鲍特氏百日咳杆菌纯组分在测试百日咳菌苗毒性的体重增加试验中的作用

<正>大多数通用的百日咳菌苗是灭活的全细胞制剂,这种制剂中的百日咳杆菌已通过加热或用适当的化学试剂处理过。所以这些菌苗含有许多百日咳杆菌的组分,如百日咳毒素(PT)、脂多糖(LPS)和丝状血凝素(FHA)。百日咳毒素是一种具有广泛生物活性的物质,它曾被命以不同的名称:淋巴细胞增多促进因子、胰岛激活蛋白、组氨敏感因子、百日咳原及百日咳毒素。     

小菜蛾中肠Polycalin蛋白的基因克隆、表达及与Cry1Ac毒素的结合特性分析

【目的】Polycalin蛋白是一种新发现的Bt毒素受体,可能与昆虫对Bt的抗性有关。本研究旨在明确小菜蛾Plutella xylostella Polycalin蛋白与Bt Cry1Ac毒素的关系。【方法】本研究通过PCR结合RACE技术从小菜蛾3龄幼虫中肠克隆获得Polycalin蛋白基因的全长cDNA序列,采用实时定量PCR技术研究Polycalin蛋白在小菜蛾不同发育阶段、4龄幼虫不同组织及用不同浓度Cry1Ac毒素饲喂3龄幼虫后的表达量。提取小菜蛾幼虫中肠的刷状缘膜囊泡(BBMV),运用合成多肽的方法制备Polycalin蛋白抗体,利用Western blot和Ligand blot技术对小菜蛾Polycalin蛋白进行鉴定,分析其与Cry1Ac毒素的结合特性。【结果】克隆得到的小菜蛾Polycalin蛋白基因的cDNA序列全长为9 102 bp(GenBank登录号:MF138149),其中,开放阅读框为8 778 bp,编码2 925个氨基酸;预测蛋白质分子量为326.38 kD,等电点为4.39;在推导的氨基酸序列中,前20个氨基酸为N-末端信号肽序列,含有14个N-糖基化位点,67个O-糖基化位点,6个脂质运载蛋白特征序列,6个脂质运载蛋白位点和13个类脂质运载蛋白结构域,并且在第20和21位(TSG-QVV)氨基酸之间存在一个裂解位点,在C-末端存在2个GPI结合位点,具有Bt毒素受体的特征。该蛋白在幼虫期的表达量较高,尤其在3龄幼虫体内表达量最高,在蛹和成虫中的表达量最低;在4龄幼虫的头、胸、腹中均有表达,在幼虫腹部中的表达量最高;3龄幼虫取食不同浓度的Cry1Ac毒素后,Polycalin蛋白的表达量下降,且Cry1Ac毒素浓度越高,下降越明显。通过Western blot检测到小菜蛾中肠刷状缘膜囊泡(BBMV)上存在大约300 kD的Polycalin蛋白条带;Ligand blot实验证明了小菜蛾Polycalin蛋白能与Cry1Ac毒素结合。【结论】本研究首次初步明确了小菜蛾Polycalin蛋白具有与Bt毒素结合的特性,为研究Bt对昆虫的作用机理和利用Bt防治害虫提供一定的理论基础和参考价值。     

含分子内佐剂的SARS-CoV-2 RBD域重组蛋白制备及免疫效果评价北大核心CSCD

制备含破伤风毒素肽(tetanus toxin,TT)、促吞噬肽(tuftsin)和新型冠状病毒刺突蛋白(spike,S蛋白)受体结合域(receptor-binding domain,RBD)的融合蛋白,探讨分子内佐剂对RBD蛋白体液免疫和细胞免疫效果的影响。将破伤风毒素肽、促吞噬肽与S蛋白RBD区域通过柔性多肽串联,密码子优化后构建重组载体,原核表达纯化制备重组S-TT-tuftsin蛋白,与铝佐剂混合后免疫BALB/c小鼠,对其体液及细胞免疫效果进行评价。重组S-TT-tuftsin蛋白以包涵体形式表达,离子交换层析纯化后采用梯度透析进行复性,复性蛋白经Dot blotting鉴定,可与新冠亚单位疫苗(安徽智飞公司)免疫后人血清发生反应。小鼠免疫实验结果表明,免疫35 d时抗体水平到达平台期,含分子内佐剂重组蛋白(铝佐剂)免疫小鼠后血清ELISA抗体效价高达1︰66240,显著高于S-RBD蛋白(铝佐剂)免疫小鼠抗体效价(P<0.05)。同时,含分子内佐剂重组蛋白刺激小鼠产生更强的淋巴细胞增殖能力,刺激指数可达4.71±0.15,相较于S-RBD蛋白的刺激指数1.83±0.09具有显著性差异(P<0.0001)。分子内佐剂破伤风毒素肽和促吞噬肽可显著增强新冠S蛋白RBD域的体液免疫和细胞免疫效果,可为新冠亚单位疫苗和其他病毒亚单位疫苗的研制提供理论基础和参考。     

