北京地区14份柳枝稷生物量及分配差异研究

采用14份柳枝稷开展盆栽试验,研究了在北京地区条件下其生物量差异及分配规律。结果表明,低地型柳枝稷Kanlow生物量最高,其茎秆、地上部和整株生物量分别达到175.48 g/株、299.18 g/株和447.66 g/株,而高地型柳枝稷Nebraska生物量最低,其茎秆、地上部和整株生物量分别为29.86 g/株、58.08 g/株和140.51 g/株。就柳枝稷整株植株而言,Kanlow地上部生物量分配比例最高,达到63.13%,S2最低,为40.55%,Kanlow地上部营养器官生物量分配比例最高,达到48.67%,Nebraska最低,为31.88%。就柳枝稷地上部而言,Alamo、Kanlow和Trailblazer茎秆生物量分配比例及茎叶比均较高,分别为35.91%和2.75,37.09%和2.56,34.39%和2.48。起源纬度显著影响了柳枝稷的生物量及其分配,就柳枝稷整株植株而言,起源纬度与柳枝稷生物量显著负相关,与地下部生物量分配比例显著正相关,与地上部、种子和茎生物量分配比例显著负相关。就柳枝稷地上部而言,起源纬度与茎生物量分配比例及茎叶比显著负相关,与叶和鞘生物量分配比例显著正相关。生物量的差异及其分配规律反映出柳枝稷对生态环境长期适应的生殖与生长策略。本研究为柳枝稷遗传资源引种和品种选育提供了依据。     

利用CRISPR/Cas9技术创制高油酸甘蓝型油菜新种质

在低硫苷低芥酸的双低甘蓝型油菜基础上,培育稳定的高油酸油菜是当前重要的育种目标之一,本研究通过利用CRISPR/Cas9基因编辑对湖南农业大学选育的品种湘油15号(XY15)进行品种改良。BnaFAD2和BnaFAE1是油酸合成不饱和脂肪酸和超长链脂肪酸的两个关键基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑系统与高效油菜转化技术相结合,对甘蓝型油菜XY15的BnaFAD2.A05、BnaFAD2.C05、BnaFAE1.A08和BnaFAE1.C03同时进行基因编辑,获得了7株T0代转基因植株,通过靶基因克隆测序,发现均未发生基因编辑。然而,在T1代植株中发现并检测到了基因编辑的发生,BnaFAD2.A05、BnaFAD2.C05、BnaFAE1.A08和BnaFAE1.C03的总基因编辑效率分别为38.89%、27.78%、22.22%、30.56%。在T2代植株中,筛选到了5株4个靶基因均发生了突变,且无外源基因的突变体材料Cas9-1-12-4、Cas9-1-12-5、Cas9-2-7-11、Cas9-5-5-3、Cas9-6-6-1,它们的相对油酸含量为68.69%、80.16%、75.82%、75.97%、74.37%,相比于野生型XY15(相对油酸含量为62.04%)均有显著提高。     

青贮对柳枝稷制取燃料乙醇转化过程的影响

青贮是一种传统的生物质原料保存方法,广泛应用于纤维素乙醇炼制领域尚需要考察其对原料品质和下游乙醇转化过程的影响。文中以秋季(初、中和末)收割的柳枝稷为原料,通过青贮、高温水热(LHW)预处理、纤维素酶水解和同步糖化与发酵(SSF)实验对上述问题予以回答。结果显示,秋季初收割的柳枝稷以不同湿度青贮后pH均小于4.0,干重损失小于2%,各主要成分与青贮前相比无明显变化;LHW预处理中青贮样品半纤维素水解率普遍高于未贮存样品,但青贮同样使原料获得了更高的发酵抑制物产生水平;青贮柳枝稷葡萄糖、木糖和半乳糖产量(预处理+酶水解)高于未贮存柳枝稷;经过168 h的SSF,青贮样品乙醇浓度为12.1 g/L,未贮存的秋季初、秋季中和秋季末柳枝稷为底物的浓度分别为10.3 g/L、9.7 g/L和10.6 g/L。综上,青贮有助于提高柳枝稷LHW预处理效率、酶水解率和乙醇产量。     

