辅酶A的固定化

在酶的结构与功能的研究中,辅酶占据着重要地位。固定化酶技术的发展促使人们对辅酶的固定化进行研究。辅酶A(CoA)是一种重要的生物活性小分子,它参与了大约80种酶的催化反应。将CoA固定化并对其性质进行研究,有助于阐明需CoA的酶的生物功能及微环境对它们的影响。固定化CoA还可以用来分离纯化CoA结合蛋白,并进一步以固定化CoA结合蛋白分离纯化CoA。本文报道我们用对氨基苯(?)乙基交联琼脂(ABSE-交联琼脂)固定化CoA时各种条件的选择。     

力复霉素前体甲基丙二酰CoA合成途径的研究

力复霉素合成的碳前体之一(2R)—甲基丙二酰CoA至少可以有三条酶学合成途径。三条途径中的关键酶分别为甲基丙二酰CoA转羧基酶、丙二酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶和甲基丙二酰CoA消旋酶。通过比较各个酶活性的时间进程和力复霉素合成时间的相关性,以及各个酶的底物亲合力,对它们在地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsis mediterranei)甲基丙二酰CoA合成中的贡献作了排序,发现甲基丙二酰CoA变位酶途径是主要负责酶系。但是各个途径的贡献排序并不是固定不变的,能受到环境因素的调控,丙酸盐的加入将抑制甲基丙二酰CoA变位酶活力,而使得甲基丙二酰CoA转羧基酶成为主要酶系。甲基丙二酰CoA合成途径的多样性有助于细胞对环境变化的灵活反应。此外,对各个酶的调控特性也进行了研究。     

采用产氨短杆菌合成辅酶A的研究

用产氨短杆菌鲜菌体在以腺嘌岭代替ATP的反应系统中酶促合成辅酶A(CoA),每毫升反应液的CoA产量达Z21单位(u);在不加任何核苷酸类物质的条件下,也可达185u;合成在5小时左右达高峰。CoA合成主要在细胞内进行。提出了连续式碳一阴离子交换树脂柱提纯CoA的新方法,既提高了收率,又避免了原锌汞齐法的毒物危害,方法简易可行。用本法制得的结晶品含CoA 231u／mg,收率17．0％;阴柱洗脱液不经结晶直接制成CoA注射液,提取率20．9％,经广州药检所检验,各项指标均符合国家标准。     

脑特异脂肪酸活化酶的克隆

东北大学基因实验室助教授山本德男小组克隆了特异存在于小鼠脑内、控制脂肪酸代谢和脂质生物合成的脂肪酸活化酶的cDNA.大脑干重的48%以上由脂质构成,是弄清脑脂质合成和代谢的最关键的物质. 脂肪酸活化酶(酰基CoA合成酶)是由脂肪酸和ATP、辅酶A(CoA)合成脂肪酸CoA的酶.脂肪酸被活化,转化成脂肪酸CoA之后,才能作为脂肪酸β氧化反应的能量以及乙酰基CoA的合成反应和中性脂肪、磷脂质、胆固醇酯等合成脂质的底物.由此看来,脂肪酸活化酶是一种重要的特异性酶.     

乙基丙二酸尿——氨基酸先天性代谢缺陷之十二

<正> 1977年由Tanako第1次报导了本症,患者系一名4岁的女孩,她出现低血糖和高氨血以及由此导致的发作性昏迷。尿中发现代谢物,如2-乙基丙二酸,己二酸和N-己酰甘氨酸,本症主要是由于多种酰基CoA脱氢酶的活性缺陷,并已在丁酰CoA脱氢酶和异戊酰CoA脱氢酶得到证实,因此本症像戊二酸Ⅱ型一样,可以认为是多种酰基CoA脱氢酶的缺陷所致,但其分子缺陷至今仍然是不清楚的。     