用三种不同方法生产的BT(库斯塔克变种)制剂及其对家蚕的毒力

一前言在微生物杀虫剂中,苏芸金杆菌是最成功的商品制剂。活孢子和足量的σ-內毒素是该产品主要的毒素成分。众所周知,产品的毒力是根据菌株(不同菌株及同一菌株的不同株系)、培养基和生长条件的不同而异(Dulmage and Rhodes,1971)。但是,使用相同菌株在体外和体内条件下的培养物所进行的毒性比较尚未见报道。最近,我们用苏芸金杆菌(简称     

嗜线虫致病杆菌HB310菌株杀虫蛋白的纯化及活性鉴定

嗜线虫致病杆菌Xenorhabdus nematophila HB310是从河北省土壤中筛选出的一株昆虫病原线虫体内分离纯化获得的共生菌,该菌的发酵液对多种昆虫有较高的杀虫活性。利用85％饱和度的硫酸铵盐析分别获得胞内蛋白提取物和上清液中胞外蛋白提取物,生测结果表明这两种蛋白提取物中都含有胃毒素和血腔毒素。通过制备型非变性凝胶电泳对蛋白提取物进行分离和纯化,得到了3种有杀虫活性的毒素蛋白（毒素Ⅰ、毒素Ⅱ和毒素Ⅲ）,胞内的毒素蛋白与分泌到胞外上清液中的毒素蛋白是同种蛋白。毒素Ⅰ和毒素Ⅱ对棉铃虫初孵幼虫有明显的胃毒活性,但没有血腔毒性;毒素Ⅲ对大蜡螟幼虫有很强的血腔毒性,LD₅₀为0.18 μg/头。SDS-PAGE图谱显示毒素Ⅰ和毒素Ⅱ是由多个多肽组成的复合蛋白,而毒素Ⅲ只分离出一条多肽。毒素Ⅱ在50℃处理10 min,其杀虫活性没有显著变化;70℃处理10 min对毒素Ⅲ杀虫活性没有显著影响。     

毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。     

重组肺炎支原体CARDS毒素蛋白临床检测应用的初步研究

目的初步探讨肺炎支原体CARDS毒素蛋白在检测肺炎支原体感染中的应用价值。方法 PCR扩增CARDS毒素基因并连接到PMD-19-T载体,经酶切、PCR及核苷酸测序分析后,将CARDS毒素基因片段克隆到pGEX-6p-1表达载体内并转入受体菌。IPTG诱导大肠埃希菌BL21重组株(pGEX-6p-1-CARDS)的表达。GST柱层析纯化重组CARDS毒素蛋白,以该重组蛋白和重组P1蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测85份感染肺炎支原体的血清标本,并与重组P1蛋白的ELISA结果进行比较。结果 CARDS毒素蛋白表达载体构建成功并表达大小为43kDa的重组蛋白,Western blot测定其能与兔抗Mp多价抗血清发生反应。ELISA结果显示,CARDS毒素蛋白的阳性率为70.59%(60/85),重组P1蛋白的阳性率为63.53%(54/85)。结论本研究成功构建了CARDS毒素蛋白表达载体并获得了稳定表达的重组菌株;在诊断肺炎支原体感染的血清学ELISA试验中,重组CARDS毒素蛋白的敏感性高于重组P1蛋白,为Mp感染的诊断提供了新的可用抗原。     

不相容双质粒共表达霍乱毒素类似嵌合蛋白

霍乱毒素由5个B亚基(CTB)和l个A亚基(CTA)(包括CTA1和CTA2)组成。该蛋白结构可帮助有毒的CTA1分子进入细胞。本研究拟利用原核不相容双质粒共表达系统获得霍乱毒素类似嵌合蛋白,用于大分子蛋白质黏膜给药的载体研究。将CTB基因片段克隆至载体p ET-28a中,获得重组质粒p ET-28a-CTB;以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)代替有毒的CTA1,在CTA2序列N端融合穿膜肽(TAT),将EGFP-CTA2-TAT基因克隆至载体p ET-22b(+)中,获得重组质粒p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT。利用p ET-28a-CTB和p ET-22b-EGFP-CTA2-TAT二者不同抗性,将双质粒分步转化到大肠杆菌BL21中。表达条件为0.75 mmol/L IPTG、20℃、200 r/min诱导20 h,重组嵌合蛋白能以可溶形式表达。经过Ni-NTA、Sephadex G-75纯化,Western blotting对蛋白质特异性进行鉴定,确定获得(CTB)5/EGFP-CTA2-TAT嵌合蛋白。     

