巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的质粒及nifHDK基因的定位

对从北京郊区玉米根际分离到的巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilente)Yu 62的质粒进行了分离和检测,发现检测方法不同,得到的质粒数目也不同,用Kado法只发现一个大质粒,以pABm 1表示,其分子量约为1 20 Md;而用改良的Eckhardt方法,则发现有5个大质粒,分别以p&Bm l、pABm 2、pABm 3、pABm 4和pABm 5表示,它们的分子量分别约为120 Md、330 Md、360 Md、480 Md和900 Md,部是巨型质粒,用多种方法检测均未发现小质粒。应用生物素标记的孩酸杂交技术制备了Biotin-nifHDK探针,并对Yu62菌株的质粒及染色体片段进行了Southern印迹杂交和斑点杂交,杂交结果表明nifHDK基因定位于染色体上。     

巴西固氮螺菌Yu62 draTG基因及其下游区域的定位诱变分析

用卡那霉素盒（Ｋｍ－ｃａｓｓｅｔｔｅ）插入法,对巴西固氮螺菌（Ａｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）Ｙｕ６２的ｄｒａＴＧ基因及其下游区域进行了诱变,并获得相应的突变株,研究表明ｄｒａＴ变突株的固氮酶活性不再受铵抑制,而ｄｒａＧ突变株在有铵时则丧失固氮酶活性,但当铵耗尽后却不能使像野生型菌株那样恢复活性,ｄｒａＴＧ下游区域突变株ＹＺ４（突变位点距ｄｒａＧ约２ｋｂ）在无氮及限铵条件下,其固氮酶     

巴西固氮螺菌巨大质粒的快速检测法

研究了巴西固氮螺菌(Rzosprrrllum brarrlense)巨大质粒的快速检测方法。由于巨大质粒(>1000Md)在提取过程中易于断裂,故用常规的方法不易得到满意的结果。本实验以较温和的Husch原位裂解法为基础,作了相应的改进,在电泳前采用0.05%SDS预洗及冻融处理,电泳时,先反向电泳”分钟,然后再正向电泳。所得结果重现率高,且方法简便易行。     

巴西固氮螺菌中吸氢酶基因同源性的分子检测

通过TTC(2 ,3,5 氯化三苯基氮唑 )实验筛选出 12株能产生吸氢酶蛋白 (Hup+ )的巴西固氮螺菌 (Azospir rilumbrasilense)菌株。用Qiagen柱分离提纯含豌豆根瘤菌的hup基因片段的质粒 pHVT10 9和pHVT115 ,并用地高辛标记法标记pHVT115 ,与 12株Hup+ 巴西固氮螺菌的总DNA进行斑点杂交 ,结果显示pHVT115所含的吸氢酶基因 (hup基因 )片段与巴西固氮螺菌的大部分菌株的hup基因同源性不强。这一结果表明hup基因在固氮生物中存在着遗传多样性 ,异源hup基因探针不一定都适宜于探测hup基因。     

固氮螺菌的固氮分子调控研究进展

本文对巴西固氮螺菌周氨基因的结构和调控进行综述。其固氮基因的调控可分为两种水平：通过DRAT-DRAG系统的翻译后水平和通过NifA蛋白的转录水平。通过NifA活性进行调控的机理目前尚不明了。     

巴西固氮螺菌ntrBC基因的克隆与核苷酸序列分析

以EMBL3为载体,构建了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Yu62的基因文库.以巴西固氮螺菌Yu62中PCR扩增出的450bp DNA 片断作为探针,对该基因文库进行筛选,得到了10个阳性克隆(EA1—EA10),其中含有两种不同类型的克隆,分别以EA4和EA9为代表.对EA4的杂交分析发现目的基因位于2.9kb EcoRI片段上.DNA序列分析结果表明该片段含有完整的ntrC编码区,其编码产物由480个氨基酸组成.分子量为53469;ntrC上游是完整的ntrB编码区,其编码产物由400个氨基酸组成,分子量为43487.对相应的NtrC和NtrB氨基酸序列进行同源性分析,说明巴西固氮螺菌与根瘤菌的亲缘关系较与其它自生固氮菌的更为接近.     

巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）吸氢酶基因的研究及展望

固氮生物在固氮过程中不可避免地将产生电子的消耗和能量的损失;固氮酶每转化一分子儿为氨需消耗4对电子和16个ATP,同时释放出一分子H2。而吸氢酶对所产生氢气的氧化作用可提供固氮过程中所需的还原力,从而提高了固氮微生物的固氮效率。通过分子生物学的实验手段可进行巴西固氮螺菌吸氢酶基因（hup基因）的定位和分离克隆,并进一步构建含多拷贝hup基因的固氮基因工程菌,为提高固氮效率,增加农作物经济产量提供一种有效的氮素营养供给手段。氛是植物生长发育不可缺少的元素。氮气虽然占空气重量的75．54畅,但植物和大多数微生物都不…     

杀鞘翅目幼虫Bt菌株YM—03的δ—内毒素基因定位

苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的morrisoni亚种YM－03（8a8b）是本实验室分离的对鞘翅目幼虫有高毒力的菌株。经PCR产物分析它含有cry3A基因,产生68ku的毒素蛋白。经质粒图谱分析,该菌株含有3个质粒,其大小分别为83,72,9Mu。以cry3A基因的PCR产物片段为模板标记探针,与YM－03总DNA杂交,结果显示该菌的δ－内毒素基因定位于染色体上,有望构建出稳定遗传的广谱工程菌。     

肿瘤抑制基因APCmRNA在豚鼠脑中的分布

APC基因是1991年被发现的一类肿瘤抑制基因,它被定位于人第5号染色体5q21处。APC基因如发生缺失或突变,则易患直肠肿瘤,并伴有部分先天痴呆的病例。本工作在孟帆已获得的APC基因在豚鼠中的同源cDNA的基础上,完成了对它的亚克隆,并利用原位杂交和RNA酶保护分析的方法,对它在脑中的分布进行了研究。发现APCmRNA主要在海马、大脑和小脑中表达;嗅球中杂交信号稍弱,脑干中最弱。海马中阳性细胞主要是锥体细胞,小脑中则主要是内层颗粒细胞。在一个月大的豚鼠胚胎的脑中也观察到相似的表达型式。进一步的研究有助于我们更好地了解神经发育和先天痴呆发生的分子机制。     

豌豆间期细胞核内核仁组织者区排列的非放射性原位杂交定位

以异羟基洋地黄毒甙(digoxigenin)标记的rRNA为探针与多聚甲醛固定的植物根尖振动切片原位杂交。结合免疫荧光检测分析了豌豆(Pisum sativum)间期细胞核内核仁组织者区的数目、分布和排列。研究结果发现豌豆根尖分生组织间期细胞核内有1—6个被探针分子强烈标记的位点。这些位点呈大小不等(0.24-1.98μm~3)的斑点状,分布在核仁的周边,并且与核仁相连。探针标记位点在核仁周边的排列方式随标记位点的数目不同而异。在具有四个标记位点的细胞核内,它们呈四面体,梯形或平行四边形排列。在显示原位杂交阳性的细胞核中,59.5%显示4个标记位点,少于或多于4个标记位点的细胞分别占35.7%和4.76%。探针标记位点的数目与标记位点本身的大小无明显联系,而与核仁的体积大体上呈负相关趋势。文章讨论了这些被rRNA探针标记的位点与核仁组织区及核仁形成的关系。     

