显微注射技术

一、概述显微注射是一种精细的实验技术,它必须在实体显微镜(解剖镜)和显微镜下进行操作,用于研究遗传、发育、细胞分化及基因的调控与表达等诸多方面的基础理论问题.从50年代开始,许多发育生物学家、遗传学家、分子生物学家借助这一技术,在核质关系,外源遗传物质的诱导,及应用生物学等方面做了大量工作.现在此项技术巳被广泛地应用于生物     

基因的显微注射技术

《自然》杂志首次登载了一张照片,其中一只小鼠大小正常,而另一只的体积却比同胞小鼠大两倍,这就是显微注射基因技术产生的“超级小鼠”。用显微注射方法将外来基因移植到小鼠内而使基因传给后代,这样产生的动物被称为转移基因动物。基因显微注射在显微镜下进行,因而可以看清移植的靶——卵细胞。每次移植,外来的DNA必须注入到受精卵细胞两个原核中的一个之内。一个灵巧熟练的能手能用异常的速度进行移植,宾夕法尼亚大学的微生物学家Myrna E.Trumbauer博士就能在一个半小时之内将基因注入300个卵细胞内。     

制作转基因动物的显微注射技术

转基因动物(Transgenic animals)是指体细胞和生殖细胞的基因组内,含有用实验方法导入的外源目的基因的动物。转基因动物的获得,大大地丰富了基因工程的研究内容,它为研究高等动物基因表达调控的分子机理提供了有效的途径。由于这种系统不仅可以表达多肽和蛋白质的产物作为医疗药物的生产途径,     

制作转基因动物的显微注射技术

转基因动物（Transgenic animals）是指 体细胞和生殖细胞04基因组内,含．有用实U,方 法导入的外源目的基因的动物。」转基因动物的 获得,大大地丰富了基因工程的研究内容,它 为研究高等动物基因表达调控的分子机理提供 了有效的途径。由于这种系统不仅可以表达多 肤和蛋白质的产物作为医疗药物的生产途径, 而且外源基因的表达还可以引起动物表型的改 变,并能传递至后代,因此为创造新品种提供了 可能性。     

显微注射构建烟粉虱的RNAi技术体系

RNAi已经成为揭示基因功能的一个常用的有力工具。在昆虫RNAi技术体系中,通过显微注射方法向昆虫体内注入dsRNA,实现系统性干扰,是最为广泛采用的方法。但对于体型较小的昆虫,注射法操作存在较大的难度,特别是非常微小的昆虫烟粉虱Bemisia tabaci。为了进行烟粉虱大规模基因功能验证,需要开发一套成熟的RNAi技术体系。本研究以烟粉虱的CYP6CM1基因为目标基因,通过显微注射法注射不同浓度的dsRNA到烟粉虱4龄若虫,荧光定量PCR检测其沉默效果。结果表明:在对单头烟粉虱注射50 n L时,注射不同浓度的dsRNA,对CYP6CM1基因的沉默效果不同,最大沉默效率可达到80%以上。因此,本实验成功构建了烟粉虱的RNAi技术体系,也可用于其它粉虱类害虫的RNAi技术。     

植物生理学研究中应用的显微注射技术

本文对植物生理学研究中采用显微注射技术时的标记物选择,注射方法以及标记物的观察、记录作了系统介绍。     

体外培养细胞的显微注射

借助玻璃微吸管进行体细胞显微注射技术是由Graessmann(1968)和Liacumakos等(1970)发展起来。这种技术已成功地将DNA、mRNA、tRNA和蛋白质等显微注射进细胞内,并研究其生物效应。目前已经能将一个体外培养的体细胞作为“活试管”,通过显微注射技术,把DNA等生物大分子注射进细胞内来研究复杂的生物学现     

