鼠mPC-1基因的克隆与特性分析

为深入研究人前列腺癌相关基因PC-1的生物功能和进化保守状况,从小鼠肾脏中克隆了全长cDNA序列,命名为mPC-1（GenBank Acc No.AY048852）.mPC-1基因cDNA全长为2 193 bp,主要定位于小鼠染色体3A1-A2区域.mPC-1基因最大开放阅读框编码的蛋白质由224个氨基酸组成,与人PC-1蛋白编码区存在82%的序列一致性,含有coiled-coil结构域和PEST结构域.生物信息学分析表明,由6个外显子组成的mPC-1基因与mD52高度同源,其中,第一外显子代表该基因的特异性序列,实验证据显示mPC-1基因具有自己的启动子,推测mPC-1与小鼠mD52可能是重叠基因.对小鼠20种组织器官和不同发育阶段的胚胎组织cDNA的RT-PCR检测证实,该基因主要在前列腺、肾和眼组织中表达,在胃和平滑肌中有少量表达,在其他组织中表达很弱或不表达.而mD52基因则几乎广泛存在于小鼠的各个组织器官中,因此,两个基因虽然序列上高度重叠却是独立调控的.综上所述,mPC-1基因可能是一个与人PC-1基因结构功能类似的新基因.     

草莓miR390靶基因TAS3的克隆及表达分析

以栽培草莓品种‘全明星’为试材,通过3′-和5′-RACE技术克隆出miR390靶基因TAS3的cDNA全长,命名为FaTAS3。序列分析发现:草莓TAS3基因的cDNA全长为742 bp,含有16个碱基的Poly A尾巴及2个高度保守的ta-siRNA产生位点和1个miR390靶位点;该基因DNA全长为824 bp,5′ 端130 bp处有一个98 bp的内含子序列。生物信息学软件预测显示,草莓TAS3基因的启动子除具有TATA/CAAT-box外,还含有G-box、C-box等特异作用元件。实时定量RT-PCR结果表明,草莓miR390与靶基因TAS3间的表达模式与拟南芥中的表达模式相同,推测草莓TAS3基因的生物合成也受miR390的指导。     

辣椒CaWRKY14转录因子的生物学特性研究

WRKY转录因子是植物响应病原菌胁迫最重要的转录因子之一,且参与抗病反应及信号传导通路的调控。为研究辣椒WRKY基因的生物学特征,以辣椒高抗疫病材料CM334为试材,克隆获得响应疫霉菌诱导的转录因子CaWRKY14。生物信息学分析表明,该基因DNA全长2 530 bp,cDNA全长1 662 bp,含有5个内含子,编码553个氨基酸,含有1个WRKY保守结构域,属于Group Ⅱ(b)。实时荧光定量表达分析表明,CaWRKY14不仅受ABA和疫霉菌胁迫诱导表达,且表达量分别在12 h和24 h时达到峰值,分别是对照的8.54和8.04倍,同时也受高盐、热激和干旱胁迫诱导。利用VIGS技术对CaWRKY14转录因子进行沉默后发现,抗病材料CM334接种疫霉菌后趋于发病。研究表明,CaWRKY14基因在辣椒响应疫霉菌胁迫进程中可能发挥着重要作用。     

梅花2个SVP基因的克隆与表达分析

SVP (SHORT VEGETATIVE PHASE)是MADS box家族一员,它能够整合多条开花途径的开花信号,调节植物由营养生长向生殖生长的转变。为了解梅花(Prunus mume Sieb. et Zucc.)成花转变过程的分子机理,该研究采用RT PCR方法从梅花‘长蕊绿萼’中克隆到2个SVP的同源基因,分别命名为PmSVP1和PmSVP2,并采用荧光定量PCR对2个基因的表达模式进行分析。序列分析表明,PmSVP1和PmSVP2的编码区长度分别为687 和672 bp,分别编码228和223氨基酸。系统进化结果显示,PmSVP1与拟南芥AtSVP以及一些木本植物SVP同源基因聚为一组,PmSVP2与马铃薯、乳浆大戟等草本植物中的SVP同源基因聚为一组。实时荧光定量分析表明,在成年梅花中,2个PmSVP基因主要在茎、叶和叶芽等营养器官中表达,且都在叶中表达量最高。在1月龄幼苗中,PmSVP1基因在根、茎、叶中都有表达,PmSVP2基因则没有任何表达;在梅花花芽分化过程中,PmSVP1和PmSVP2基因的表达量均呈现下调表达的趋势。研究推测,PmSVP1和PmSVP2基因可能参与调控梅花从营养生长向生殖生长的转变。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp~76bp之间,且其序列均符合5'-gt…ag-3'规则。     