动脉粥样硬化病人LDL受体基因启动子序列的高甲基化改变

探讨动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）病人LDLR基因启动子区12个CpG二核苷酸结构甲基化的改变。改进并联合应用巢式、Touchdown—PCR,甲基化敏感单链构象分析法（methylationsensitive—single—stand conformation analysis,MS—SSCA）,对61例AS病人及28例健康对照者的LDLR基因启动子区CpG岛的甲基化状态进行检测。在AS患者中发现三种不同的甲基化模式,即完全甲基化、部分甲基化和非甲基化。61例AS患者中有2例完全甲基化,13例部分甲基化,其余为非甲基化．甲基化率为24．59％;28例正常对照者中仅1例发生部分甲基化,甲基化率为3．57％。两组甲基化率差异有显著性（P〈0．05）。AS病人LDLR基因启动子区甲基化程度增高,在LDLR基因调控区的高甲基化修饰可能参与了AS的发病。同时,改进并联合应用的巢式PCR、Touchdown—PCR．MS—SSCA法降低了对DNA模板严格度的要求,提高了灵敏度和特异性,在检测基因甲基化中具有方便、经济、效率高的优点,有良好的应用前景。     

巴西固氮螺菌Yu62nifA基因克隆、测序及功能分析

用TD-PCR法克隆了巴西固氮螺菌(Azospirillun brasilense)Yu62的nifA基因.序列分析表明它与巴西固氮螺菌Sp7的nifA序列高度同源(96.5%),其编码的产物NifA蛋白与Sp7菌株NifA的氨基酸序列同源性为97.6%.该基因可以完全互补巴西固氮螺菌Sp7 nifA-突变株的Nif-表型.研究了NH4+和O2对Yu62 nifA基因的表达及NifA活性的影响.结果表明mfA基因在Yu62菌株中是部分组成型表达的,氨和氧不能完全阻遏其表达,在5mmol/LNH4Cl与微氧(0.5%O2)条件下表达最高;NifA蛋白在0.4%～0.5%O2时活性最高,氧分压降低和提高都使NifA活性下降,1mmol/L NH4Cl足以抑制NifA的活性.     

麦迪霉素产生菌酮基还原酶基因在大肠杆菌中的表达

用PCR法扩增麦迪霉素产生菌酮基还原酶（MKR）基因,得到约0．8kb的DNA片段,扩增片段重组到利用依赖T7RNA聚合酶的高效表达载体pT7－7中,在大肠杆菌中表达出28．9kD的蛋白质。表达的蛋白质具有生物活性。     

用非放射性原位杂交在同一张切片上同时在光学和电子显微镜下显示的豌豆rDNA的分布(简报)

原位杂交目前已成为研究各类组织或细胞内DNA或RNA定位最有效的手段,特别是在发育生物学领城,对于研究基周的表达和修饰更具有重要意义。旱期的原位杂交主要是在     

美洲拟鲽抗冻肽基因在E.coli中的表达

动物抗冻肽(AFP)能降低动物体液冰点而使其能在寒冷的环境中生活,因而AFP在防寒抗冻方面有较大的应用潜力。根据美洲拟鲽AFP基因的cDNA序列,人工合成了AFP及其含前导序列的proAFP的cDNA,并构建成pAFP及pPAFP原核表达载体。由于AFP表达量少且蛋白分子很小,用SDS-蛋白电泳难以检测。为了提高检测的灵敏度,把报道基因CAT的cDNA按读码框连接到AFP的3′末端,构建成融合基因表达载体pAFP/CAT和pPAFP/CAT。在大肠杆菌表达系统JM109(DE 3)中诱导表达。结果表明,融合蛋白AFP/CAT和proAFP/CAT具有明显CAT活力。这表明AFP和proAFP可以在大肠杆菌中表达。     

苎麻疫霉激发蛋白基因断裂现象初探

苎麻疫霉（PhytophthoraboehmeriaeSaw．）可分泌具有诱抗作用的激发蛋白（α－elicihn）,根据α－elicitin第24～30和56～63位保守区氨基酸推导的寡核苷酸引物序列,对苎麻疫霉基因组DNA进行特异PCR扩增反应,发现其扩增的DNA片段大于预计的片段。回收纯化的特异扩增DNA,并进行克隆和测序分析,结果表明特异扩增的elicihn基因亚克隆DNA为570hp,大于预计的117bp。在特异片段中,存在3个内含子将基因断裂成4个阅读框架,即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4,其中ORF1和ORF4含有与引物相同的序列,但与其它序列与已克隆的elicihn基因无同源性。因此,芒麻疫霉基因组中的elicitin基因可能存在断裂现象。