线虫基因显微注射和整合技术——设备、操作与指南

秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)是研究动物遗传、个体发育和行为活动的重要模式生物,其主要优点是能够研究从分子细胞水平到整体系统水平的相关生命活动的作用机理．其中基因显微注射和整合是该领域的核心技术,广泛应用于研究线虫的基因表达、功能和基因间的相互作用等．显微注射技术使用尖端开口直径为微米级的玻璃微管,将所研究的目的DNA注射进线虫的性腺．注射的DNA被成熟的卵细胞吸收,以染色体外遗传物质的形式存在．但这种形式并不能稳定遗传,可采用基因整合技术将外源基因整合到染色体上,得到稳定遗传的线虫种系．显微注射是一项精细的实验技术,影响实验成功与否的因素较多,实际操作需要有一定的经验．在实践过程中逐步改进和完善了这项技术,在此主要介绍线虫显微注射技术的操作过程、创新方法以及注意细节．     

斑马鱼整胚原位杂交和显微注射转基因技术的建立（简报）

随着人类基因组框架图的完成,解读大量基因的功能和表达调控成为亟待解决的问题。因此通过模式生物从个体水平、细胞水平和分子水平研究基因功能及其表达调控日益成为一个重要的研究领域。斑马鱼(Brachydanio rerio)是近年来崛起的一种模式生物。它的显著优势在于：个体小,便于大批量饲养;产卵量大,胚胎透明,易于观察和操作;体外发育,发育迅速,2—3天即可完成主要器官的建成;可以方便的进行大规模的诱变和突变型筛选等研     

斑马鱼整胚原位杂交和显微注射转基因技术的建立(简报)

随着人类基因组框架图的完成,解读大量基因的功能和表达调控成为亟待解决的问题。因此通过模式生物从个体水平、细胞水平和分子水平研究基因功能及其表达调控日益成为一个重要的研究领域。斑马鱼(Brachydanio rerio)是近年来崛起的一种模式生物。它的显著优势在于:个体小,便于大批量饲养;产卵量大,胚胎透明,易于观察和操作;体外发育,发育迅速,2—3天即可完成主要器官的建成;可以方便的进行大规模的诱变和突变型筛选等研究。它已成为脊椎动物胚胎发育遗传学和基因功能研究中理想的模式生物。整胚原位杂交技术是     

斑马鱼胚胎显微注射基因分析平台的建立

斑马鱼作为一种新的理想模式动物,已在发育生物学、环境毒理学和人类疾病及相关基因功能等研究中得到广泛应用。本文就建立斑马鱼胚胎的显微注射基因分析平台进行了探究,并通过piwil2基因的抑制和过表达实验验证了平台的可操作性,也对建立平台中所要注意的问题进行了讨论。     

受精卵反义寡核苷酸显微注射影响因素的研究

以金鱼受精卵为材料,通过胚胎培养探讨反义寡核苷酸显微注射剂量、受精卵质量、胰酶消化浓度等对受精卵反义寡核苷酸显微注射的影响．研究表明,反义寡核苷酸注射剂量在4．6nL、胰酶消化浓度在0.4％的情况下,选用质量较好的受精卵注射,显微注射效果较好,可为之后的基因功能研究提供材料保障．利用显微注射法导入反义寡核苷酸来研究基因的功能．是研究基因功能的有效途径．     

显微注射外源DNA在早期胚胎中的命运

应用显微注射法制备转基因动物时,外源DNA早期在胚胎的命运比较复杂,但对一些基本问题已有所了解。外源DNA在早期胚胎中发生着一系列的事件:染色体外重组,最终以线性DNA的形式整合入宿主基因组内;不同的细胞周期进行的微注射决定整合的频率及嵌合的比例,整合事件发生于第一个细胞周期S期,大多数呈现非嵌合现象。     

无透镜显微技术

无透镜显微成像(lens-free microscopy)是一种在不借助透镜的情况下进行成像的技术。它基于Gabor同轴全息原理,利用面阵探测器采集原始全息图,随后通过数字图像处理技术重建样本,从而实现数字显微成像。像素超分辨技术缩小了等效像素,提供更多细节信息使得再现像的分辨率得以直接提升,而且多种相位恢复手段通过去除孪生像也达到了间接提高分辨率的目的,尤其是对密集样本。无透镜显微成像技术突破了传统光学显微镜由透镜带来的空间带宽积的限制,实现了大视野范围下的高分辨率成像,因此,这一技术能够提供大视场下的临床样本快速诊断和准确检测。另外,新兴的算法和硬件都在不断地加快数据采集和计算速度,扩展了其在高速运动样本和纳米尺度样本上的应用。最近无透镜技术和其配套硬件设备发展方向趋向于硬件紧凑、算法密集、实时、三维、彩色、高分辨率的便携式分立器件或配件。     

