类化合物所需解决的问题进行讨论,为谷氨酸棒状杆菌高效合成萜类化合物提供建议。     

茎瘤芥根际一株产紫色杆菌素杜擀氏菌的分离鉴定及其基因组分析

【目的】对茎瘤芥根际微生物进行分离鉴定,分析微生物菌群构成,选择具有优良特性的菌株,评估其次级代谢产物合成能力,为茎瘤芥根际微生物多样性和菌种资源的挖掘利用奠定基础。【方法】采集重庆市涪陵区二渡村和邓家村的茎瘤芥根,分离培养根际微生物菌株,通过菌株形态观察和看家基因的序列分析,对菌株进行初步鉴定、归类和保存。选择具有优良性状的菌株,利用Pacbio RS II和Illumina HiSeq平台完成全基因组测序,通过antiSMASH分析评估其次级代谢产物合成潜力,克隆目的基因簇并进行异源表达和产物鉴定。【结果】分离得到256株微生物,初步鉴定120株;从中鉴定了一株产紫色杆菌素的杜擀氏菌BjR8,完成了基因组测序及分析,发现该菌基因组为一条环状染色体,全长7 205 593 bp,GC含量为64.67%,含有6 241个编码基因。生物信息学分析发现基因组含有9个次级代谢产物生物合成基因簇,其中7个基因簇与已知化合物编码基因簇同源性较低,说明该菌具有产生多种新型次级代谢产物的潜力;克隆得到紫色杆菌素生物合成基因簇,并在变铅青链霉菌TK23中完成了异源表达。【结论】从茎瘤芥根际分离得到25...     

绿针假单胞菌GP72中aurI/aurR系统调控功能

【背景】绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis) GP72是一株可生产吩嗪类抗生素吩嗪-1-羧酸(PCA)和2-羟基吩嗪(2-OH-PHZ)的生防根际促生菌。基因组比对发现GP72菌中存在aurI/aurR双元调控系统。【目的】研究该系统对GP72中吩嗪类物质的调控作用。【方法】将aurI基因在大肠杆菌中异源表达,用紫色杆菌CV026和根癌农杆菌NTL4做显色实验。构建基因敲除菌株和回补菌株,发酵测量突变株的生长曲线与总吩嗪产量。构建转录融合质粒,测定吩嗪合成基因启动子的转录水平。【结果】显色实验显示,aurI能产生多种信号分子,使CV026显紫色、NTL4显蓝色。分别单独敲除aurI和aurR基因,同时敲除aurI/aurR基因,吩嗪产量均会升高,而回补菌株吩嗪产量降为野生型水平。β-半乳糖苷酶活性测定结果显示,突变株的酶活比野生型高。【结论】aurI/aurR负调控GP72的吩嗪合成,通过抑制吩嗪合成启动子的转录而影响吩嗪类物质的产量。     

谷氨酸棒杆菌耐受胁迫机制及工业鲁棒性合成生物学研究进展

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum作为一般被认为具有生物安全性的一种模式工业微生物,不仅在发酵工业中成功用于大规模生产氨基酸,而且具有合成多种新型化学品的潜力。谷氨酸棒杆菌菌株在生产化合物时,经常会受到各种逆境条件的胁迫,从而降低细胞活力和生产性能。合成生物学的发展为提高谷氨酸棒杆菌的鲁棒性提供了新的技术手段。本文总结了谷氨酸棒杆菌应对发酵过程中各种胁迫的耐受机制。同时,重点介绍提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性和耐受性的合成生物学新策略,包括挖掘新的抗逆元件、改造转录调控因子、利用适应性进化策略挖掘抗逆功能模块等。最后,从生物传感器、转录调控因子的筛选和设计、多种调控元件利用等方面对提高谷氨酸棒杆菌底盘细胞鲁棒性进行了展望。     

枯草芽孢杆菌在系统与合成生物技术中研究进展及工业应用

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是微生物生理生化机理研究的模式菌株,也是工业应用生产小分子化合物、大宗化学品、工业酶、药物及保健品等生物制剂的良好底盘细胞。近些年,研究枯草芽孢杆菌的合成生物技术和代谢工程方法日新月异,为利用其作为底盘细胞生产目标产品提供了良好的工具和理论参考。文中综述了利用枯草芽孢杆菌为细胞工厂,在代谢改造中通过调节全局调控因子,基因组精简及优化,多位点、多维调控,自身生物传感动态调控,膜蛋白工程等方法,系统调控优化菌株;在蛋白质试剂生产改造中,通过优化基因启动子、蛋白质信号肽、菌株自身蛋白质分泌元件,构建无化学诱导剂表达系统等方法,优化生产菌株。另外,文中对未来进一步针对优化枯草芽孢杆菌进行工业生产中需要注意和重点关注的问题、方向进行展望。     