粗毛栓菌诱变菌株SAH-12漆酶基因的克隆与序列分析

粗毛栓菌Trametes gallica诱变菌株SAH-12是通过紫外诱变选育得到的漆酶高产菌株。为了对其漆酶基因进行研究和利用,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,从T.gallica诱变菌株SAH-12分离得到漆酶基因全长cDNA Lacc1(GenBank accession No.DQ431716)及其对应的结构基因Lac1(DQ431715)。该基因属于真菌漆酶基因家族,与来自出发菌T.gallica漆酶基因lacA(AY875867)在成熟肽编码区的同源性最高(一致性为98%)。Lacc1全长1891bp,由40bp的5'-UTR、1554bp的完整ORF和297bp的3'-UTR构成,具有polyA加尾信号AATACA和59bp的polyA结构;其完整ORF可编码21个氨基酸残基组成的信号肽和496个氨基酸残基组成的成熟蛋白。在Lacc1基因的推导氨基酸序列中有4个潜在的N-糖基化位点和4个参与二硫键形成的Cys残基,且含有真菌漆酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型铜离子结合区的4个高度保守序列。结构基因Lac1全长2338bp,含10个内含子和11个外显子,各内含子长度在51bp~76bp之间,且其序列均符合5'-gt…ag-3'规则。     

WRKY同源基因的分离与表达分析

以(Prunus salicina Lindli.var cordataJ.Y.Zhang et al.)为试验材料,采用稀释池PCR法,筛选叶片全长均一化cDNA文库,获得了WRKY同源基因的12个全长cDNA分别命名为PsWRKY7、PsWRKY14、PsWRKY20、PsWRKY21、PsWRKY22、PsWRKY29、PsWRKY31、PsWRKY32、PsWRKY33、PsWRKY40、PsWRKY46和PsWRKY75,长度分别为1 517、1 798、2 098、1 177、1 242、1 396、2 135、1 760、2 113、1 047、1 258和700bp,ORF长度分别为1 095、1 572、1 764、1 068、1 071、1 002、1 944、1 602、1 770、963、1 077和672bp,分别编码364、523、587、355、357、333、647、533、589、320、358、223个氨基酸。荧光定量结果显示,12个WRKY同源基因在1.0mmol/L水杨酸处理后,所获得的PsWRKY表达量均显著上调,表明WRKY基因可能是水杨酸诱导防御反应的重要调控因子。     

白菜BcMAF2基因克隆及功能验证

为了揭示白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino）开花调控转录因子（MADS AFFECTING FLOWERING 2）MAF2在开花过程中的作用,该研究通过同源克隆的方法获得BcMAF2基因的全长序列。结果表明：（1）BcMAF2基因含有1个长度为588 bp开放阅读框,编码196个氨基酸;将BcMAF2蛋白氨基酸序列与其他物种MAF2氨基酸比较表明,BcMAF2基因与其他物种中该基因具有高度保守的结构域。（2）将BcMAF2与YFP和HA标签融合,构建亚细胞定位载体pEarleyGate101 BcMAF2 YFP HA,采用农杆菌介导法将其瞬时表达于本氏烟草（Nicotiana tabacum）叶片中,激光共聚焦显微镜观察发现BcMAF2蛋白定位于细胞核中,表明BcMAF2符合作为转录因子的功能。（3）将BcMAF2基因遗传转化拟南芥中进行功能验证,通过蛋白印迹试验获得5个过表达株系,且在选取的蛋白表达量较高的第8、10株拟南芥中均表现出明显延迟其抽薹开花表型。研究推测BcMAF2基因可能参与植物开花的春化途径。     