混播下柳枝稷叶绿素荧光参数及对水氮条件的响应特征

采用盆栽试验,按照白羊草(Bothriochloa ischaemum)与柳枝稷(Panicum virgatum)株数比设置5个混播比例(0∶8、2∶6、4∶4、6∶2、8∶0),在两种氮肥处理(不施氮和0.1g N·kg-1)下,测定分析柳枝稷叶绿素荧光参数对土壤水分短期自然干旱并复水[土壤含水量从80%FC(田间持水量为20%)逐渐降至20%FC后再复水至80%FC]的响应,以期揭示不同水氮及混播比例下柳枝稷与白羊草竞争关系的生理生态机制。结果显示:(1)随干旱胁迫加剧,柳枝稷最大光化学效率(Fv/Fm)、光化学猝灭(qP)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)和表观光合量子传递速率(ETR)逐渐下降,复水后第2天各指标均可恢复到对照水平;(2)两氮肥处理下,单播柳枝稷的ETR显著高于混播,施氮处理下单播的qP显著高于混播,但非光化学猝灭系数(NPQ)相反(P0.05),且柳枝稷比例越小各指标降幅越大,表明混播后柳枝稷PSⅡ反应中心活性下降,显示出其对混播竞争的适应;(3)施氮显著提高了柳枝稷的ΦPSⅡ(13.64%~23.53%)和qP(6.12%~11.11%),降低了NPQ值(9.76%~12.82%)(P0.05),表明施氮可提高其光能利用能力,增强其与白羊草的竞争力。研究认为,不同水氮条件下,柳枝稷表现出较强的混播竞争适应性,施氮会提高其对白羊草的生态竞争能力。     

利用SCoT分析柳枝稷遗传资源的多样性

本研究利用SCoT标记对96份柳枝稷种质的亲缘关系和遗传变异进行了研究。筛选出20条引物对96份供试材料进行PCR扩增,共获得445条带,其中多态性条带402条,平均多态性条带比率(PPB)达90.31%,多态性信息含量(PIC)为0.166~0.410,平均值为0.332,标记指数(MI)为10.20。遗传相似系数(GS)为0.498~0.912,平均值为0.688。表明SCoT标记能够揭示柳枝稷种质间的遗传变异。通过UPGMA分析表明,96份种质资源聚为高地型和低地型两大类。经POPGENE1.32软件分析结果显示:96份柳枝稷基因多样性指数(H)为0.285,Shannon指数(I)为0.431,表明供试的种质间遗传多样性丰富,遗传多样性水平高。经AMOVA 1.55方差分析揭示:96份柳枝稷生态型内的遗传变异占总变异的72.85%,生态型间遗传变异占总变异的27.15%,结果表明ScoT可用于柳枝稷遗传多样性研究,该研究结果可为柳枝稷种质资源的进一步开发利用提供重要信息。     

导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β-1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。     

Purdue开展谷物基因研究促进生物燃料发展

Purdue大学的2位研究人员Nick Carpita和Maureen McCann指出,鉴别与植物细胞壁生长有关的基因并研究其功能,有助于开发新的、更高产的交通运输生物燃料。他们研究包括谷物在内的草类细胞壁的构成,目的是发掘更多的富含糖类并可高效转化为生物燃料的生物质。此外,研究小组还将分析玉米和柳枝稷基因。大部分植物只运用它们基因组中的10％左右进行细胞壁构建,     

大豆转录因子GmC2H2基因转化拟南芥效果分析

GmC2H2转录因子基因是本实验室获得的一个编码172个氨基酸携带516bp核苷酸的转录因子,属于经典C2H2型锌指蛋白.通过构建植物表达载体GmC2H2-pCAMBIA1304,借助优化的Floral-dip法转化模式植物拟南芥,经潮霉素Hygromycine( 45-50 mg/L)抗性筛选获得转基因拟南芥植株.GUS组织染色分析表明,GmC2H2基因在生长12d的转基因拟南芥幼苗中,表达部位主要集中在根部.对转基因拟南芥进行了低温(1℃)和脱落酸(200 μmol/L)胁迫处理,测定其生理生化指标,通过real-time qPCR确定目的基因在转基因拟南芥中的表达情况.结果表明,携带GmC2H2目的基因的转基因拟南芥中脯氨酸和可溶性糖水平要高于野生型植株,而丙二醛水平要低于野生型,在抗逆性方面明显优于野生型拟南芥植株;并且胁迫处理下的转基因拟南芥中GmC2H2基因的表达量要高于未胁迫处理的转基因植株,说明GmC2H2基因的表达受低温和ABA的诱导,初步明确了该转录因子基因的功能.     