球形芽孢杆菌C3-41菌株杀蚊毒素的提取及其同源性研究

从球形芽孢杆菌C3-41菌株芽孢-晶体复合物中分别提取孢壁蛋白(S蛋白)和孢晶毒素。采用SDS-PAGE证明孢晶毒素具有43和40kD两种多肽。但S蛋白只有一条104kD的蛋白带。后者经NaOH处理迅速降解成43和40kD的多肽。S蛋白和用SephadexG-75提纯的孢晶毒素对三龄致倦库蚊幼虫的LC50值(48h)分别为267和10ng／ml。免疫双扩散试验证明2362,1593、Bs-10(H5a5b)和2297(H25)菌株的孢晶毒素能与C3-41菌株的孢晶毒素抗血清发生交叉反应,但K(H1)、SSH-1、1404(H2)和2315(H26)菌抹的孢晶毒素与此抗血清不发生交叉反应。同时还证明Cr41菌株的S蛋白和孢晶毒索具有抗原同源性。     

CDC/MACPF家族成孔毒素研究进展

成孔毒素(Pore-forming toxins,PFTs)通常与细菌等原核生物的致病机理相关,在真核生物中,这类蛋白在免疫、胚胎发育、神经细胞迁移等方面发挥着重要作用。其中球状蛋白成孔毒素中的两大家族,胆固醇结合细胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysins,CDCs)和攻膜复合体/穿孔素超家族(Membrane attack complex/perforin superfamily,MACPF)以其独特的分子构型和功能受到研究者的关注。CDCs由革兰氏阳性细菌产生,在细菌的侵染过程中发挥裂解靶细胞膜的作用;在真核生物中,MACPF蛋白同时具有裂解和非裂解两种形式。目前,对于以产气荚膜梭菌溶血素(PFO)为代表的CDCs蛋白的结构及分子机制了解得较为透彻,近年来晶体学及生物化学研究揭示,尽管CDCs和MACPF这两大家族成孔毒素在氨基酸序列水平上存在较大差异,但它们共同的折叠模式预示:MACPF蛋白以一种类似于CDCs的成孔机制来行使其裂解靶膜的功能。文章对这两大家族成孔毒素的结构、成孔机制以及目前的研究热点问题予以综述,为该领域今后的研究提供有益参考。     

毒素-抗毒素系统介导持留菌形成机制的研究进展

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统是广泛存在细菌基因组上的由两个基因组成的操纵子,分别编码稳定的毒素蛋白和不稳定的抗毒素,其中毒素蛋白具有多种生物学功能。持留菌是指能够耐受高浓度抗生素或不利环境的一类细菌,它们同样具有TA系统。现就毒素-抗毒素系统介导持留菌形成机制的研究进展作一综述。     

牛乳铁蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12)杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

为了构建新型的杂合肽,设计了一种新型杂合抗菌肽牛乳铁蛋白素(1-15)-蜂毒素(5-12),由牛乳铁蛋白素(LfcinB)N端第1~15个氨基酸残基和蜂毒素(Melittin)N端第5~12个氨基酸残基组成。根据大肠杆菌密码子的偏爱性,设计合成了杂合肽LfcinB(1-15)-Melittin(5-12)的基因片段,插入到表达载体pET-32a的NcoI和SalI的酶切位点之间,构建重组表达质粒。重组表达质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,融合蛋白以可溶形式在Escherichia coli BL21(DE3)中获得成功表达,表达量占菌体总蛋白的35%以上,每升培养物可获得35mg融合蛋白。带His标签的融合蛋白经His-Bind纯化试剂盒纯化、肠激酶切割和抑菌实验表明,杂合肽具有明显的抑菌效果。这为利用基因工程方法生产抗菌肽奠定了理论基础。     