体外苏氨酸循环固碳途径的构建

乙酰CoA是生物体代谢过程中重要的代谢物,也是许多有价值产品合成的前体物质。然而传统途径中通过丙酮酸脱羧生成乙酰CoA碳得率较低,因此构建一条高效的乙酰CoA合成途径具有重要的意义。由于在体外验证文献报道的高碳摩尔得率合成乙酰CoA的苏氨酸循环固碳途径,有较重要的理论意义和应用价值。因此在体外构建了苏氨酸循环固碳途径合成乙酰CoA,通过分段加酶的方式将其在体外进行了验证。在体外验证时,以丙酮酸为底物,则丝氨酸脱氨酶(Tdc B)为循环途径的最后一步反应。结果表明,当加入途径中除丝氨酸脱氨酶之外的酶时,测得的乙酰CoA浓度约1.5 mmol/L,待反应达到平衡时,加入丝氨酸脱氨酶,丝氨酸转化为丙酮酸,丙酮酸再次进入循环,乙酰CoA的量增加了约0.2 mmol/L,由此得出结论在体外苏氨酸循环实现了固碳。     

过氧物酶体多功能酶2中固醇载体蛋白2结构域的功能

过氧物酶体多功能酶 (包括Ⅰ型、Ⅱ型 ,简称MFE1、MFE2 )在哺乳类动物的脂类代谢中发挥其重要作用 .MFE1具有 2 烯酰CoA水合酶 1和 (3S) 羟脂酰CoA脱氢酶的活性 ,而MFE2具有 2 烯酰CoA水合酶 2和 (3R) 羟脂酰CoA脱氢酶的活性 ,两者均催化烯酰CoA在过氧物酶体β 氧化途径中的第 2步和第 3步反应 .MFE1与MFE2的氨基酸序列不具有任何同源性 ,并且它们的底物特异性也不相同 .比较哺乳类MFE1及酵母MFE2发现 ,哺乳类MFE2羧基末端带有由 12 5个残基组成的固醇载体蛋白 2 (简称SCP2 )结构域 ,其功能是未知的 .为了研究SCP2结构域在MFE2中的功能 ,将人MFE2、MFE2ΔSCP2 (删除MFE2中的SCP2 )、脱氢酶结构域、水合酶结构域以及SCP2结构域分别在E .coli中表达 ,并经纯化得到相应的重组蛋白 .通过测定 2 烯酰CoA水合酶 2和 (3R) 羟脂酰CoA脱氢酶对烯酰CoA的催化活性发现 ,带有SCP2结构域的重组蛋白的酶活力及催化效率高于删除SCP2的突变体蛋白 .实验结果表明 ,SCP2结构域可能通过增强MFE2与脂酰CoA的结合力 ,使得MFE2发挥最有效的催化活力     

3-甲基戊烯二酸尿症—氨基酸先天性代谢缺陷之八

<正> 3-甲基戊烯二酸尿症是一种罕见的,新的亮氨酸代谢缺陷的遗传性疾病。本症是1976年由Robinson等人首先报道。到1982年已报道了5例。(1)3-甲基戊烯二酸的代谢3-甲基戊烯二酸单酰CoA是亮氨酸分解代谢的中间产物。是3甲基巴豆酰CoA羧化作用所产生的,并进一步在3-甲基戊二酸单酰CoA水合酶催化下,分解为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰CoA,如果此反应受阻,则3-     

多种羧化酶缺陷(3—甲基巴豆酰甘氨酸尿)—氨基酸先天代谢缺陷之五

<正> 本病为支链氨基酸代谢紊乱引起的一种新的疾患,主要表现为患者尿中出现3—甲基巴豆酰甘氨酸和3—羟基异戊酸,而且是和3—甲基巴豆酰CoA羧化酶(丁稀酰CoA羧化酶)缺陷相一致,这种素乱主要发生在亮氨酸分解代谢过程中。最近发现,这些患者尿中还排出甲基柠檬酸和羟丙酸,并存在着CoA羧化酶和3—甲基巴豆酰CoA羧化酶活性缺陷。因而这种疾患现在已被称为“多种羧化酶缺陷”。根据临床观察发现,多种羧化酶缺陷的患者对药理剂量的生物素反应相一致,这可能是基本缺陷与生物素的代谢、运输等有关。     

