体外建成带有λ噬菌体DNA片段的重组质体

将大肠杆菌抗四环素及抗氨苄青霉素的质体pBR322的DNA、大肠杆菌λ噬菌体DNA在体外经限制性核酸内切酶Hin d Ⅲ切割,并用T4DNA连接酶连接后,以大肠杆菌K 12 HB 101(recA~- r_k~- m_k~-)为受体进行转化,采用插入钝化(insertional inactivation)方法选择重组质体。利用环丝氨酸浓缩Ap~rT_c~3转化体。在648株Ap~r转化体中选出120个无性繁殖系为Ap~rT_c~3。随机挑出3株含有重组质体的无性繁殖系进行大肠杆菌素     

质粒和λ噬菌体DNA简便的分离纯化方法

用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCR1和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA重组体的载体和限制性内切酶的底物。     

质粒和λ噬菌体DNA简便的分离纯化方法

用甲酯化白蛋白硅藻土(MAK)柱层析方法分离纯化的质粒pBR322,ColE_1,pSC101,pCRl 和λDNA,经EcoR_1限制性内切酶作用,琼脂糖凝胶电泳分析,抗药因子转化,结果表明这些材料可以用作DNA 重组体的载体和限制性内切酶的底物。     

叶绿体DNA在大肠杆菌中的无性增殖——带有豌豆叶绿体DNAEcoRI片段的重组质粒的某些特性和带有rRNA基因DNA顺序的无性增殖

我们先前报道过用丝裂霉素C挑选大肠杆菌素缺陷型重组质粒的筛选方法。用该方法得到了许多带有豌豆叶绿体DNAEcoRI片段扦入顺序的CPS重组质粒细菌克隆。本篇报道在细菌细胞内复制的叶绿体DNAEcoRI片段某些特性的研究结果。证明,大肠杆菌细胞内无性增殖的豌豆叶绿体DNAEcoRI片段具有可变的核苷酸组成,共中有些片段内AT碱基对含量相当丰富。     

叶绿体DNA在大肠杆菌中的无性增殖——带有豌豆叶绿体DNAEcoRI片段的重组质粒的某些特性和带有rRNA基因DNA顺序的无性增殖

我们先前报道过用丝裂霉素C挑选大肠杆菌素缺陷型重组质粒的筛选方法。用该方法得到了许多带有豌豆叶绿体DNAEcoRI片段扦入顺序的CPS重组质粒细菌克隆。本篇报道在细菌细胞内复制的叶绿体DNAEcoRI片段某些特性的研究结果。证明,大肠杆菌细胞内无性增殖的豌豆叶绿体DNAEcoRI片段具有可变的核苷酸组成,共中有些片段内AT碱基对含量相当丰富。这就证明了早     

N_3质粒对λ噬菌体发育途径的影响

诱导试验表明N_3质粒抑制λ溶源菌诱导处理时的裂解性发育途径,使λ噬菌体产率大大降低,仅为对照的10~(-5)—10~(-6)。感染实验表明N_3质粒主要抑制λ噬菌体的溶源性发育途径,其溶源菌形成率仅为对照的1.3—1.9％。从N_3质粒对λ噬菌体感染时与λ溶源菌诱导时的发育途径的不同作用的事实推测N_3质粒的某种产物(蛋白质)与λ噬菌体cI蛋白相作用,以障碍cI蛋白正常解离或聚合的方式而干扰其发育途径。     

噬菌体重组酶介导的DNA同源重组工程

来源于噬菌体的遗传操作工具在基因工程中具有非常重要的地位,例如位点特异性重组酶、柯斯质粒DNA文库及同源重组酶等。其中,来源于Lambda噬菌体的同源重组酶Redα/Redβ和来源于Rac原噬菌体的同源重组酶RecE/RecT能够高效地介导35–50bp短同源臂之间的重组。基于噬菌体同源重组酶Redα/Redβ和RecE/RecT开发的DNA同源重组工程(Recombineering)能够对靶标DNA分子进行快速、精准、高效的修饰,不受限制性内切酶识别位点和DNA分子大小限制,已发展成为一种新型的基因工程技术。本文主要综述了噬菌体同源重组酶及其作用机制、在大肠杆菌及其他细菌中的应用和开发,以及在微生物次级代谢产物的挖掘、动植物转基因、病毒基因组克隆和修饰等方面的应用。原位激活沉默基因簇需要宿主特异性的DNA同源重组工程进行启动子和调控元件的修饰;异源表达次级代谢产物的首要步骤一般是通过RecET直接克隆大的DNA片段;动植物转基因复杂载体的构建效率在有了Red同源重组系统以后有了革命性的发展;RecET直接克隆和Red同源重组介导的感染性克隆构建和修饰方法,不仅有利于病毒基因组功能研究...     