脂质筏--病原微生物出入细胞的一种门户

脂质筏是富含胆固醇和鞘磷脂的一种特殊膜结构,脂质筏形成的膜微区具有更低的膜流动性,呈现有序液相。脂质筏参与包括跨膜信号转导、物质内吞、脂质及蛋白定向分选在内的多种重要细胞生物学过程。分布于脂筏的分子主要有两种形式的蛋白修饰：与糖基磷脂酰肌醇(GPI)相连,或被肉豆蔻酸酰化／软脂酸酯酰化。一系列GPI-锚固蛋白被鉴定为多种不同的细菌、细菌毒素和病毒的受体。越来越多的研究发现,不同类型和种属来源的细菌、细菌毒素、原虫及病毒利用细胞质膜表面的脂筏结构介导其入胞,完成跨细胞转运、胞内复制或感染周期,一些病毒还利用脂筏完成其病毒颗粒的组装和出芽过程。通过对病原微生物如何利用脂筏介导其内吞及内吞入胞后在胞内的转运的研究,有利于我们更好地认识病原微生物与宿主细胞之间的相互作用,从而有可能发展更有效的抗感染策略。     

A型肉毒毒素血清学诊检的研究

应用肉毒毒素血清学诊检和分析肉毒毒素的方法,早已引起人们的注意。目前文献中介绍的血清学诊检肉毒毒素较好的方法有:(1)免疫电泳扩散法:可在两小时内检出14—50个小鼠LD_(50)的A型肉毒毒素。(2)间接血凝和血凝抑制试验:在4—18小时内,血凝试验     

新芋螺毒素基因的克隆及其遗传进化分析

全世界有约800种芋螺,每种芋螺产生多达2 000种的肽类毒素,这些毒素可以作用于电压门控离子通道(Na+,K+,Ca2+)、配体门控离子通道(n ACh Rs,5-HT3R,NMDAR)、G蛋白偶联受体(神经降压素和血管加压素)和神经递质转运蛋白。虽然已有大量的芋螺毒素通过毒液分离、c DNA克隆和转录组测序获得,但已发现的芋螺毒素不足其总量的0.5%。A-超家族中α-芋螺毒素基因结构包含了一个内含子和被该内含子分开的两个外显子,成熟肽具有标准的4个半胱氨酸骨架(CC-C-C)。本研究利用具有保守性的α-芋螺毒素基因内含子序列,采用多个PCR退火温度,从海南产疣缟芋螺中克隆到了1个新的具有6个半胱氨酸骨架(CC-C-C-CC)的M-超家族芋螺毒素基因和1个含有5个半胱氨酸新颖骨架(CC-C-C-C)的未知新家族芋螺毒素,并对它们的基因结构、成熟肽序列,以及与其他M-超家族芋螺毒素的遗传进化关系进行了深入分析。首次证实保守的α-芋螺毒素基因内含子序列可能存在于其他超家族中。     

家蚕氨肽酶和类钙粘蛋白与苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素相互作用（英文）

苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringiensis生产的晶体毒素被广泛用作农林害虫的杀虫剂。鳞翅目昆虫受体蛋白是阐明其与晶体毒素相互作用的重要模式。文中纯化了苏云金芽孢杆菌的晶体毒素蛋白,质谱鉴定为Cry1Ac毒素,然后重组表达家蚕氨肽酶N (BmAPN6)和类钙粘蛋白(CaLP)结合结构域。利用免疫共沉淀、Far-Western印迹和酶联免疫吸附试验,证明Cry1Ac毒素蛋白和BmAPN6之间的相互作用。在Sf9细胞中,对Cry1Ac毒素的细胞毒活性分析,表明BmAPN6参与Cry1Ac毒素诱导的细胞形态异常和裂解死亡。文中也利用相同的方法,对钙粘蛋白的3个结合位点CR7、CR11和CR12进行相互作用分析,结果表明3个重复结构域是CaLP的Cry1Ac结合位点。上述结果表明,BmAPN6和CaLP可作为Cry1Ac毒素致病的功能性受体,为进一步揭示晶体毒素的致病机制和基因编辑增强家蚕抗病性提供了研究靶标。     

家蚕氨肽酶和类钙粘蛋白与苏云金芽孢杆菌Cry1Ac毒素相互作用

苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis生产的晶体毒素被广泛用作农林害虫的杀虫剂。鳞翅目昆虫受体蛋白是阐明其与晶体毒素相互作用的重要模式。文中纯化了苏云金芽孢杆菌的晶体毒素蛋白,质谱鉴定为Cry1Ac毒素,然后重组表达家蚕氨肽酶N (BmAPN6) 和类钙粘蛋白 (CaLP) 结合结构域。利用免疫共沉淀、Far-Western印迹和酶联免疫吸附试验,证明Cry1Ac毒素蛋白和BmAPN6之间的相互作用。在Sf9细胞中,对Cry1Ac毒素的细胞毒活性分析,表明BmAPN6参与Cry1Ac毒素诱导的细胞形态异常和裂解死亡。文中也利用相同的方法,对钙粘蛋白的3个结合位点CR7、CR11和CR12进行相互作用分析,结果表明3个重复结构域是CaLP的Cry1Ac结合位点。上述结果表明,BmAPN6和CaLP可作为Cry1Ac毒素致病的功能性受体,为进一步揭示晶体毒素的致病机制和基因编辑增强家蚕抗病性提供了研究靶标。     

