乙酰胆碱酯酶的别构作用——某些胆碱能效应剂与钙离子激活作用的关系

钙离子对纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的激活作用是依赖于底物浓度的。在钙离子存在时,表现最高活力的底物浓度在0.3mM 左右,随着底物浓度的增高,激活作用消失。钙离子与酶结合作用的表观解离常数为6×10~(-4)M 左右。钙离子浓度的增加并不解除底物对钙离子激活作用的抑制,表明钙离子似不可能结合在酶的外周底物结合部位。非竞争性抑制剂箭毒,在酶的外周阴离子部位有表现不同亲和力的两种结合作用,只有其中高亲和力的抑制作用为钙离子解除。在箭毒接近全抑制酶活性以后,再增加箭毒浓度,钙离子仍表现竞争作用。箭毒对酶的两种不同的抑制作用皆为底物所解除。竞争性与非竞争性混合类型抑制剂十甲鎓及1,5-双-(4-三甲铵苯)戍酮-3的抑制作用部份地为钙离子解除。讨论了包括钙离子及硫代丁酰胆碱、箭毒、十甲鎓、1,5-双(4-三甲铵苯)戊酮-3、季铵酚和六甲鎓在内的多种胆碱能配基在酶上三类部位的结合及配基间的相互作用。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用:两类胆碱能配基在外周阴离子部位的颉颃

纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶,在低离子强度介质中,底物(硫代丁酰胆碱)浓度和活性的关系符合Michaelis 方程。底物在外周阴离子部位的结合不抑制酶活性。然而,底物按Kss 值(底物在外周结合作用的解离常数)解除箭毒和阿托品对酶的纯非竞争性抑制作用。与箭毒类似的胆碱能配基还有1,5-双-(4-三甲铵苯)戊酮-3及十甲鎓。但它们对酶的催化阴离子部位也有很高的亲和力。我们测定了它们作用于酶上两类部位的抑制常数。另一类胆碱能配基,包括硫代丁酰胆碱、乙酰胆碱、苯酰胆碱、间-三甲铵酚、烟碱、六甲鎓和季铵酚,除了它们在酶的催化阴离子部位有较高的亲和力外,也结合于外周部位,并表现为解除箭毒抑制的颉颃作用。其中某些化合物在外周结合后也有别构激活作用。从这些结果能假定,酶至少可存在三种构象状态。讨论了乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体的某些相似性。     

乙酰胆碱酯酶的别构作用:两类胆碱能配基在外周阴离子部位的颉颃

纯化的黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶,在低离子强度介质中,底物(硫代丁酰胆碱)浓度和活性的关系符合Michaelis方程。底物在外周阴离子部位的结合不抑制酶活性。然而,底物按Kss值(底物在外周结合作用的解离常数)解除箭毒和阿托品对酶的纯非竞争性抑制作用。与箭毒类似的胆碱能配基还有1,5-双-(4-三甲铵苯)戍酮-3及十甲鎓。但它们对酶的催化阴离子部位也有很高的亲和力。我们测定了它们作用于酶上两类部位的抑制常数。另一类胆碱能配基,包括硫代丁酰胆碱、乙酰胆碱、苯酰胆碱、间-三甲铵酚、烟碱、六甲鎓和季铵酚,除了它们在酶的催化阴离子部位有较高的亲和力外,也结合于外周部位,并表现为解除箭毒抑制的颉颃作用。其中某些化合物在外周结合后也有别构激活作用。从这些结果能假定,酶至少可存在三种构象状态。讨论了乙酰胆碱酯酶和乙酰胆碱受体的某些相似性。     

5,5′-联硫-2,2′-双硝基苯甲酸及其有关化合物对乙酰胆碱酯酶的别构效应

5,5'-联硫-2,2'-双硝基苯甲酸(DTNB)及其有关化合物TNB、TNB-Tch都是黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的别构效应剂: 1.TNB非竞争性地抑制、而DTNB则激活该酶水解乙酰硫代胆碱和丁酰硫代胆碱的活力。对水解乙酰胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆无影响。2.TNB-Tch比TNB具有更强的抑制作用。且对该酶水解乙酰胆碱、乙酰硫代胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆有抑制作用。抑制类型与作用底物有关。底物在外周的结合能解除其抑制。3.钙离子可以解除TNB和TNB-Tch的抑制作用,而箭毒亦能与之对抗。对蛇毒乙酰胆碱酯酶,除了极低浓度(<10μM)DTNB和TNB有微弱的抑制作用外,TNB-Tch以及较高浓度的DTNB和TNB都具有强烈的激活作用。而对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的活力皆无影响。     

