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相似文献
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1.
应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
安乃莉  张智清 《病毒学报》1999,15(2):130-135
为了观察硫氧还蛋白(TrxA)促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒pET-32a(+)上克隆了trxA基因,构建了TrxA表达质粒pT-TrxA。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化E.coli并同时获得表达。结果表明,共表达TrxA可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)、PTHrP受体(PTHrP-R)的血管内皮生长因子(VEGF)的可溶性表达。说明共表达  相似文献   

2.
牛生长激素基因的人工合成,重组克隆及高效表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子,人工全合成32个寡聚核苷酸片段;连接并克隆获得A(278bp)、B(88bp)、C(224bp)3个较大DNA片段;经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆;双向DNA序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素(bGH)编码基因,即编码N-Met-Ala-bGH和N-Met-Phe-bGH的两个基因,而至今尚未见有人工全合成bGH基因的报道。构建了在PLpromoter控制下含上述合成基因的表达质位pBLbGHE7A1和pBLbGHE8,并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达产物占全菌蛋白的37%以上。Western-blot分析和纯化产物的N端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成bGH基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量为现今国际文献报道的高限水平。  相似文献   

3.
鲤鱼(Cyprinus carpio)生长激素基因克隆及原核表达   总被引:16,自引:0,他引:16  
采用逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从鲤鱼脑垂体总RNA中扩增出编码鲤鱼生长激素(GH)成熟肽基因序列.定向克隆至质粒pUC18,克隆的鲤鱼GHcDNA不含信号肽序列并以新的起始密码子ATG取代鲤鱼GHcDNA第1个密码子TCA.序列分析表明,与Koren报道的鲤鱼GHcDNA相比有两个碱基差异,但推断的氨基酸序列完全一致.将鲤鱼GHcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建成重组鲤鱼GH基因表达载体pBVcGH8.SDS-PAGE和薄层扫描分析表明:经42℃诱导,pBVcGH8在大肠杆菌中可表达一分子量约22000的特异蛋白,表达量占细胞总蛋白的29.2%.该基因重组的鲤鱼GH添加到饲料中投喂罗非鱼,证实有明显的促进生长作用  相似文献   

4.
目的:克隆含tPA中355个氨基酸密码子(1-3和176-527氨基酸)的cDNA序列(tPA355),将其在大肠杆菌融合蛋白表达系统中表达,并在体外复性使其具有激活纤溶酶原的生物活性。方法:采用RT-PCR技术从人黑色素瘤细胞Bowes中克隆出tPA355cDNA,然后在pET32a(+)BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中表达,将表达出的融合蛋白Trx-tPA355(Thioredoxin,Trx)包涵体在体外进行变性、复性和纯化以使其具有激活纤溶酶原的生物活性。结果:测序结果表明本研究克隆的编码tPA中355个氨基酸密码子的cDNA序列与美国专利(公开号:5,587,159)中对应的序列完全一致,将其在pET32a(+)/BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中表达可获得稳定表达的融合蛋白Trx-tPA355包涵体,该包涵体占菌体总蛋白的30%左右,此融合蛋白经变性、复性后具有激活纤溶酶原的生物活性。结论:含tPA中355个氨基酸密码子(1-3和176-527氨基酸)的cDNA在大肠杆菌Trx融合蛋白表达系统中可获得稳定表达,表达的融合蛋白产物在体外经变性、复性后具有激活纤溶酶原的生物活性。  相似文献   

5.
人TIMP—3cDNA的克隆,表达及其抗血管生成作用   总被引:1,自引:0,他引:1  
从人新鲜的胎盘组织中提取总RNA,以RT-PCR法获取了人组织金属蛋白酶抑制-3成熟蛋白的cDNA。序列分析表明,TIMP-3成熟蛋白含有188个氨基酸残基,其中12个半胱氨酸残基在TIMP家族中高度保守。将人TIMP-3cDNA插入含7启动子的质粒pET-24构建表达质粒pET-TIMP3,转化大肠杆菌BL21,筛选表达菌株BLTIMP3。  相似文献   

6.
利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴  相似文献   

7.
水稻cDNA c73片段在大肠杆菌中的表达及其产物的纯化   总被引:2,自引:0,他引:2  
曾以水稻蜡质基因5’调控区内一段31bp片段为探针,用酵母单杂交法从水稻cDNA文库中筛选出若干个其编码的蛋白可能与此31bp片段结合的cDNA克隆,现将其中的pC73克隆中的插入片段c73连接到含His6的表达载体pET28-c(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,并用Ni-NTA树脂纯化得到预期的融合表达产物。在合适的诱导表达条件下,融合表达产物主要以可溶形式存在于大肠杆菌细胞  相似文献   