代谢工程改造酿酒酵母合成肌醇

【目的】肌醇别名环己六醇,是一种具有生物活性的糖醇,在医药、食品和饲料等领域具有重要的应用价值。为获得生产肌醇的微生物细胞工厂,通过代谢工程改造,构建生产肌醇的酿酒酵母工程菌株。【方法】对酿酒酵母肌醇合成途径的正负调控同时改造,过表达肌醇-3-磷酸合成酶基因ino1,敲除肌醇生物合成的转录抑制子基因opi1和抗性基因kan MX,获得重组菌。利用气相色谱法检测重组菌发酵液中肌醇含量。【结果】构建了生物安全性的产肌醇基因工程菌株,摇瓶培养产量为1.021 g/L。【结论】通过过表达ino1和敲除opi1来改造酿酒酵母,能够有效提高重组菌的肌醇产量,为下一步的微生物发酵法产肌醇的工业应用奠定基础。     

酿酒酵母合成异源单萜类化合物的研究进展

单萜类化合物在食品、医药和工业等领域有重要的应用,具有可观的经济价值.随着合成生物学的日益发展,利用微生物作为细胞工厂合成单萜类化合物成为时下的研究热点.酿酒酵母是真核生物表达的模式菌株,其甲羟戊酸途径为单萜类化合物的合成提供直接前体,因此在酿酒酵母中构建异源单萜类化合物合成途径有较大优势.本文介绍了酿酒酵母细胞中异源单萜类化合物合成途径的构建.从甲羟戊酸途径代谢通量调控机制和融合酶调控酶催化反应效率两方面概述了酿酒酵母异源合成单萜类化合物的研究进展.     

透明质酸生物合成途径及基因工程研究进展

透明质酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的双糖单位聚合而成的直链酸性黏多糖,已被广泛应用于药物、化妆品和食品添加剂。微生物发酵法是目前生产透明质酸最有效的方法。生物体内透明质酸的合成途径基本一致,均为Leloir途径。透明质酸合成操纵子由透明质酸合酶基因、尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因和尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因组成,其表达受Cov S/CovR和Lux S等多种调控系统调控。随着分子生物学技术的迅速发展以及对透明质酸合成相关基因了解的不断深入,人们从提高透明质酸安全性、提高透明质酸产量和调控透明质酸分子质量三个方面出发,通过基因工程手段构建出了高产、安全、一定分子质量范围的透明质酸生产菌株。就有关透明质酸生物合成途径、合成相关基因表达调控及生产菌株分子生物学改造的策略与研究进展进行综述和展望。     

L-精氨酸生物合成机制及其代谢工程育种研究进展

L-精氨酸是人体半必需的氨基酸,在生命代谢过程中起着非常重要的作用,且具有广泛的应用价值及市场需求。目前,L-精氨酸主要采用微生物发酵法进行生产,为了提高L-精氨酸的产量和稳定性,最有效的方法是优化L-精氨酸生产菌株,通过代谢工程改造微生物菌株有望达到这一目的。本文分析了微生物中L-精氨酸的代谢途径和调控机制,并综述了构建高产L-精氨酸的代谢工程策略。此外,展望了菌株稳定性和底物扩展利用的未来研究方向。     

D-核糖生产菌的原生质体诱变及其发酵培养

目的:筛选出莽草酸、转酮醇酶双重营养缺陷型的D-核糖生产菌枯草芽胞杆菌,以提高D-核糖的产量。方法:采用化学诱变剂乙基磺酸甲烷(EMS)对野生型D-核糖生产菌的原生质体进行诱变,并从D-核糖合成途径对发酵培养基进行优化设计。结果:摇瓶发酵D-核糖平均产量为52.2g/L;获得的B.sems-10菌株具有良好的遗传稳定性,D-核糖产量高达67.5g/L。结论:通过对D-核糖生产菌原生质体的EMS诱变,筛选出了高产、遗传性状稳定的营养缺陷型B.sems-10菌株,为进一步提高产量奠定了基础。     