5,5′-联硫-2,2′-双硝基苯甲酸及其有关化合物对乙酰胆碱酯酶的别构效应

5,5'-联硫-2,2'-双硝基苯甲酸~*(DTNB)及其有关化合物TNB~(**)、TNB-Tch~(**)都是黄姑鱼肌肉乙酰胆碱酯酶的别构效应剂:1.TNB 非竞争性地抑制、而DTNB 则激活该酶水解乙酰硫代胆碱和丁酰硫代胆碱的活力。对水解乙酰胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆无影响。2.TNB-Tch 比TNB 具有更强的抑制作用。且对该酶水解乙酰胆碱、乙酰硫代胆碱及α-萘酚乙酯的活力皆有抑制作用。抑制类型与作用底物有关。底物在外周的结合能解除其抑制。3.钙离子可以解除TNB 和TNB-Tch 的抑制作用,而箭毒亦能与之对抗。对蛇毒乙酰胆碱酯酶,除了极低浓度(<10 μM)DTNB 和TNB 有微弱的抑制作用外,TNB-Tch 以及较高浓度的DTNB 和TNB 都具有强烈的激活作用。而对猪脑尾核乙酰胆碱酯酶的活力皆无影响。     

54kD钙结合蛋白对血小板膜磷脂酶A2的影响

用钙离子沉淀和柱层析的方法从猪血小板中分离纯化到了一个分子量为５４ｋＤ、具有Ａｎｎｅｘｉｎ样生物学作用的钙结合蛋白,并用对钙离子有高度特异亲和力的偶氮胂试剂确定了该蛋白质具有钙结合能力。为了研究５４ｋＤ钙结合蛋白对猪血小板膜磷脂酶Ａ２的作用,我们用密度梯度离心方法制备了猪血小板膜,并用其作为酶和底物的材料,用游离脂肪酸的微量显色法建立了测定猪血小板膜结合的ＰＬＡ２活性的方法。我们的实验结果表明：５４ｋＤ钙结合蛋白在反应体系钙离子浓度低于１ｍｍｏｌ／Ｌ时,对膜结合的ＰＬＡ２具有激活作用;在钙离子大于１ｍｍｏｌ／Ｌ时;对膜结合的ＰＬＡ２具有抑制作用。并且抑制作用不随底物浓度的升高而降低．     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过量底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5′-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的提纯、性质及钾离子激活的别构动力学

从乌梢蛇肌肉中提纯了果糖1,6-二磷酸酯酶,其最适pH 在中性,分子量14万,由四个亚基组成,二价金属离子镁、锰或锌为表现活力所必需,一价金属离子钾、铵和铯能激活此酶。在不同浓度的甲醇、乙二醇、甘油和二甲基甲酰胺的水溶液中测活表明,蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶比兔肌的这一酶更易失活,提示了在蛇肌酶分子中疏水键对维持酶的三维结构起着更大的作用。K~ 存在下,蛇肌酶的最适pH 从无K~ 时的6.6位移至7.0;而兔肌酶在同样条件下,不论有否K~ ,均为pH7.4。表明K~ 对蛇肌酶有专一性的相互作用。K~ 对蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶的激活是一别构激活作用,具有正协同性,但其Hill 系数随着底物浓度的增高而减小;另一方面,底物抑制的阈值随着K~ 浓度增高而上升,表明K~ 与过量底物为一对相拮抗的别构效应剂,它们与酶的结合部位之间存在着相互作用。K~ 的别构效应导致过量底物与酶的亲和力下降,使酶趋于活性状态;过景底物的别构效应对抗了K~ 的激活,使酶趋于非活性状态。在K~ 存在下,5,5'-二硫-(2-硝基苯甲酸)与酶上巯基的反应速度较无K~ 的为快,表明K~ 的存在改变了酶的构象,使巯基更易发生反应。对于过量底物有抑制作用的酶,在其底物浓度大于抑制阈值的条件下的动力学处理,本文提出了一个公式和方法。     