His-234是毛白杨对香豆酸 ∶ CoA连接酶的重要酶催化活性残基

对香豆酸∶CoA连接酶(4-coumarate: coenzyme A ligase,4CL)是植物苯丙烷类代谢途径中的一个重要的酶．4CL以肉桂酸衍生物(香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等)、ATP和CoA为底物合成相应的酰基-CoA酯,这些酰基-CoA酯是一系列重要化合物(如木质素)的前体．4CL的酶催化反应分两步进行：第一步以肉桂酸衍生物和Mg² -ATP为底物合成酰基-AMP,第二步用CoA取代AMP,产生酰基-CoA酯,催化过程中酶的构象产生明显的变化．因为4CL在木质素的合成中所起的作用,这个酶是通过蛋白质工程方法改进林产品质量的重要靶标．我们通过X射线衍射技术,解析了毛白杨对香豆酸∶CoA连接酶1(Pt4CL1)与其中间产物对香豆酰-AMP的复合物晶体结构,与同家族成员结构比对,确定所获得的蛋白质结构为Pt4CL1催化第二步反应,即酰基-CoA酯合成的构象．结构分析表明：His-234残基在Pt4CL1的酶催化机理中起着多重作用,即通过侧链与AMP磷酸基团形成氢键,降低磷酸基团的负电荷,催化CoA的亲核取代反应;侧链可以采取两种不同的构象以调节CoA进入Pt4CL1的催化中心;His-234的侧链还可能夺取CoA巯基的质子,从而增强CoA的亲核反应活性．突变体酶活数据结果也显示His-234对Pt4CL1的活性非常重要,是Pt4CL1催化中心的活性残基．     

3-羟-3甲基戊二酰辅酶A还原酶及他汀类药物

3-羟-3甲基戊二酰辅酶A(HMG—CoA)还原酶是胆固醇合成的限速酶,它是胆固醇代谢的最重要的酶之一。HMG—CoA还原酶的抑制剂——他汀类药物是目前广泛用于临床的降脂药,它不但可降低血浆胆固醇水平,还可防止动脉粥样硬化。     

生物膜融合

生物膜融合分为专一性膜融合和非专一性膜融合。专一性膜融合主要是指细胞膜的自然融合过程。病毒诱导的细胞膜融合也属于专一性膜融合。非专一性膜融合主要是指化学因子和物理因子诱导的膜融合过程。本文对上述两种膜融合作了较为全面的介绍,并对膜融合的机理作了简单的讨论。     

氨酰-tRNA合成酶专一性识别的进化

氨酰-tRNA合成酶(AARS)是一类在蛋白质合成过程中起着重要作用的酶,它通过与tRNA及其相应氨基酸的专一性识别作用,使得基因序列能够被精确地翻译成蛋白质序列.然而,氨酰-tRNA合成酶的这种识别作用既有专一性,也具有“兼容性”.氨酰-tRNA合成酶的这种双重性质不仅与其结构的进化有关,而且还与其所处的各类生物的不同进化阶段有关.AARS似乎经历了一个由“模糊专一性”（多重专一性）到“精确专一性”（单一专一性）的演变历程.     