8.
通过有机试剂抽提,CF-11纤维素柱层析,从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株(RiceRaggedStuntVirus,Philippineisolate,简称RRSV-P)的水稻植株中获取该病毒的全基因组,即获得从Segment1到Segment10(S1-S10)的10条双链RNA(dsRNA),然后设计合适的引物,用RT-PCR方法得到S9的cDNA并将其克隆到pUC119质粒上扩增,以双链测序法测定该cDNA的全序列。同时又将此cDNA克隆到大肠杆菌表达质粒pGEX-3X上,在大肠杆菌菌株DE3中用IPTG诱导表达,经超声波破菌、离心、Glutathione-sepharose4B亲和层析,得到纯化的分子量为64kD的融合蛋白。  相似文献   

9.
p16抑癌基因定点突变及其在大肠杆菌中的表达与纯化   总被引:1,自引:0,他引:1  
为了研究错义突变对p16功能的影响,应用PCR体外定点突变方法对p16cDNA进行体外定点突变,并将野生型和突变型p16cDNA克隆于pGEX-5T载体,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,Western印迹鉴定确证表达.而后用谷胱甘肽-Sepharose4B亲和层析纯化野生型和突变型p16融合蛋白.得到了第48位密码子CCG(Pro)→CTG(Leu)突变的p16-P48突变体,并在大肠杆菌中表达了42kD的GST-p16和GST-p16P48L融合蛋白.最后经纯化得到了野生和P48L突变的p16融合蛋白  相似文献   

10.
利用RT-PCR方法成功地从PI(PMA,Ionomycin)、PHA活化的人T细胞中扩增出hIL-17编码区cDNA(468bp),克隆测序证实得到该基因.用特殊设计的引物扩增hIL-17成熟肽编码区(414bp),接入表达载体pET30a质粒中.pET30a-mhIL-17在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白50%左右.经凝胶过滤和阴离子交换层析两步分离纯化和复性,得到单体型rmhIL-17,纯度达98%以上,N端16个氨基酸序列分析,结果与文献报道一致.SDS-PAGE法测定分子量为16kD,薄层丙烯酰胺凝胶等电聚焦分析该蛋白等电点为pH8.8~8.9,3HTdR参入法测定rmhIL-17单体的体外活性,实验结果表明rmhIL-17对PHA活化人的PBMC细胞具有抑制作用,结果同可溶型IL-17R性质相似  相似文献   

11.
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子(编码3~149氨基酸)cDNA基因,并克隆在质粒pET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL21(DE3)LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合m-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螫合亲和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基本呈一条均一的蛋白质条带。  相似文献   

12.
雄激素受体与雄激素应答元件的相互作用   总被引:4,自引:2,他引:2  
将雄激素受体(AR)的cDNA1119bp片段(1105-2224)(其中包含其DNA结合结构域到部分激素结合结构域)克隆于表达南粒pGEX中,通过IPTG诱地,在E.coli中表达GST-AR融合蛋白,经谷胱甘肽-Sepharose-4B亲和层析得以部分纯化。利用一个有雄激素应答元件(ARE)活性的C3(1)DNA片段为阳性探针,通过凝胶阻滞分析和DNase1足迹法证明此表达产物具有牧民的DNA  相似文献   

13.
利用PCR技术和DNA体外重组方法,将内皮素A型受体(EndothelintypeAreceptor,ETAR)胞内区cDNA克隆到pUC18载体中进行序列分析。结果表明,DNA序列与预期结果完全相符。然后用低熔点琼脂糖回收插入到pUC18载体中的ETAR胞内区DNA片段,连接到pGEX2T融合蛋白表达载体的凝血酶位点下游,转化大肠杆菌JM103,得到的重组质粒命名为2T/ETAR。JM103(2T/ETAR)经30℃培养、IPTG诱导明显表达出ETAR胞内区融合蛋白,表达产物主要以包涵体形式存在。包涵体经变性和复性后,用亲和层析一步纯化法获得了较纯的ETAR胞内区融合蛋白,为进一步研究ETAR胞内区的功能打下了良好的基础  相似文献   

14.
人白细胞介素-3(humanInterleukin3,hIL-3)是一种造血前体细胞早期分化的关键调节因子。用PCR方法从人T淋巴细胞cDNA文库中扩增出0.44kb的DNA片段,并克隆入pUC19载体中。经DNA序列测定,确定0.44kb的PCR产物合完整的编码人白细胞介素-3成熟蛋白cDNA序列,并在信号肽与成熟蛋白编码序列之间通过突变引入了限制性内切酶位点和ATG起始密码。构建的PL启动子控制下的hIL-3cDNA表达质粒,转入大肠杆菌Tap106,经42℃热诱导,获得hIL-3的表达产物。SDS-PAGE电泳显示表达产物为15kd,约占细菌总蛋白的15%。表达产物经ELISA和Western-blot验证。hIL-3表达产物在细胞内形成包涵体,纯化包涵体,使产物纯度提高到70.8%,产物复性后,能明显促进hIL-3依赖细胞株生长,具有明显的生物活性。产物转移到PVDF膜后进行N端序列分析,N端16个氨基酸正确。  相似文献   