OPTA对乳酸脱氢酶的抑制动力学

邹承鲁建立的酶活性不可逆改变动力学理论已为实验所验证,它不仅适用于单底物酶的抑制和激活的动力学研究,而且也适用于双底物酶反应系统.但在双底物酶反应系统中,底物和酶的结合方式有四种机制,即随机机制、有序机制、强制有序机制和乒乓机制,迄今为止这一动力学方法仅对随机机制的肌酸激酶进行了实验研究.而其它机制的实验研究尚未见诸报道.我们选用了有序机制的乳酸脱氢酶(LDH),用邻苯二甲醛(OPTA)为抑制剂对该酶的抑制过程进行了实验研究.结果表明,OPTA对该酶的抑制为不可逆抑制.其产物生成与时间的关系曲线符合邹氏方程:[P]=[P]_x(1-e~(-A[OPTA]).由ln([P]_x-[P])对t作图为一直线,表明它的抑制作用为单相动力学过程,抑制剂与酶的结合为一步反应.由直线的斜率A[OPTA]对[OPTA]作图为一过原点的直线.说明表观速度常数A与OPTA的浓度无关.OPTA与酶的结合为非络合型.测得的OPTA与EE-NADH结合的微观速度常数分别为:K(?)=49.6(mmol L)~(-1)min,(?)=2.31(mmol L)min~(-1)(?).明显小于(?)的事实表明.NADH对失活有明显的保护作用.OPTA是一个竞争性的不可逆抑制剂.用传统的方法测得的(?)为42.5(mmol L)min~(-1).与邹氏方法测得的结果非常接近.     

马齿苋叶片磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性及调节特性的光/暗变化

在光照条件下C_4植物马齿黄金苋叶片PEPC的提取活性高于在黑暗中的。PEPC的光/暗活性比率与测定系统的pH及底物PEP浓度有关。pH升高及PEP浓度增加均可使光/暗活性比值下降。日间提取的PEPC与夜间提取的PEPC对于激活剂G6P及抑制剂Mal的敏感性有明显差异。日型PEPC的敏感性低于夜型PEPC的。G6P对PEPC的激活作用表现为增加酶对底物PEP的亲和性,Mal的抑制作用表现为既降低酶对底物PEP的亲和性,又降低酶促反应的最大速度。G6P、Mal对于日型和夜型PEPC的动力学参数的影响是不同的。     

1,3-二氯丙烯药剂对土壤微生物数量和酶活性的影响

通过室内培养实验研究了1,3-二氯丙烯对土壤中微生物数量和土壤酶活性的影响,以评价其环境生态效应.结果表明,1,3-二氯丙烯熏蒸土壤后,各浓度处理对土壤真菌数量有强烈的抑制作用;对土壤细菌和放线菌的影响开始均表现为抑制作用,然后抑制作用减弱,逐渐表现出一定的激活作用.1,3-二氯丙烯熏蒸土壤后,高浓度处理对土壤脲酶表现为抑制-激活作用;低浓度处理表现为激活-抑制-激活作用.对蔗糖酶表现为激活-抑制作用,且抑制率逐渐增大.对过氧化氢酶表现为抑制-激活作用,50 d后施药土壤和对照组土壤的过氧化氢酶活性基本趋于一致.     

腺苷三磷酸对RuBP羧化酶的稳定效应及其对酶催化部位的作用

ATP显著提高RuBP羧化酶在低温下贮存的稳定性,并抑制RuBP羧化酶在贮存期间巯基数的减少及高分子聚合体的出现。ATP对RuBP羧化酶的活化作用影响不大,但对催化反应有明显的抑制作用,它是一种相对底物RuBP的竞争性抑制剂。凝胶过滤法显示同位素标记的ATP与酶分子相结合。结果说明:ATP与底物RuBP在酶的催化部位上有共同的结合位置。ATP对RuBP羧化酶的稳定效应以及对酶分子构象变化的影响是通过与RuBP催化部位的结合而起作用的。     