热带假丝酵母长链二(脂)酰辅酶A合成酶的形成及性质

热带假丝酵母(Candida tyopicalis)具有不同碳链的二(脂)酰CoA合成酶的活力,原始菌No．1230的十二二酰CoA合成酶的活性较其突变株U3-21。高近一倍。生长碳源对酶的形成有一定的影响。十二二酰CoA合成酶需有ATP、CoASH才显示活性。酶作用的最适pH在6—8,最适温度为30℃。该酶耐热性极差,50℃,5分钟酶活全部丧失。ADP、AMP、KF、Zn2+ 及 8-羟基喹啉、2,4-二硝基苯酚、高浓度的EDTA和尿素对酶活性有抑制作用。     

离子交换法精制辅酶A的新工艺

辅酶A(简称CoA)的分离精制早期是用氧化亚铜共盐沉淀法。此法得率低,工序繁杂,原料昂贵,而且含有有害物质,污染环境,损害健康,不宜大规模生产。随着科学技术的发展,一些新技术得到广泛应用。近年来,CoA的精制采用了阴离子树脂分离法,DEAE-纤维素分离、葡聚糖凝胶——Sephadex G25过滤法,亲和层析分离法等。后两种方法虽能得到高纯度的     

DNA分析与扩增

922381 温度和寡核苷酸引物长度对聚台酶链反应扩增专一性和有效性的影响[英]/Wu,D.Y.…∥DNACell Biol.-1991,10(3).-233～238[译自DBA, 1991,10(25),91-14514] 由于温度和寡核苷酸控制寡核苷酸杂交的专一性,因此研究了寡核苷酸长度(14～20个核苷酸)、碱基组成及退火温度对PCR扩增专一性和有效性的影响。一般情况下,PCR专一性受寡核苷酸长度或引物与模板的退火温度控制。测定了寡核苷酸     

Maxam-Gilbert DNA序列分析实验方法(续)

碱基专一性的化学切断反应碱基专一性的部分切断反应包括以下三步:1.用具有碱基专一性的化学试剂对DNA分子中的某一种碱基进行部分修饰,控制修饰反应的条件,使DNA分子中每一个那样的碱基分别只在一部分DNA分子中被修饰;2.利用另一种化学试剂将被修饰的碱基从脱氧核糖     

固氮基因工程的新成就

传统的观点认为,根瘤菌互接种族菌株表现其寄主专一性,用它作为根瘤菌属定种的重要标志之一,基因工程技术可以改变这种寄主专一性而取得令人可喜的成就。     

油茶3羟酰CoA脱水酶基因的克隆与表达分析

3羟酰CoA脱水酶是一类催化3羟酰CoA脱水转化成为烯酰CoA形式的酶。本研究以国审油茶品种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库的基础之上,采用RACE技术,克隆到一个油茶3羟酰CoA脱水酶基因的cDNA全长,命名为CoHCD(Gen Bank登录号KJ910336)。该基因cDNA全长为1145bp,含有666bp的开放读码框,编码221个氨基酸,分子量为25.2kDa,理论等电点p I为9.4,疏水残基占整个氨基酸残基的48.9%,是亲水性蛋白,具有4个比较明显的跨膜区和蛋白质酪氨酸磷酸酶基序"HGXXGXXRS"。在基因c DNA全长序列的基础上,分别成功地构建了原核表达载体、超表达载体和RNA干扰载体,其中,原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)上成功诱导表达,获得表观分子量约为25 k Da的相应目的蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,在5个不同发育时期的油茶种子中CoHCD高效表达主要集中在8~10月,转录最高峰发生在9月,其表达量在种子发育过程中呈增加趋势。     

BglⅠ限制性核酸内切酶与环状pBR322-DNA专一性和非专一性相互作用的动力学及热力学

 本文选择限制性核酸内切酶BglⅠ和pBR322-DNA为试验系统,用酶促反应的动力学和热力学方法来研究内切酶对环状DNA分子的专一性和非专一性结合及切割过程,求得了各限制位点的切割速度k及活化能E,各限制位点催化速度常数k_c,酶同限制位点专一性结合的平衡常数k_S非专一性结合的平衡常数k_N及其热力学参数△H,△S。研究表明:不论底物的构型如何(线状还是环状),内切酶都以相似的动力学和热力过程对其进行结合与切割。