龟裂链霉菌中zwf基因的克隆及其生物信息学分析

利用RT-PCR技术、巢式PCR技术、3′-RACE和5′-RACE技术从龟裂链霉菌K-16菌株中克隆获得zwf基因的全长cDNA序列。测序结果表明：经软件Vector NTI 11.0拼接zwf基因全长cDNA序列为1 679 bp,并带有一段很短的poly(A)尾巴,包含1 347 bp的开放读码框(ORF),编码一个含449个氨基酸残基的蛋白质。Blast2go生物信息学分析结果表明：该基因编码的酶为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,通过KEGG代谢途径注释明确该基因编码的酶是参与谷胱甘肽代谢和磷酸戊糖途径代谢的关键酶。     

黄毛草莓FnMYB24转录因子基因和启动子的克隆及表达分析

该研究以黄毛草莓(Fragaria nilgerrensis Schltdl.)为材料,采用RT PCR技术克隆了黄毛草莓FnMYB24基因的cDNA和启动子序列。生物信息学分析表明,FnMYB24的cDNA序列长为1 033 bp(GenBank登录号为MN879283),其开放阅读框(ORF)长为609 bp,编码202个氨基酸,含有1个保守的MYB_DNA binding结构域。同源分析结果显示,黄毛草莓FnMYB24基因编码的氨基酸序列与森林草莓(Fragaria vesca)编码的氨基酸相似性较高;同时进一步克隆了该基因编码起始位点上游长度为718 bp启动子序列(GenBank登录号为MN879285),预测该序列包含激素响应元件、光调控元件等多个顺式作用元件。通过构建pFnMYB24∷GUS表达载体进行烟草瞬时转化,发现pFnMYB24启动子具有转录活性且能够驱动FnMYB24基因表达。实时荧光定量PCR结果显示：抗病品种黄毛草莓和易感病栽培品种‘妙香3号’的叶片接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后MYB24基因表达量均有上调,但‘妙香3号’的MYB24表达量始终低于黄毛草莓的表达量;SA处理后2个草莓品种的MYB24表达量均高于对照组,表明MYB24基因受水杨酸(SA)的诱导表达。研究表明,草莓MYB24基因可能参与调控抗炭疽病,为进一步研究MYB24基因在草莓抗炭疽病中的功能奠定了基础。     

沙田柚无机焦磷酸酶基因的cDNA克隆及序列分析

植物自交不亲和性是植物生殖过程中普遍存在的一种现象,是植物特异性识别并拒绝自身花粉或亲缘关系很相近的花粉的一种遗传机制。无机焦磷酸酶(inorganic pyrophosphatase,IPPase)在植物生长发育方面起重要作用。该研究根据沙田柚花柱消减文库中EST序列(无机焦磷酸酶基因内部片段),设计了2对特异引物5'-GSP1,5'-n GSP1,3'-GSP2 and 3'-n GSP2,通过SMART-RACE PCR技术从所构建的沙田柚花柱抑制性消减文库中克隆了沙田柚无机焦磷酸酶基因的c DNA全长序列,利用Blastn、DNAman和Expasy软件对所克隆的基因进行同源性分析,以及基因编码的氨基酸的分子量、等电点、疏水性等理化性质分析。结果表明:IPPase基因c DNA全长为1 136 bp(Gen Bank登录号为KF990474),开放阅读框(ORF)全长为654 bp,共编码217个氨基酸,包括170 bp 5'UTR和312 bp的3'UTR;编码的蛋白质的分子量为24.4 k Da,等电点为5.96;蛋白结构域分析显示沙田柚IPPase与焦磷酸酶具有相同的保守结构域;对沙田柚IPPase蛋白质序列进行疏水性分析,结果表明沙田柚IPPase基因编码的肽链中疏水性最大值约为3.21,最小值约为-2.98,属于亲水性蛋白,无跨膜区域;Blastn搜索的结果显示,沙田柚IPPase基因序列与多种植物的IPP基因高度同源;序列分析表明,沙田柚IPPase基因核苷酸的同源性与毛果杨(Populus trichocarpa)和橡胶树(Hevea brasiliensis)IPPase基因均为87%;氨基酸序列与克莱门柚(Citrus clementina)无机焦磷酸酶完全一致。该研究结果可为深入研究无机焦磷酸酶在沙田柚自交不亲和中的作用机理提供基础。     