氧化磷酸化作用的研究 Ⅱ.2,4-二硝基苯酚对琥珀酸氧化抑制效应的解除

进一步研究DNP对大白鼠肝脏綫粒体琥珀酸氧化的激活和抑制,发現当琥珀酸氧化已被DNP抑制时琥珀酸脫氫酶并沒有受到明显的抑制。DNP对琥珀酸氧化的抑制可以被α-酮戊二酸、(?)柠檬酸、柠檬酸、丙酮酸、β-羟基丁酸等解除。α-酮戊二酸的解除作用与底物水平磷酸化作用无关,但与脫氫过程有密切关系;当加入0.2mM亚砷酸鈉时,α-酮戊二酸不再能使呼吸恢复。谷氨酸解除DNP对琥珀酸氧化抑制的作用不受天門冬氨酸α-酮戊二酸轉氨酶的抑制剂环絲氨酸的影响,Amytal使呼吸恢复的作用与线粒体內源底物含量有关?疚慕Y果进一步說明琥珀酸氧化需要能量激活,我們认为某些底物脫氫生成的NADH可以通过琥珀酸氧化引起NAD~+需能还原的逆反应生成高能磷酸化合物因而激活了琥珀酸的氧化。通过这样的途径生成高能磷酸化合物可能是对DNP較不敏感的。     

胆碱脱氢酶的动力学性质

本文对增溶胆碱脱氢酶的稳态初速度及产物抑制动力学做了。底物胆碱和ＰＭＳ的相互影响：变化一个底物的浓度,另一个底物的Ｋｍ及Ｖｍａｘ均变化。该酶的产物三甲胺 地 制表现为对底物胆碱非竞争性而地ＰＭＳ竞争性,在胆碱饱和的情况下,三甲胺乙醛对酶的抑制仍表现为对ＰＭＳ竞争性。这些结果表明增溶胆碱脱氢酶的催化机制搂双底物双产物乒乓机制。１－ＰＣ与９－ＡＣ对增溶胆碱脱氢酶均有抑制作用,且均为混和型抑制,Ｋ１分别     

产气气杆菌茁霉多糖酶的研究II．化学试剂对酶活力的影响

研究了某些化学试剂对产气气杆菌 Aerobacter aerogenes 的茁霉多糖酶 (Pullulanase EC3.2.1.41)活力的影响。Hg2+,Cu2+,Al3+,Fe3+等金属离子对酶活力有强烈的抑制作用,Ca2+,Mg2+有激活作用。1×10-3M的β-环状糊精完全抑制酶的活力,是竞争性抑制剂,其抑制常数Ki为0．55×10-5M。8M尿素,1.0M的盐酸胍,0.5％的SDS等蛋白质变性剂导致酶活力的完全丧失,在反应体系中有5×10-4M的Ca2+时,对酶有明显的保护作用。色氨酸残基的专一性修饰剂N-溴代琥珀酰亚胺(简称NBS)在1×10-4M的浓度下使酶活力完全丧失,甚至在1×10-5M的浓度下,只保留9％的活力,酶液在用NBS处理前加入不同浓度的底物,对活力有明显的保护作用,表明色氨酸残基对于茁霉多糖酶的活力是十分重要的。     

三种双季铵化合物对乙酰胆碱酯酶梭曼膦酰化和老化的影响

本文研究了六甲溴铵(C_6)、十甲溴铵(C_(10))和百草枯(paraquat或PQ)对电鳐电器官乙酰胆碱酯酶的作用。C_6是酶的完全竞争性抑制剂,它对梭曼膦酰化酶的老化反应有明显的延缓作用;C_(10)对酶的抑制分为两相,A相为完全竞争性抑制,B相为混合型抑制,它对老化只有轻微的延缓作用;PQ为酶的激活剂,而它对老化几乎无影响。概据这些结果可以设想,酶的活性区域的阴离子部位在梭曼膦酰化乙酰胆碱酯酶的老化中起重要作用。     