λ噬菌体和Cosmid重组DNA克隆的快速限制性内切酶图谱分析方法

cosmld克隆的线性化用λcos末端酶来完成,线性的cosmid或λDNA经部份限制性内切酶酶解后,分别与已标记的cos顺序探针杂交(探针为分别与λ的左端或右端的cos顺序互补的12核苷酸单链片段),杂交后的部份酶解片段经电泳分离和自显影后,酶切点位置可直接在X-底片上读出。在本实验室条件下,可一次完成二个克隆包括5—6种限制性内切酶的图谱分析,分析和作图可通过计算机或手工进行。     

高效率提取λ噬菌体DNA离体包装抽提物

λ噬菌体DNA在与被克隆的DNA片段结合成重组体后,需进行体外包装才能形成侵染性的噬菌体颗粒。这里仅就如何提取高效能人噬菌体DNA包装抽提物（包装蛋白）谈谈体会。（1）菌落的选择从BHB2688和BHB2690的不同菌落中提取的包装抽提物的包装效率（讨U小g／＊＊A）可相差10倍以上。因此在大量制备以前,有必要先挑选多个菌范小批量制备抽提物并测定其包装效率,取优良者进行制备。（2）热诱导后的培养时间文献所载,在热诱导后培养至细菌可被氛仿裂解时即可停止。但我们的经验是12”IX10’养一段时间可明显提高抽提物的效价（见图1）…     

凝胶电泳估计质粒和DNA片段大小的一个精确方法

<正>根据在凝胶电泳中的移动性估计质粒和其它DNA片段的分子量已进行了许多年。Aaij和Borst(1972)证明了分子量的对数与移动性之间的线性关系,可用于估计大至10MDa的细菌噬菌体和线粒体DNA。通过使用分子量和移动性的对数/对数图,此方法被发展用于大至95MDa的质粒(Meyer等,1976),因为对数/对数图本质上是弯     

改善大分子质粒DNA重组效率的新方法

采用两次连接法对一个质粒载体为7.65 kb,插入子为1.47 kb的片段进行重组连接,使连接效率大大提高.此方法对于大分子的质粒DNA重组是非常有效的.     

一个体外构建的重组质粒——pCBI

构建了质粒pBR322和pCRI 的重组质粒——pCBI。已通过转化技术将其送入大肠杆菌,在含有四环素和卡那霉素的培养基中筛选了转化子。在细菌培养液内加入氯霉素使转化子中的重组质粒扩增。采用琼脂糖凝胶电泳法及水溶性两相抽提法纯化重组质粒。重组质粒pCBI 的电泳速度低于两个亲本质粒。用限制酶EcoRI 降解重组质粒,在凝胶电泳上看到两条带,它们的位置分别对应于pBR322线性DNA和pCRI 线性DNA。电镜观察到环状pCBI DNA 并测得其长度为5.77±0.30微米,折合分子量为(11.9±0.6)×10~6道尔顿。     

一种改进的快煮制备质粒DNA和噬菌体DNA的方法

质粒DNA和噬菌体DNA的提取,是基因操作过程中最基本的、也是比较重要的一个步骤。而制备纯度高的制品,缩短操作时间,又是人们普遍感兴趣的。提取闭合环状共价DNA(cccDNA)(包括质粒DNA和噬菌体DNA)的基本原理是利用大分子染色体DNA片段与环状共价DNA的理化性质差别来进行的,方法多种:SDS法,酸酚法,PEG法,煮     

弓形虫特异DNA片段顺序分析及体外基因扩增

从弓形虫(ZS_2株)基因组文库中筛选出了一个弓形虫特异DNA片段的克隆,对克隆的片段进行了部分顺序分析。根据所得DNA顺序,自行设计并合成特异的寡核苷酸引物对,建立了体外扩增弓形虫特异DNA顺序的聚合酶链反应(PCR)方法。4种不同来源的弓形虫株DNA、人工感染弓形虫的三头幼猪白细胞和胸腺DNA经过PCR扩增,均出现特异的扩增条带;而正常人、正常幼猪外围血白细胞、正常小鼠脾脏、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、溶组织内阿米巴和人巨细胞病毒DNA均不出现特异的扩增条带。对扩增产物进行了Southern印迹和限制性内切酶图谱分析,证明该PCR产物是弓形虫DNA特异的顺序。该方法可测出少至1pg的弓形虫DNA或1个弓形虫体的裂解液。本文分析的DNA顺序和设计合成的引物顺序数据,经电脑DNA数据库检索,证明无相同的顺序。本方法并具有简便、快速等优点,便于推广应用。     

DNA重组技术(Ⅱ) 小量制备噬菌体DNA的方法

从噬菌体包装的全基因文库中克隆目的基因,是重组DNA基本技术之一。对筛选到的噬菌体进行DNA扩增和酶切分析,以确定克隆的正确性是必要的步骤。 下面介绍两种常用的小批量制备噬菌体DNA的方法。