一种精子表面GPI锚定蛋白初步鉴定方法的建立

精子表面糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白(GPI-Aps)在精子不同阶段都发挥着关键作用.本研究介绍了嗜水气单胞菌毒素（aerolysin）作为生物探针来鉴定精子表面的GPI锚定蛋白.实验依次进行了嗜水气单胞菌培养、毒素提取纯化、多克隆抗体制备以及三明治蛋白印迹验证实验.凝胶蛋白分离实验显示,硫酸铵沉淀加Sephadex G-100层析柱纯化得到了分子质量为45 kD高纯度细菌毒素|蛋白印迹实验验证了制备的多克隆抗体的特异性|三明治蛋白印迹结果显示,嗜水气单胞菌毒素能识别出12条精子脂筏提取蛋白条带,其分子质量主要分布在15~130 kD之间|Alex488标记的免疫荧光实验显示,嗜水气单胞菌毒素识别的GPI锚定蛋白主要分布在精子头部和尾部.研究结果提示,嗜水气单胞菌毒素能够有效地识别精子表面的GPI锚定蛋白.     

Bt Cry毒素抗虫模拟物靶向创新设计

Bt Cry毒素是当前研究最深入、应用最广的生物抗虫蛋白，对农业害虫的绿色防治发挥了重大作用。然而，随着其制剂和转基因抗虫作物的广泛应用，由此驱动诱发的靶标害虫抗药性及潜在生态安全风险等问题日益凸显。探寻具备模拟Bt Cry毒素杀虫功能的新型抗虫蛋白材料，不仅可为农作物持续健康生产保驾护航，也能在一定程度上缓解靶标害虫对Bt Cry毒素的抗药性压力。近年来，笔者团队以抗体“免疫网络学说(immune network theory)”中Ab2β类型抗独特型抗体(anti-idiotype antibody, Anti-Id)具备模拟抗原结构和功能的特性为理论依据，借助噬菌体展示抗体库及特异性抗体高通量筛选与鉴定技术，设计Bt Cry毒素抗体为包被靶点抗原，从噬菌体抗体库中靶向筛选到了一系列具备模拟Bt Cry毒素抗虫功能的Ab2β类型抗独特型抗体(即Bt Cry毒素抗虫模拟物)，其中活性最强的Bt Cry毒素抗虫模拟物对靶标害虫的致死率接近相应原Bt Cry毒素的80%，初步实现了Bt Cry毒素抗虫模拟物的靶向设计。本文从理论依据、技术条件、研究现状等方面进行系统概述，并就相关技术发展...     

弧菌三联融合毒素基因表达及ELISA检测方法建立

采用柔性Linker(GGGGS)和重叠延伸PCR方法将三个毒素基因, 即副溶血性弧菌的耐热型直接溶血素基因tdh、创伤弧菌的溶细胞毒素基因vvhA和拟态弧菌的热不稳定型溶血素基因vmhA的成熟蛋白基因片段进行串联, 得到三联融合毒素基因tdh-vvhA-vmhA(命名为FT)。一致性比对分析与预计融合的基因序列一致性为99.6%。FT的开放阅读框架全长3225 bp, 编码1074个氨基酸残基, 预测分子量为120.4 kDa。将FT亚克隆至表达载体pET-22b(+)中, 再转化至E. coli BL21 (DE3)中进行表达, 经SDS-PAEG分析, 融合蛋白分子量与预测的相符。终浓度为1mmol/L的IPTG, 37 ℃诱导4 h, 融合毒素蛋白表达量最高, 经薄层扫描分析, 此时融合毒素蛋白占全菌体蛋白的11.49%。融合毒素蛋白包涵体经纯化, 免疫豚鼠制备血清抗体, 确定间接ELISA的最佳工作条件, 并进行敏感性、特异性、重复性及模拟样品检测试验, 建立了食物中毒性弧菌广谱、快速、特异的同步免疫学检测方法。