染色体显微切割技术

最近十几年里,在对染色体特定基因研究和分子标记遗传图谱等研究方面,以经典的遗传作图为基础,出现了很多新方法,微切及微克隆技术（ＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＭｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎａｎｄＭｉ－ｃｒｏｃｌｏｎｇ）是随着近１０年来分子生物学技术的发展而诞生的...     

中华按蚊电转化显微注射技术平台的构建及其在基因瞬时过表达中的应用

【目的】构建在中华按蚊 Anopheles sinensis 中的电转化显微注射技术平台,并利用该技术平台实现活体基因瞬时过表达对其进行验证,为开展系统的基因功能研究奠定基础。【方法】以CUY21EDIT Ⅱ电转仪为主体构建中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;使用同源重组法构建 EGFP 和 Bm-iAANAT 基因的瞬时过表达质粒,在中华按蚊化蛹3 h时注射该质粒进入蛹体,随即使用电转仪对注射后的蛹进行电击,待注射个体发育至化蛹39 h时,利用体视荧光显微镜观察蛹体表皮着色和发光情况,并通过荧光定量PCR检测 EGFP 和 Bm-iAANAT 的表达。【结果】构建了用于显微注射的 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40和 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A-EGFP-SV 40过表达载体。 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40注射组中华按蚊在化蛹39 h时约87.5%的个体成活并正常黑化,这其中约92.7%的个体的表皮检测到明显的绿色荧光,注射无启动子载体 PIZ-modi-EGFP-SV 40并进行电击的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体则没有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,注射组中发光个体的 EGFP 基因明显高表达。 PIZ-modi-Aepub-AANAT-T 2 A-EGFP-SV 40注射组的蛹在化蛹39 h时有80.4%个体存活,这其中92.2%的个体相对于注射无启动子载体 PIZ-modi-AANAT- T2A -EGFP-SV 40的阴性对照组和注射过表达载体 PIZ-modi-Aepub-AANAT- T2A -EGFP-SV 40但未进行电击的阳性对照组个体黑化明显受阻,且有明显的绿色荧光;并且荧光定量PCR结果显示,报告基因 Bm-iAANAT 和 EGFP 的表达明显提高。【结论】成功构建了在中华按蚊中的电转化显微注射技术平台;通过此技术平台能够便捷、快速和高效地实现报告基因在活蛹中的瞬时过表达,并产生了目的表型。这为中华按蚊功能基因组研究奠定了基础。     

超高分辨率显微技术研究进展

光学显微成像具有极为悠久的历史,但一直以来,光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。近年来,超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。值得庆贺的是,德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。在这篇文章中,我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用,并带领读者一同寻访大师的科学足迹。     

共聚焦显微技术简介

共聚焦显微镜在生物学研究中得到广泛应用,共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和数字共聚焦显微技术两种,共聚焦技术具有成像清晰,获得三维图像,进行多标记观察,活细胞内动态生理反应的实时观察记录,定性定量分析等优势,与共聚焦显微技术相关的技术有荧光染料的选择,荧光指示剂装载以及图像数据处理等。     

激光捕获显微切割技术新进展

最近发展起来的激光捕获显微切割技术,成功地解决了从所需标本不同成分中获取纯净细胞这一问题,具有简单、快速、不需熟练技巧以及精确度高等多功能特点,目前,广泛用于肿瘤学、细胞发生学和其他学科的研究。可以预测,激光捕获显微切割技术,作为一个链接研究形态学与分子事件联系的上下游技术平台,必将在人类后基因组时代发挥重要作用。