基于CRISPR/Cas9技术的大白菜内源硫化氢生成酶LCD基因突变体构建

硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是植物细胞内源信号分子,对植物的生长、发育和抗逆性具有重要的调节作用。L-半胱氨酸脱巯基酶(L-cysteine desulfydrase, LCD)是合成内源H2S的关键酶。大白菜(Brassica campestris)是我国北方主要的蔬菜。为研究H2S信号在大白菜中的生理作用,并为育种工作提供新材料,该研究采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对白菜LCD基因进行了敲除。利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化法将基因编辑载体pYAO-LCD成功转化大白菜"中白60",获得基因编辑的遗传转化植株4株。DNA测序表明,基因编辑后植株在靶标位点的碱基发生了相应的基因编辑。基因编辑植株中内源H2S含量有不同程度的降低。     

不同盐胁迫对柳枝稷生物量、品质和光合生理的影响

为明确不同盐胁迫对柳枝稷生物量、品质及光合生理的影响,以无盐胁迫作为对照(CK),选取0.40%Na Cl、0.80%Na2SO4和0.80%Na HCO3进行了土柱试验。结果表明:(1)与CK相比,Na Cl、Na2SO4、Na HCO3胁迫下柳枝稷地上生物量、地下生物量、总生物量、籽粒产量及根冠比均显著降低(P0.05),总生物量分别降低49.39%、60.52%、76.45%,Na HCO3对柳枝稷的生长抑制作用最强,Na Cl最弱;(2)Na Cl胁迫下柳枝稷地上生物质灰分含量显著增高14.89%,Na2SO4胁迫下硫(S)含量显著增高262.32%,纤维素含量显著降低13.71%,Na HCO3胁迫下钾(K)含量显著增高54.95%,半纤维素含量显著增高10.87%,灰分和S含量的增高不利于柳枝稷地上生物质的燃烧利用,纤维素含量的降低和半纤维素含量的增高不利于其转化利用;(3)Na Cl、Na2SO4、Na HCO3胁迫下柳枝稷叶片净光合速率(Pn)分别显著降低21.89%、29.54%和24.59%,气孔限制因素可能是其光合作用受到抑制、生物量下降的关键因素。     

AtNHX5基因过量表达对拟南芥耐盐性的影响

为了研究AtNHX5基因在植物耐盐中的作用,构建了植物过量表达载体pROKⅡ-AtNHX5,并转化拟南芥。结果显示:(1)RT-PCR检测表明,转基因拟南芥中AtNHX5基因的表达大幅提高。(2)对转基因纯合株系进行耐盐性分析显示,AtNHX5过量表达提高了植株在种子萌发和苗期的耐盐性。(3)转基因植株在盐处理下的干重、鲜重以及地上部分Na+、K+含量均高于野生型对照。在200mmol/L NaCl处理下,以转基因株系a1-4为例,其地上部分单株鲜重、单株干重、K+含量分别是野生型的1.27、1.54、1.16倍,较野生型显著升高。研究表明,过量表达AtNHX5基因促进了盐胁迫下转基因植株对K+的吸收,转基因拟南芥的耐盐性明显提高。     

胡杨转基因体系的建立

胡杨(Populus euphratica)是唯一能在沙漠里生长的高大乔木树种, 建立其转基因体系可为胡杨抗逆分子机制与应用技术研究提供基本方法。通过研究农杆菌介导的胡杨转GUS基因的技术体系得出以下结论: (1) 胡杨再生植株体系, 叶片在附加1.0 mmol.L^-1 6-BA和5.0 mmol.L^-1 NAA的1/2MS培养基上不定芽诱导率较高; (2) 转基因体系, 胡杨叶片在含100 mmol.L^-1 乙酰丁香酮的OD600值为0.4-0.6的根癌农杆菌菌液中浸染15分钟, 共培养2天, GUS基因转化效率较高; (3) 转基因植株抗生素筛选, 转GUS基因胡杨叶片用300 mg.L^-1头孢霉素抑制农杆菌生长, 在含9 mg.L^-1 G418的培养基上诱导不定芽以获得转基因的抗性植株。     