海洋弧菌(Vibrio sp.)LA-05发酵液粗提物的群体感应抑制活性及其发酵条件优化

【背景】海洋微生物代谢产物被认为是发掘新型天然活性物质的潜在来源,其中不可避免地包含新型群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitors, QSIs)。响应面法是运用多元二次回归模型拟合各因素和响应值之间的函数关系,对各因素及其交互作用进行评价,可有效地从影响代谢产物发酵条件的各因素中预测出最佳条件。【目的】以紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12472^T为指示菌株,研究海洋弧菌(Vibrio sp.)LA-05发酵液粗提物的群体感应抑制活性。在单因素试验基础上,应用响应面法对菌株发酵条件进行优化,以提高其发酵代谢产物中活性物质的产量。【方法】使用琼脂平板扩散法进行初筛后,通过分析发酵液粗提物对紫色杆菌生长曲线及紫色素产量的影响研究其群体感应抑制活性。在单因素试验基础上,采用Box-Behnken设计原则,以紫色素抑制率为响应值,通过响应面试验优化菌株发酵条件,从而提高其发酵液中活性物质的产量。【结果】在基本不影响紫色杆菌正常生长的浓度范围内,粗提物可不同程度地抑制紫色素的产生。模型预测结果表明,最优发酵条件...     

解淀粉芽孢杆菌高效合成胞苷的代谢调控机制及育种策略

胞苷是合成抗病毒、抗肿瘤药物的良好中间体,也是核苷酸类保健食品和功能性食品的重要原料。主要论述了解淀粉芽孢杆菌高效合成胞苷的代谢调控机制和构建胞苷高产菌株的育种策略。重点阐述了通过提高解淀粉芽孢杆菌嘧啶操纵子转录水平,增强胞苷合成代谢途径、阻断胞苷降解途径、增大磷酸戊糖途径向胞苷合成途径的分流量、提高胞苷合成前端代谢物PRPP的合成量、增强中心碳代谢流向胞苷合成途径、减少旁路代谢途径及促进胞苷的分泌等方法,选育出胞苷高产菌株,不仅为胞苷高产菌株的选育提供参考,也为解决目前胞苷工业化生产中存在的问题提供思路。     

粘质沙雷氏菌中灵杆菌素合成因素探究进展

灵杆菌素主要由粘质沙雷氏菌产生,其本身是微生物的一种次生代谢产物,属于脂多糖,也是一种典型的生物碱,具有抗癌、抑菌、增强免疫力、抗原虫、抗疟疾等多种生理活性,是化妆品、染料和水体污染治理等领域新兴且不可或缺的成分.随着医药业和工农业等不断发展,灵杆菌素的应用也越来越多,其良好的应用前景使得它的合成和提取工艺成为次生代谢领域的研究热点.但是,目前灵杆菌素的全化学合成和发酵生产受到很多因素的影响,大大阻碍了它的规模化生产和应用,本文重点对影响灵杆菌素生物合成的因素进行了综述,同时对其可能的作用机制进行了总结.本研究表明,微生物发酵生产灵杆菌素时,菌种、营养条件、环境因素(包括培养温度,pH值,溶解氧,光照)、金属离子等因素对灵杆菌素的合成都十分重要,另外再结合基因工程等技术,可大幅度提高灵杆菌素的产量.本综述为灵杆菌素的工业发酵生产提供重要依据.     

高产表面活性素的重组枯草芽孢杆菌构建及培养优化

表面活性素是一种新型生物表面活性剂,因其具有良好的表面活性、可生物降解及抗菌活性,在石油开采、医药、农业和食品化妆品等领域具有广阔的应用前景。高产表面活性素菌株的获得和发酵过程优化是其商业化生产的关键。文中考察了脂肪酸合成途径对表面活性素合成的影响,强化脂肪酸生物合成关键基因以及该途径全部基因分别构建了高产表面活性素枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis THBS-2和THBS-8,并对发酵过程中氨基酸种类及添加量、诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 添加时间和添加量等条件对产物合成的影响进行考察,获得优化的两阶段前体添加方案：发酵3 h,加入IPTG和L-亮氨酸,使其终浓度分别为1.25 mmol/L、5 g/L;发酵24 h,添加L-亮氨酸 (终浓度5 g/L) 和浓缩培养基5 mL。优化条件下,枯草芽孢杆菌THBS-2摇瓶发酵48 h,表面活性素产量高达24 g/L;30 L发酵罐中发酵68 h,产物产量最高达到34 g/L。研究结果为表面活性素的工业化生产及应用奠定基础。     