鹅掌楸LcUGE基因的克隆和组织表达分析

为了解鹅掌楸(Liriodendron chinense)的UGE基因功能,采用RACE和EPIC-PCR技术克隆到2个UGE基因,命名为LcUGE1和LcUGE2。结果表明,LcUGE1基因的c DNA全长为1 531 bp,包含1 050 bp的开放阅读框,编码349个氨基酸, gDNA长度为11 920 bp;LcUGE2基因的c DNA长度为1 378 bp,包含1 056 bp的开放阅读框,编码351个氨基酸,g DNA长度为6544 bp。LcUGE1和LcUGE2基因均含有9个外显子和8个内含子,且外显子长度和内含子剪切位点序列几乎一致,但内含子片段长度存在显著差异。编码的LcUGE1和LcUGE2蛋白高度保守,保守性达到82%。LcUGE1基因在雄蕊中表达量最高,而LcUGE2基因则在花萼中表达量最高。这表明LcUGEs基因可能参与鹅掌楸的生殖发育过程。     

富士苹果MdAPETALA2基因的克隆与表达分析

基于苹果基因组测序序列,从‘长富6号’富士苹果中分离了MdAPETALA2基因序列,通过生物信息学方法分析结构特征,利用实时荧光定量RT-PCR技术研究其在不同器官中的表达特性。结果表明:(1)MdAPETA-LA2基因cDNA序列为1 614bp,该基因最大开放阅读框为1 389bp,编码462个氨基酸,含有2个保守的AP2结构域和核定位信号;其编码区含有8个内含子和9个外显子;启动子区域含有许多光响应元件,如ATCT-motif、G-Box、GA-motif、I-box、Sp1、TCCC-motif等,以及水杨酸响应元件、赤霉素响应元件、防御和逆境响应元件等。(2)MdAPETALA2基因在苹果各种器官中均有表达,但不同组织中表达量存在差异,在种子中的表达量最高,其次是根和花,在叶和茎中的表达量最低;在花药中的表达量最大,其次是花托和子房,在花瓣、花梗和花柱中的表达量相对较少。(3)苹果MdAPETALA2基因属于AP2亚族,可能在种子的发育过程中起着非常重要的作用。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究

利用RACE结合RT-PCR技术,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)总RNA中扩增得到长度为1234 bp的WRKY基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对,该序列推导的氨基酸序列与蓖麻、白杨的WRKY同源性分别为79%和73%,表明分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因,命名为HbWRKY1。通过构建pCAMBIA1304-HbWRKY1植物表达载体,经农杆菌GV3101介导,将HbWRKY1基因导入烟草(Nicotiana tabacum)中,对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR鉴定。结果表明,HbWRKY1基因已整合到65株转基因植株中。干旱胁迫试验表明,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力。这说明WRKY基因与橡胶树抗旱能力之间存在一定的关系。     

青花菜BoSCL3基因的克隆和渍水胁迫下的表达特征分析

为了解SCL3 (scarecrow-like 3)基因的功能,从青花菜(Brassica olreacea var. italica)中克隆得到1个SCL3基因,命名为BoSCL3,其cDNA全长1 355 bp,编码446个氨基酸。BoSCL3分子量为49.96 kD,为疏水性蛋白,与油菜(B. napus)、芜菁(B. rapa)中SCL3蛋白的亲缘关系最近,同科植物的SCL3具有较高的同源性。荧光定量PCR分析结果表明,青花菜BoSCL3基因表达量随渍水胁迫时间延长先下降后上升,推测其可能参与渍水胁迫响应。这为探讨青花菜BoSCL3基因响应渍水胁迫的分子机制提供理论依据。     

麻竹miR172a靶基因DlAP2的克隆及其表达

为了解开花麻竹(Dendrocalamus latiflorus)的Dl AP2基因功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆了mi R172a靶基因AP2同源序列c DNA全长,命名为Dl AP2。结果表明,Dl AP2基因c DNA全长为1729 bp,包含5′端非编码区81 bp、开放阅读框1464 bp、3′端非编码区160 bp和24个碱基的Poly A尾巴,在编码框靠近3′端130 bp处有1个高度匹配mi R172a的结合位点(CTGCAGCATCATCAGGATTCT)。Dl AP2编码487个氨基酸的蛋白,具有两个AP2结构域,属于AP2/ERF家族AP2亚家族的AP2组,与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有较高同源性。RLM-5′RACE分析表明,mi R172a主要在靶序列的第11~12个碱基之间剪切靶基因Dl AP2的mi RNA。q RT-PCR结果表明,麻竹花芽中Dl AP2基因的表达规律与mi R172a表达变化正好相反,证明mi R172a对Dl AP2基因的表达具有调控作用。     