水培条件下pH值对柳枝稷幼苗生长发育的影响

土壤的p H值是限制植物生长发育的一个关键因素。柳枝稷是一种可作为牧草,水土保持的多年生C4能源植物。试验在水培条件下,利用裂区试验设计,以柳枝稷品种(系)为主区,水培液p H值为副区,对反映柳枝稷幼苗生长发育状况的指标进行统计分析。结果显示,随水培液p H值的酸碱强度增大,柳枝稷不同品种(系)幼苗的分蘖数、株高、苗鲜重、根冠比、根系活力以及净光合速率都极显著降低(P0.01),而幼苗保护酶活性以及丙二醛(MDA)含量则极显著升高(P0.01)。尤其是当PH值低于5.0时,幼苗的受到的胁迫更为明显,幼苗超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性反而急剧下降。与酸胁迫(p H值7.0)相比,柳枝稷对碱胁迫(p H值7.0)的适应能力更强,其中以西稷2号的抗逆性表现最好。因此应用柳枝稷在边际土壤地区推广种植时,要尽量避免强酸性土壤(p H值5.0),且选用西稷2号品系较为适宜。     

植物多基因干扰载体体系构建与效用分析

多数重要的功能基因属于多基因家族,这些家族成员间存在功能冗余,高效的多基因干扰体系对研究多基因家族成员的生物学功能及其分子调控机制具有重要意义。对pCAMBIA1301载体改造,构建了适用于植物的多基因干扰体系pCAMBIA1301m和pCAMBIA1301s。使用该多基因干扰体系构建了四基因的干扰载体pCAMBIA1301m：35S∷SlPP2C1-2-3-4,4个目标基因为来源于番茄PP2C家族A组的PP2C1、PP2C2、PP2C3和PP2C4,并通过遗传转化导入番茄,用GUS染色和PCR检测转基因阳性植株,再利用RT-qPCR技术检测T₁和T₂代转基因植株中目标基因的干扰效率,用T₂代种子分析转基因番茄对ABA敏感性。结果表明,应用该干扰体系成功获得了四基因干扰的转基因植株35S∷SlPP2C1-2-3-4。在转基因番茄中4个目标基因的表达量显著低于野生型,其干扰效率均高于70%,转基因番茄种子萌发具有强烈的ABA不敏感性。多基因干扰体系能高效地同时沉默多个目标基因。     

拟南芥AtTIP5;1基因转化非洲紫罗兰的研究

为研究AtTIP5;1基因的功能,以非洲紫罗兰叶片为受体材料,进行AtTIP5;1基因遗传转化条件的研究,并对转基因植株在高浓度硼酸胁迫下的表现进行分析,以明确利用AtTIP5;1基因提高非洲紫罗兰抗逆性的可行性。结果表明:(1)以非洲紫罗兰叶片为受体的最适转化条件为:叶片预培养2d,农杆菌共培养2d,共培养时添加100μmol/L乙酰丁香酮;最适潮霉素筛选浓度为40mg/L。(2)转化植株经PCR和RT-PCR检测显示,AtTIP5;1基因成功转入了非洲紫罗兰,获得了17个稳定的转基因植株。(3)对转基因植株和对照植株进行3mmol/L硼酸胁迫处理结果表明,AtTIP5;1基因表达受高浓度硼酸诱导,且AtTIP5;1基因表达可以减缓植株受高浓度硼酸胁迫导致的组织褐化、叶片卷曲变形症状;转AtTIP5;1基因植株干物质率、可溶性糖、可溶性蛋白质含量下降,而POD、SOD活性上升,证明转AtTIP5;1基因的非洲紫罗兰植株提高了对高浓度硼酸的耐受能力。研究结果为深入探讨AtTIP5;1基因的功能以及非洲紫罗兰基因工程育种奠定了基础。     

同步抑制FAD2与FatB基因提高烟草种子油酸组分含量的研究

该研究以烟草品系NC89的无菌苗叶片为受体材料,采用前期构建的能同步抑制种子中FAD2(Δ12-油酸去饱和酶基因)与FatB(酰基转移酶基因)表达的RNAi载体,通过农杆菌介导转化获得了转基因烟草植株,分析转基因植株种子中的脂肪酸组分。结果显示:与对照相比,转基因植株种子中FAD2和FatB基因的表达水平分别降低了23%和11%;转基因植株种子的脂肪酸组分中,饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸平均含量分别为8.02%和4.45%,多不饱和脂肪酸亚油酸平均含量为76.82%,较对照分别降低了2.91%、9.92%和3.47%;而转基因植株种子中单不饱和脂肪酸油酸含量高达7.48%,比对照提高46.38%。研究表明,同步抑制FAD2和FatB基因的表达能够显著提高烟草种子中油酸组分的含量,为进一步改良油料作物品质奠定了基础。     