钙依赖型蛋白激酶调节保卫细胞膜内向钾离子通道的实验证据

保卫细胞内钙离子浓度的变化对气孔保卫细胞质膜上的内向钾离子通道活性有显著调节作用,而钾离子通道活性的变化可导致细胞渗透压的改变,进而调节气孔的开闭运动。然而,钙离子通过何种机制实现对钾离子通道的调节尚不清楚。作者利用膜片钳全细胞记录方法探讨了钙依赖型蛋白激酶（ＣＤＰＫ）是否参与了钙离子调节保卫细胞钾离子通道的信号转导过程。当胞内钙离子浓度为１．５μｍｏｌ／Ｌ时,保卫细胞全细胞内向钾电流被抑制约６０％;同时加入ＣＤＰＫ的底物组蛋白ⅢＳ或ＣＤＰＫ的底物竞争性抑制剂鱼精蛋白可完全逆转钙离子的作用;但在胞内同时加入纯化的ＣＤＰＫ蛋白则可进一步促进钙离子对保卫细胞内向钾电流的抑制。研究结果初步证明,ＣＤＰＫ介导了钙离子调节保卫细胞内向钾离子通道的信号转导过程     

日本血吸虫精氨酸转氨酶及鸟氨酸转氨酶的研究

从人工感染的家兎中取得日本血吸虫成虫,制成匀浆后在37℃测定鸟氨酸转氨酶活力,底物L-鸟氨酸及α-酮戊二酸的浓度各为0.017M,pH8.O。测定结果用微克分子/ 毫克氮/小时表示,测得酶活力的平均值雄虫为33.9,雌虫为29.0。此酶的最适pH为8.O—8.2。在对此测定中合抱虫的鸟氨酸转氨酶活力为谷氨酸丙酮酸转氨酸活力的1.5倍,谷氨酸草酰乙酸转氨酶活力的2.4倍。当用鸟氨酸分别与α-酮戊二酸、丙酮酸、草酰乙酸及乙醛酸进行测定时,测得的酶活力比值依次为100:6.2:1.8:4.2。磷酸吡哆醛能增高酶活力,羟胺则使之降低。氯化铜及对氯汞苯甲酸具有很强的抑制作用,在2×10~(-5)M的浓度下前者抑制78.5%,后者抑制31.6%。正缬氨酸及缬氨酸对此酶的抑制作用是竞争性的,当底物鸟氨酸的浓度减低时,抑制作用增强。南瓜子氨酸的抑制是非竞争性的,在O.017M的浓度下抑制酶活力29.5%。酒石酸锑钾(10~(-3)M)及呋喃丙胺(10~(-4)M)对酶活力无影响。在日本血吸虫中测不出精氨酸转氨酶的存在,以精氨酸为底物作转氨酶测定时所产生的谷氨酸是由于精氨酸酶和鸟氨酸转氨酶相继作用的结果。     

菝葜皂甙原对Na~ 、K~ -ATP酶抑制的动力学研究

本文对菝葜皂甙原抑制Na~ 、K~ -ATP酶的动力学与机理进行了研究,并且与哇巴因的抑制作用进行了比较。动力学研究表明菝葜皂甙原抑制Na~ 、K~ -ATP酶,对底物Na~ 、K~ 均为混合性抑制剂;而对ATP则为反竞争性抑制剂。观察了磷脂对哇巴因和菝葜皂甙原抑制Na~ 、K~ -ATP酶的影响。磷脂不影响哇巴因的抑制作用;但多种磷脂都不同程度地降低菝葜皂甙原对Na~ 、K~ -ATP酶的抑制作用。     

银离子对辣根过氧化物酶的影响

实验研究Ag 对HRP的影响对检测银的污染有重要意义。以ABTS[2,2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和H2O2为底物,在pH值5.0的条件下,用分光光度法考察了Ag 存在下的辣根过氧化物酶催化氧化反应。Ag 对辣根过氧化物酶的催化活性显示出抑制作用,并进一步分别探讨了对两种底物的抑制类型和对酶结构的影响。结果表明Ag 对底物H2O2而言,对酶的抑制效应属于反竞争性抑制类型,抑制常数Ki=14.83mmol/L;对底物ABTS而言,对酶的抑制效应属于非竞争性抑制,抑制常数Ki=16.139mmol/L。不同浓度Ag 分别与酶作用后,测定酶的内源荧光光谱。光谱结果表明Ag 影响酶活性的同时也影响酶的构象。