微生物CoQ合成途径及CoQ10生产菌株的分子生物学改造

CoQ10具有呼吸链电子传递者、抗氧化性、调控基因表达等多种生理生化功能,目前不仅用作药物也用作食品添加剂。微生物发酵法是目前生产CoQ10最有效的方法。本文就有关微生物CoQ合成途径及基于CoQ合成途径的CoQ10生产菌株分子生物学改造的策略与研究进展进行了综述和展望。     

吡咯喹啉醌研究进展

吡咯喹啉醌（PQQ）是继烟酰胺和黄素核苷酸之后发现的氧化还原酶的第3种辅酶,具有多种生理功能,在食品、医药及农业等行业有广泛的应用前景。我们简要综述了PQQ参与醌酶电子传递、增强微生物对极端环境的适应能力、促进植物生长、刺激神经生长因子生成等生物学功能及相关作用机制,介绍了PQQ生产菌、PQQ合成基因及PQQ生物合成的调控等方面的研究进展。     

吡咯喹啉醌合成及生产工艺研究进展

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone, PQQ)是继烟酰胺和核黄素之后发现的第三类氧化还原酶辅因子,普遍存在于生物体中参与呼吸链电子传递,具有促进线粒体产生、清除自由基、增强细胞代谢和预防心肌损伤等生理功能,在医药、食品和农业领域具有广泛的应用前景。微生物发酵法是PQQ生产的主要方式,解析PQQ生物合成途径及其调控机制,通过代谢工程选育短周期、高产量的生产菌是PQQ工业化的研究方向之一。本文综述了PQQ的合成途径、高产菌株选育以及微生物发酵生产与分离纯化的研发工作,为深入阐释PQQ的生物合成机制和工业化生产菌株的选育提供参考。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

具有群体感应抑制效果芽孢杆菌的筛选与鉴定

细菌性疾病是危害水产业健康发展的主要原因之一,从抑制调控致病菌毒力表达的群体感应（Quorum sensing,QS）入手是水产动物疾病防治研究新的热点方向。研究以紫色杆菌 （Chromobacterium violaceum）为报告菌株,采用T型划线和滤纸片法,对分离自异育银鲫肠道及实验室保存的芽孢杆菌F3-1、F3-2、F6-4、F6-5、X77、X93、X3914进行分析测测试,筛选具有群体感应抑制效果的菌株。T型划线结果显示菌株F3-1能够抑制紫色杆菌紫色菌素的产生;滤纸片法结果显示抑制紫色杆菌紫色菌素产生的主要物质存在于菌株F3-1的胞外产物中。试验提取了菌株F3-1的培养物的粗提物,测定粗提物浓度分别在0、50、100、200、300 mg/L时紫色杆菌菌素在585 nm处的光密度值,结果显示随着粗提物浓度的增加其色素的产量显著降低（P0.05）,当粗提物浓度超过200 mg/L时,试管中观察不到紫色菌素存在;利用硫酸铵盐析的方法,提取了菌株F3-1的粗提物中蛋白产物,滤纸片扩散法结果显示表明其胞外蛋白是紫色杆菌QS系统的抑制物质。通过分子生物学16S rDNA鉴定,确定菌株F3-1为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus,GenBank accession No. JX984444）。电镜照片显示该菌具有短杆状特征,因此,分离自异育银鲫肠道的短小芽孢杆菌F3-1具有抑制细菌群体感应的作用。       

天冬氨酸家族主要氨基酸高产菌株的选育策略

L-苏氨酸与L-赖氨酸是L-天冬氨酸家族氨基酸(AFAAs)中的重要成员,近年来由于其在食品、化妆品、动物饲料添加剂等方面的广泛应用而备受关注,市场需求逐年上升。运用代谢工程手段构建高产菌,可有效地提高L-苏氨酸和L-赖氨酸的生产水平。本文详述了L-苏氨酸与L-赖氨酸的合成途径、调控机制以及两种氨基酸高产菌株的构建策略。