15.
甲状旁腺素相关蛋白cDNA的克隆及其在大肠杆菌中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
采用RTPCR方法从中国人肾癌细胞株中克隆到甲状旁腺素相关蛋白(Parathyroidhormnoerelatedprotein,PTHrP)cDNA,其核苷酸序列与国外发表资料相比,有6个核苷酸不同,其中仅92位密码子的不同导致氨基酸变异,即由脯氨酸变为丝氨酸。将克隆的PTHrPcDNA插到原核表达载体pET3a的T7噬菌体启动子下游,转化大肠杆菌后得到高效表达,并经Westernblot和生物学活性检测对表达产物作了鉴定。  相似文献   

16.
利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增人γ心钠素(γ-hANP)cDNA编码序列,在其5′和3′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点,定向克隆到表达质粒载体pMS-31b,在大肠杆菌pop2136中高效表达出人γ心钠素融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30~40%。双向免疫扩散法测定证明表达产物与人α心钠素(α-hANP)抗血清呈阳性反应,纯化的表达产物经复性处理后能引起大鼠胸主动脉条舒张.  相似文献   

17.
叶萍  李燕 《病毒学报》1998,14(3):215-220
将Epstein-Barr病毒(EBV)膜抗原(MA)BLLF1基因,插入含有CMV启动子的真核表达载体pcDNA3下游BamHI位点,构建成真核表达质粒pcDNA3-MA。将纯化的DNA注射Balb/c小鼠股四头肌。经免疫的动物产生抗EB病毒MA特异性的抗体和中和抗体,依赖抗体细胞介导的细胞毒作用(ADCC),特异性T淋巴细胞增生性反应及细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤作用。基因免疫与基因-蛋白  相似文献   

18.
霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)的克隆及其表达   总被引:7,自引:0,他引:7  
从霍乱弧菌中抽提基因组DNA,用PCER方法获取霍乱毒素B亚单位基因(CtxB)。序列分析结果表明,CtxB基因编码124个氨基酸,其中编码62位Thr的密码子与文献报道有差异。将CtxB基因插入质粒pGEX-4T-2,构建pGEX-CTXB表达质粒,转化大肠相菌BL21(DE30,筛选表达菌株CTXB/BL21。工程株经IPTG诱导表达,可产生大量的表达蛋白,经SDS-PAGE分析,融合蛋白分子  相似文献   

19.
本文用聚合酶链反应(PCR)获得了一个缩短的人巨噬细胞集落刺激因子cDNA基因,并克隆在质粒pAET3d中,在T7启动子指导下,在大肠杆菌BL2LysE中获得了和一个6组氨酸短肽标签的融合表达。重组的融合M-CSF表达量占菌体总蛋白的12%,表达产物一部分以不溶性包涵体形式存在,另一部分则以可溶性蛋白存在。经过金属螯合新和层析一步纯化,所得的融合(His)6-M-CSF在还原型SDS-PAGE上基  相似文献   

20.
克隆小鼠白细胞介素12(IL-12)p40及p35cDNA,并构建同时含mIL-12p40和p35cDNA的双顺反子真核表达载体及其在哺乳动物细胞中的表达.白细胞介素12是由巨噬细胞,树突状细胞等抗原提呈细胞产生的一种异二聚体细胞因子,对机体的细胞免疫功能起着重要的调节作用.利用脂多糖(100pg/ml)和小鼠重组干扰素(IFN-γ500U/ml)体外联合刺激小鼠腹腔巨噬细胞,从中提取总RNA,经RT-PCR扩增出含信号肽的小鼠白细胞介素12(mIL-12)p40及p35全长cD-NA.PCR产物经酶切后,分别克隆至pBluescriptⅡSK载体中,序列测定结果与文献报道序列一致.然后利用脊髓灰质炎(Polio)病毒内核糖体进入位点(IRES)连接mIL-12p40及p35cDNA,亚克隆至pcDNA3载体中,构建成含mIL-12p40及p35cDNA双顺反子真核表达载体,即pcDNA3/mIL-12,p40及p35cDNA同时受pcDNA3中hCMV启动子驱动,将p40及p35转录至同一mR-NA上.通过LipofectAMINE将pcDNA3/mIL-12转染COS-7细胞,72h收集培养上清,测定m  相似文献   

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