美支持异源移植研究

AgBiotech Reporter 2000年10月号转载Medical Industry today消息：位于美国麻省Charlestown的BioTransplant公司获得了小型企业创新研究SBIR的一期资助,支持其继续培育以移植为目的的猪,猪只的细胞、组织和器官将用于异源移植。在今后几年中,BioTransplant公司将进行猪→灵长类移植研究,重点是重要移植器官,包括肾、心,还有肺移植,公司总裁兼首席执行官Elliot Lebowitz透露。虽然有人关心异源移植会将猪内源性逆转录病毒（PERV）传播给人类,但BioTransplant公司对此问题有他们自己的解释。公司在最近的研究中发现,…     

五指山小型猪单个核细胞表面α Gal抗原表达差异的分析

利用猪的器官为挽救脏器终末衰竭病人而进行的异种移植是有效救治病人的途径之一.由于猪细胞表面存在的α1,3半乳糖会引起超急性免疫排斥反应,导致移植器官最终被移植受体排斥.除人类和旧大陆猴外,所有哺乳动物细胞表面都有αGal半乳糖表达,但个体间表达量存在显著差异.为研究近交系五指山小型猪细胞表面α1,3半乳糖表达的个体差异,本实验利用FITC-isolectin进行荧光标记,通过流式细胞术以及激光共聚焦分析,对14例5月龄猪样本外周血单个核细胞表面的α1,3半乳糖水平进行检测.利用猪肾上皮PK15细胞确定FITC-isolectin标记的最适浓度为25ng/μl(细胞标记效率大于85%).结果显示,14头猪外周血单个核细胞表面α1,3半乳糖的表达差异范围在1.25～2.09倍之间,远低于普通非近交系猪的个体差异.本研究为利用近交系五指山小型猪作为异种器官移植的研究材料提供了基础数据.     

猪皮肤成纤维细胞PERV体外和体内感染性的研究

为了解猪皮肤成纤维细胞PERV在体外和体内的感染性,通过建立猪皮肤成纤维细胞系,将所建细胞系与人胚胎肾293细胞体外共培养,并移植于严重联合免疫缺陷鼠(SCID鼠)皮下进行猪皮肤成纤维细胞PERV的体外和体内感染性实验。结果表明,猪皮肤成纤维细胞与人胚胎肾细胞共培养过程中,猪内源性逆转录病毒感染人胚胎肾细胞,进一步证实和拓宽了猪细胞PERV感染人细胞的范畴;猪皮肤成纤维细胞移植SCID鼠皮下后,导致SCID鼠发生猪细胞微嵌合(78．57％)和PERV在体内感染(85．71％)并且波及远离移植部位的多种组织或器官,但是并未检测出SCID鼠组织中表达PERV env RNA。这就证实了猪皮肤成纤维细胞PERV的体外感染性和在小鼠体内的感染性,但未能找到PERV在体内活跃复制的明显证据。因而,在猪异种移植过程中PERV传播的潜在危险仍然是必须高度重视的生物安全性问题。     

广西巴马小型猪转基因克隆胚胎的体外生产

广西巴马小型猪是一种原产于广西巴马县的小型猪品种,非常适于实验动物化,进行广西巴马小型猪的基因修饰研究,可以显著提升其在生物医学研究中的利用价值。当前最有效的构建转基因猪方法是体细胞核移植,但因用于体细胞核移植生物供体细胞在经受转基因操作后活性显著下降,从而制约了转基因克隆猪的生产效率。Xfect polymer是一种新型转染试剂,具有细胞毒性低和操作简便等优点,已被证明适用于多种真核细胞的转基因操作。本研究旨在利用体细胞核移植技术来检验经Xfect polymer转染制备的广西巴马小型猪转基因体细胞,可否支持猪克隆胚胎完全的体外发育的能力,以期为将来生产模拟人类疾病的转基因克隆广西巴马小型猪奠定基础。     

克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

异种器官移植中的Galα（1,3）Gal抗原表位的研究进展

改造猪的器官移植给人类被认为是解决人类移植器官供不应求的可能方案,但由于猪和人在免疫学上的差异使移植到人体的猪的带血管器官很快被排斥掉,本文综述了近十年来对猪-人之间最重要的差异性抗原表位的研究进展.     

PERV病毒在异种移植中的感染风险及预防对策

猪与人体在器官结构、生理解剖上相似性高,被认为是最佳的异种移植供体,能够有效解决人类供体器官短缺的问题。猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)是一种C型逆转录病毒,以一种前病毒DNA的形式整合在猪的细胞基因组中,随细胞染色体的复制而复制,无法通过无特定病原体(specific pathogen-free, SPF)培育消除,其在异种移植中具有潜在的感染风险。了解PERV的特性,探索PERV预防策略,将有助于猪作为异种移植供体在临床的应用。     