甘蓝型油菜PEP基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建及转基因油菜的获得

丙酮酸羧化酶(PEP)是控制油菜蛋白质/油脂含量比例的一个种子的含油量.本研究利用PCR法从甘蓝型油菜花油5号(H045)克隆了PEP基因片段,并与载体pBI121-B构建了反义PEP基因的种子特异性植物表达载体,通过激光微束穿刺法将其转化到甘蓝型油菜中,目前已获得了转基因植株.     

农杆菌介导SsNHX基因转化中林美荷杨的研究

方法:以中林美荷杨组培苗的茎段为转化受体,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将盐地碱蓬(Suaedaheteroptera)的Na /H 反向运输体基因SsNHX导入中林美荷杨组培苗中,实验过程中对影响遗传转化的一些关键因素进行了筛选研究。结果:最佳浸染条件为茎段外植体预培养1d,菌液浓度OD6000.3,浸染时间15-30min,共培养时添加AS 200μmol/L。经过抗性植株的PCR检测证明外源基因SsNHX已整合到中林美荷杨基因组中,获得了抗卡那霉素的再生植株及PCR阳性植株。结论:初步建立了中林美荷杨的遗传转化体系,为其遗传转化培育出抗盐碱的转基因植株奠定了理论基础。     

转双价抗虫基因大白菜新种质的获得及其抗虫性分析

采用超声波辅助花粉介导方法,将双价抗虫基因BmkIT-Chitinase导入早熟型大白菜自交系20-19-3,最终获得了5个转基因大白菜优良自交系纯合株系Z1-5、Z2-7、Z9-6、Z11-6和Z20-13;以转基因大白菜株系和非转基因对照植株为材料,对BmkIT-Chitinase基因在大白菜中的遗传规律、基因表达及抗虫性进行进一步分析。结果显示:(1)转化株后代多代(T_1~T_4)PCR、Southern blotting等分子跟踪检测表明,目的基因已成功导入受体植株,且能够稳定遗传;用该转基因方法对大白菜进行基因转化所获得的转基因植株分析显示,外源基因多数以多拷贝形式整合于核基因组,少部分外源基因以单拷贝形式整合。(2)Elisa分析结果证明,所导入的外源基因可高效表达,T4代株系新鲜叶片中表达产物量最高达到0.069μg·g~(-1)左右。(3)转基因株系田间抗虫性统计分析表明,转化株系与对照在抗虫性方面有显著差异,其对小菜蛾及菜青虫抗性普遍提高2~3级。研究认为,转BmkIT-Chitinase基因大白菜中BmkIT-Chitinase基因的表达可有效提高大白菜的抗虫性。     

cryIAc基因在转基因玉米中的遗传规律及对抗虫性影响

旨在研究目的基因在转基因植株和后代植株(株系)中的遗传规律及其对转化植株抗虫性的影响。以花粉介导法将cryIAc基因导入玉米自交系‘郑58’和‘昌7-2’,对转化植株及其后代株系进行分子检测和田间抗虫鉴定。结果表明:(1)转化‘郑58’和‘昌7-2’,T1代分别获得转基因植株24和41个,转化率高达20%以上;(2)转基因T2代、杂交F2代及回交1代(B1)的分子检测结果证明,外源基因的遗传符合孟德尔的3∶1、3∶1和1∶1的遗传分离规律;(3)连续多带的分子检测结果还表明,外源基因可稳定遗传并有效表达,表达水平在9.8-14.3 ng/g叶片鲜重之间;(4)抗虫鉴定结果显示,在阴性对照全部感虫情形下,转基因纯合株系仍表现出较高抗虫活性;(5)此外,回交试验结果还证明外源基因通过杂交可传递给下一代;(6)最终经筛选得到SZ003、SZ005、SC001、SC004和SC007五个高抗虫转基因株系。结果表明,花粉介导法是一种高效、快捷的转化方法,cryIAc基因导入玉米自交系植株后赋予和提高了转基因植株的抗虫活性。