中间锦鸡儿转录因子基因 CiNAC1的克隆及功能分析

NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,在植物应答非生物胁迫和生长发育过程中有重要的功能。该研究通过PCR技术,克隆得到了中间锦鸡儿 CiNAC1基因1 066 bp的cDNA全长序列。生物信息学分析显示, CiNAC1基因的开放阅读框(ORF)为921 bp,编码306个氨基酸,推导的蛋白分子量为34.57 kD,等电点为8.35,是一种亲水性蛋白,N端具有保守的NAM结构域,具有26个磷酸化位点和7个糖基化位点。实时荧光定量PCR检测显示,中间锦鸡儿 CiNAC1基因表达受干旱、高盐、脱水、高pH诱导;亚细胞定位发现CiNAC1定位到细胞核中,这与它作为转录因子的功能是一致的;转CiNAC1基因拟南芥株系侧根数目显著多于野生型,根长也明显比野生型长。研究认为, CiNAC1基因可能与中间锦鸡儿响应逆境胁迫机制有关。     

牛樟芝萜烯合成酶基因的克隆与鉴定

为了研究牛樟芝(Antrodia camphorata)倍半萜的生物合成,通过对牛樟芝基因组分析获得倍半萜类合成酶基因(AcTPS2),利用RT-PCR克隆获得其全长cDNA,对其进行生物信息学分析和表达谱分析。结果显示:AcTPS2基因cDNA全长1 068bp,Blast比对发现,AcTPS2含倍半萜类合成酶所独具的富含天冬氨酸序列DXXXD及萜类合成酶特有的RRDTSG-LDL保守序列;系统进化分析显示,AcTPS2基因与其他真菌的倍半萜聚为一类;表达谱分析显示,以甘露糖作为碳源、以酪蛋白胨作为氮源能够有效促进AcTPS2基因的诱导表达。研究结果可为以后牛樟芝倍半萜类生物合成提供一定的参考依据。     

长春花丙二烯氧化物合酶基因的克隆与表达

利用RT-PCR和RACE相结合的方法,从长春花中克隆了丙二烯氧化物合酶(AOS)基因。结果显示:长春花AOS基因(CrAOS)cDNA全长为2 118bp,包括5′和3′非翻译区,polyA尾和一个长1 638bp的开放阅读框,其基因组中不含内含子;CrAOS基因编码的蛋白含545个氨基酸。多重比对表明CrAOS蛋白与其他的AOS蛋白具有较高的相似性,CrAOS蛋白序列中含有AOS家族应有的保守氨基酸残基。Southern杂交表明:CrAOS基因在长春花中为低拷贝。qRT-PCR结果显示:CrAOS在各个组织均有表达但表达量存在差异,在老叶中最高,在幼花中表达最低。对长春花幼苗进行不同处理,结果表明:伤害、低温、甲基茉莉酸、乙烯利处理等可使CrAOS基因表达量显著提高,水杨酸处理对基因表达影响不大。     

思茅松HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

1-羟基-2-甲基-2-E-丁烯基-4-焦磷酸还原酶(HDR)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中的最后一个酶,在植物萜类生物合成中起主控作用。该研究根据思茅松(Pinus kesiya var.langbianensis)树皮转录组数据分析结果,首先获得了思茅松HDR基因片段,然后根据所获得的基因片段设计特异引物,提取受伤后的思茅松树皮的RNA,并运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的HDR基因(Pk HDR)。生物信息学分析表明:克隆获得的Pk HDR1基因c DNA全长序列为1 876 bp,含有1个1 464 bp的开放阅读框(ORF),编码487个氨基酸。同源性分析结果表明:思茅松HDR蛋白与赤松(Pinus densiflora)HDR蛋白的相似性高达99%。亚细胞定位及结构域分析结果表明:思茅松Pk HDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A61)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A143,A234,A288,A371)。系统进化分析结果表明:Pk HDR蛋白与赤松HDR蛋白的亲缘关系最为接近。半定量PCR检测结果表明:树皮的创伤促进思茅松HDR基因的表达。该研究成功克隆获得HDR基因,并确定其与松脂代谢密切相关,为阐明思茅松松脂生物合成机制和分子育种提供了参考。