应用RNA干扰沉默猪内源性反转录病毒

目的:尝试应用RNA干扰(RNAi)沉默猪源PK-15细胞中的猪内源性反转录病毒(PERV),并通过反转录酶活性及pol基因相对荧光定量PCR检测沉默效果。方法:依据GenBank公布的PERV pol基因序列,采用Invitro-gen公司的BLOCK-iT RNAi Designer软件设计Stealth小干扰RNA(siRNA)序列;将合成的siRNA转染PK-15细胞,72 h后检测细胞上清PERV反转录酶活性及细胞内pol基因拷贝数并评价沉默效果。结果:反转录酶活性及pol基因拷贝数检测结果表明,设计的3条Stealth siRNA序列中,位于pol基因3272～3296 bp的序列能有效沉默PERV。结论:RNAi方法可有效使猪源PK-15细胞中的PERV沉默,为进一步研究天然抗病毒分子与PERV的相互作用提供了实验基础,同时也为猪源异种移植研究中去除PERV提供了一种可供尝试的方法。     

细胞膜因子可能与猪受精卵的抗冻性有关

日本日清制粉公司宣布:猪的受精卵在发育过程中,以清亮区脱出胚泡阶段耐冷性最强,猪的受精卵的耐冻性可能存在品种间差异.这是该公司1989年8月16日在受精卵移植技术研究组合的成果发表会上报告的成果.这项研究最终目的是确立白色种的受精卵移植技术.     

猪体细胞核移植的研究进展和影响因素

自2000年Polejaeva IA获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下（1—2％）,人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进展,就猪核移植中的技术难点和影响因素进行了分析,涉及供体细胞种类的选择、体外长期培养和高压筛选对随后核移植的影响以及供核细胞细胞周期的选择,核质双方的协调,去核和注核方法的选择,融合和激活程序的优化,妊娠的维持等。     

转基因猪的培育

日清制粉公司与名古屋大学医学部第2外科教授高木弘等合作培育导入人补体控制因子基因的转基因猪获得成功。该因子是防止异体移植时在血中的自然抗体上结合活化补体而引起的超急性排斥反应的重要因子之一,人补体控制因子基因的导入为培育异体移植的供体猪开辟了道路。于3月28日在宫崎市召开的第90届日本畜产学会上发表了这项成果。 日清制粉公司从20头猪中共获得354个受精卵,其中,用微注射方法在(被认定为前核的)266个受精     

人脑胶质瘤小型猪原位移植模型的建立及评估

目的利用免疫抑制剂处理小型猪,建立人脑胶质瘤小型猪原位移植模型,为胶质瘤药物筛选和影像学研究提供与人体相近的实验工具。方法人胶质瘤细胞U87-MG移植于裸鼠皮下,待形成肉眼可见肿瘤后备用。选择小型猪联合口服免疫抑制剂环孢素软胶囊(20 mg/kg)和他克莫司胶囊(0.01 mg/kg)进行免疫干预。3 d后,取裸鼠皮下新鲜的U87-MG肿瘤组织,将其修剪为1 mm3组织块,通过立体定向仪和套管针将肿瘤组织移植于经免疫抑制剂处理的小型猪大脑纹状体,持续使用免疫抑制剂21 d,进行核磁共振成像,确认肿瘤的位置。必要时处死动物并解剖,取肿瘤组织固定,进行HE和IHC染色以确定肿瘤的组织形态。结果 12头猪进行了原位移植,3周后,核磁检测确认11头猪成像,肿瘤发生率达到90%以上,胶质瘤猪原位移植模型肿瘤组织HE染色结果、生长特征均符合肿瘤特征;人线粒体抗体染色显示其为人源性组织,胶质瘤特异性标志物GFAP表达阳性。结论联合环孢素软胶囊和他克莫司免疫抑制处理,通过移植肿瘤组织成功建立人脑胶质瘤小型猪原位移植模型。     

95年临床试验抗CD45单克隆抗体

公司宣布从95年下半年着手从英国Cantab公司引进的抗CD45单克隆抗体(小鼠型)的临床试验。 用这种单克隆抗体处理从给血者摘出的肾脏,去除残存于移植脏器中的白细胞,就能抑制抗原提示细胞的活动。因此,希望在移植后能预防由于残存的给血者的免疫而引发的急性排斥反应。这种排斥反应导     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用.本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪.将sFat-1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植.先后移植了1889枚1~4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠(90%),7头妊娠足月(70%)分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1.1%(出生仔猪/移植胚胎).体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响.当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率(100%),而排卵后移植妊娠足月率为0%.对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87%.RT-PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat-1基因.以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFa...     

神经细胞微囊偏侧帕金森病猴脑内移植的组织学观察

通过脑内移植脉络膜细胞(CP)海藻酸盐微囊观察偏侧帕金森病样猴脑神经组织学改变,以探讨微囊化CP对灵长类动物纹状体神经元的保护作用.用海藻酸盐多聚鸟氨酸微囊包裹猪脉络膜细胞,移植至偏侧帕金森病样猴黑质-纹状体通道,移植后6个月进行神经病理学检查,观察脑组织学变化.脉络膜细胞微囊脑内移植能改善偏侧帕金森病猴行为,能促进多巴胺能纤维增生和活动增强.     

体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1克隆猪

转ω-3脂肪酸去饱和酶基因猪在优质猪培育及研究ω-3不饱和脂肪酸预防心血管和癌症疾病中的作用方面有着重大的应用．本研究首次通过体细胞核移植制备了转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-1猪．将sFat—1基因转染到大白猪胎儿成纤维细胞,获得转基因阳性细胞克隆,然后以转基因细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎,胚胎体外培养或进行移植．先后移植了1889枚1-4细胞期克隆胚胎到10头受体母猪的输卵管内,28天B超检测9头受体母猪妊娠（90％）,7头妊娠足月（70％）分娩产下21头仔猪,体细胞克隆猪的效率为1．1％（出生仔猪／移植胚胎）．体细胞克隆猪效率的提高,主要是对克隆胚胎的移植环节进行了改进,比较了受体母猪排卵状况对胚胎移植效率的影响．当受体母猪卵泡发育处于即将排卵或正在排卵阶段,能够获得较高的妊娠率和妊娠足月率（100％）,而排卵后移植妊娠足月率为0％．对健康存活15头克隆猪进行了PCR和Southern检测,证实13头为转基因猪,转基因阳性率为87％．RT—PCR检测13头转基因猪,12头表达sFat—1基因．以上结果表明,利用优化的体细胞转基因结合核移植技术,可以成功地批量生产转sFat-1基因的克隆猪．     

脉络丛细胞微囊脑内移植前后的物理及生化性能研究

通过测定脉络丛细胞海藻酸盐微囊在大鼠脑内移植前及移植后的物理及生化性能变化,以探讨其应用于移植治疗神经系统疾病的可行性.用海藻酸盐多聚鸟氨酸微囊包裹猪脉络膜细胞,移植至大鼠黑质-纹状体通道,移植前、移植后4个月及6个月分别测定微囊的大小、形态及细胞的活力、分泌蛋白质及神经营养因子的能力、蛋白质组学的变化.脉络膜细胞微囊在移植前、后大小、细胞活力、蛋白质组学分析、分泌蛋白质及神经营养因子的能力无显著变化.海藻酸盐-多聚鸟氨酸CP微囊能有效地防止脉络膜细胞被受体免疫系统所攻击,使得它们能在大鼠的大脑存活6个月以上并不引起不良作用.     

Hana公司在细胞移植工作中失足

想象一下:你开始对一种蛋白进行临床试验,得到的却非你所需。Hana生物学公司(Alameda,CA)就遇到类似情况。该公司已开始进行移植产胰岛素胚胎祖细胞的第一期试验。实验的出发点是让这些细胞产生胰岛素,最终治愈糖尿病,但实验结果却表明所移植的细胞不产生胰岛素,Hana公司意外地错培养了细胞! 在实验过程中,公司研究人员采用的是混和细胞培养。在混和细胞群中包含着产胰岛素的β-祖细胞。研究人员繁殖了整个细胞群,以为上述β-细胞亦在繁殖之列。然而他们     

热休克预处理提高猪成肌细胞自体正常肌肉移植后的生存率

研究表明成肌细胞移植有可能用于治疗Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)、心衰和严重肌肉损伤. 移植后成肌细胞快速大量的死亡是影响该方法疗效的一个主要难题. 细胞在受到各种刺激后会过度表达热休克蛋白(heat shock protein, HSP). 体外和体内实验均已证实HSP能帮助细胞对抗多种有害刺激. 本实验针对HSP的过度表达能否提高猪成肌细胞自体正常肌肉移植后的存活率进行研究. 猪成肌细胞经过42℃, 1 h的热休克后会过度表达HSP. 通过Western blot 和流式细胞仪来定量检测猪成肌细胞中HSP的表达; 同时分析细胞中的CD56和结合蛋白含量, 从而了解休克后细胞的肌源性有无变化. 利用放射性H³定量分析移植后细胞的生存率. 借助慢病毒载体(Lentivector Lac Z)监测移植后成肌细胞与宿主细胞的融合情况. 结果表明热休克预处理后成肌细胞的HSP70显著增高(P<0.01), 并且细胞的肌源性无变化. 成肌细胞体内移植后(n=7), 24 h时热休克组和非热休克组的细胞存活率无显著性差异((67.69 ± 8.35)% vs (58.79 ± 8.35)%, P>0.05). 48 h时热休克组细胞存活率比非热休克组的高2倍((53.32 ± 8.22)% vs (28.27 ± 6.32)%, P<0.01). 120 h时热休克组细胞存活率比非热休克组的高3倍((26.33 ± 5.54)% vs (8.79 ± 2.51)%, P<0.01). 组织学检查显示; 热休克细胞和非热休克细胞均能与宿主细胞融合. 这些结果提示热休克预处理能增强成肌细胞HSP70的表达, 并可提高成肌细胞自体移植后的生存率. 体外热休克预处理是一个简单有效的能改善猪成肌细胞自体移植生存率的方法. 这也许是一个解决成肌细胞移植后存活率低的方法.