大麦黄矮病毒运动蛋白是RNA沉默抑制因子

大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)属黄症病毒科家族,其基因组包含6个开放阅读框(open reading frames,ORFs).将BYDV的6个基因分别克隆到pWEIMING101载体上,得到重组基因.电击转化农杆菌后,利用农杆菌瞬时表达方法渗透注射转GFP基因的本氏烟草16c植株的叶片,在长波长紫外灯下观察GFP的表达,并通过Northern blot证明所得现象.研究结果表明,BYDV的PAV株系ORF4编码的运动蛋白(movement protein,MP)是RNA沉默抑制因子,其表达可以抑制局部和系统RNA沉默.BYDV-MP与GFP的双链RNA(dsGFP)共表达后仍能抑制RNA沉默,荧光强度与叶片中GFP的mRNA和其沉默降解形成的siRNA的量有对应关系,其N端核定位序列对抑制局部基因沉默起主要作用,第5、6位氨基酸是抑制基因沉默的关键氨基酸.BYDV-MP单独渗透注射的部位均产生细胞死亡.     

鸭梨PPO与GFP融合基因的烟草转化及亚细胞定位观察

将鸭梨PPO基因与绿色萤光蛋白GFP基因相融合共同进行遗传转化的方式,对鸭梨多酚氧化酶开展细胞定位研究。通过克隆该酶基因除终止密码子TAA外长度为1 779bp的CDS序列,与绿色荧光蛋白基因重组构建了荧光表达载体pBI121-PPO-GFP,借助农杆菌转化烟草,转基因烟草叶片细胞经激光扫描共聚焦显微镜观察,绿色荧光蛋白荧光与叶绿体自发荧光相重合。结果表明鸭梨多酚氧化酶为叶绿体蛋白质。     

嗜水气单胞菌HBNUAh01 外膜蛋白A 基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达

【目的】从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)HBNUAh01中克隆外膜蛋白A(outer membrane proteinA,ompA)基因并在烟草(Nicotiana tabacum)叶片细胞中瞬时表达该蛋白。【方法】以嗜水气单胞菌HBNUAh01为模板进行嗜水气单胞菌外膜蛋白A(AhompA)基因片段的PCR扩增,并将其克隆到pEASY-Blunt Simple载体中以进行测序。测序正确的AhompA基因序列与含有黄色荧光蛋白(yellow fluorescentprotein,YFP)基因的表达载体pCAMBIA1300构建重组表达载体。将该重组表达载体转化到农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101感受态细胞中,随后用阳性转化子转染烟草叶片细胞。使用激光扫描共聚焦成像系统(Confocal Laser Scanning Microscope)检测观察融合表达AhompA基因的黄色荧光蛋白并采用RT-PCR检测AhompA基因在烟草叶片中的转录情况。【结果】从嗜水气单胞菌HBNUAh01中克隆出大小为1032 bp的AhompA基因序列,并在烟草叶片中成功表达AhompA和YFP的融合蛋白。【结论】AhompA基因在烟草叶片细胞中的成功表达为进一步研究利用植物疫苗防治嗜水气单胞菌引起的水产动物疾病奠定了基础。     

植物microRNA功能瞬时验证体系的建立

目的:建立植物microRNA(miRNA)功能的瞬时活体验证体系,并检验该体系的有效性。方法:选用双元表达载体pCAMBIA1200,并插入烟草花叶病毒双35S启动子,以驱动目标miRNA超表达;选用双元表达载体pFGC5941的绿色荧光蛋白(GFP)改造载体用于潜在的靶基因与GFP融合蛋白的超表达,以转入这2种载体的农杆菌侵染烟草叶片,观察GFP融合蛋白的荧光,作为验证miRNA对其潜在靶基因调控作用的瞬时验证体系。选取拟南芥已知功能的miR393及其靶基因AFB3,分别构建pCAMBIA1200-35S-miR393和pFGC5941-GFP-AFB3载体,利用农杆菌注射烟草叶片进行2个载体共转化,并以pFGC5941-GFP-AFB3单转化作为对照,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:只将AFB3导入烟草表皮细胞,可观察到绿色荧光;而将miR393与AFB3同时导入烟草表皮细胞后,未能观察到绿色荧光。表明miR393抑制了AFB3的表达。结论:本瞬时表达体系可作为植物miRNA功能的活体瞬时验证体系,为miRNA调控靶基因表达功能提供简单、快速、有效的证据。     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA4的克隆及非编码区的启动子活性初探

应用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物 (BananabunchytopvirusChineseZhangzhouisolate ,BBTV_ZZ)DNA 4。序列分析表明其序列全长为 10 39nt,归属于亚洲组。 5′RACE分析确定其转录起始位点是 2 6 9nt处的A。利用PCR方法亚克隆了BBTV_ZZDNA 4非编码区序列并将其插入到植物表达载体pCAMBIA 130 4中的gfp∶∶gus基因上游得到重组质粒pTA2。将含pTA2和pCAMBIA 130 4的根癌土壤杆菌 (Agrobacteriumtumefaciens)注射进烟草 (NicotianatabacumL .cv .XanthiNC)叶片 ,3～ 5d后剪下注射部位的叶片进行GUS和GFP的表达分析。pTA2 (含BBTV_ZZDNA 4非编码区 )、pCAMBIA 130 4 (含CaMV 35S启动子 )和未注射的烟草叶片的GUS活性分别为 1 0 0 70pmolMU·μg-1·min-1,2 .0 6 90pmolMU·μg-1·min-1和 0 .0 2 14pmolMU·μg-1·min-1。注射含pTA2和pCAMBIA 130 4植物表达载体根癌土壤杆菌以及未注射的烟草叶片的每毫克总蛋白的GFP间接ELISA在 4 90nm的吸光值分别为89 5 77、10 0 4 4 0和 3 2 87。     

绿色荧光蛋白基因（G卯）在抗虫转基因植物研究中的应用

用合成的crylAc基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)构成融合蛋白基因,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光;经抗虫试验、PCR、Southern blot和Western blot等检测,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统,简化了抗虫转基因植物筛选程序,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA 4的克隆及非编码区的启动子活性初探

应用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物(Banana bunchy top virus Chinese Zhangzhou isolate, BBTV-ZZ) DNA 4.序列分析表明其序列全长为1 039 nt,归属于亚洲组.5′ RACE分析确定其转录起始位点是269 nt处的A.利用PCR方法亚克隆了BBTV-ZZ DNA 4非编码区序列并将其插入到植物表达载体pCAMBIA 1304中的 gfp∶∶gus 基因上游得到重组质粒pTA2.将含pTA2和pCAMBIA 1304的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)注射进烟草(Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi NC)叶片,3～5 d后剪下注射部位的叶片进行GUS和GFP的表达分析.pTA2(含BBTV-ZZ DNA 4非编码区)、pCAMBIA 1304(含CaMV 35S启动子)和未注射的烟草叶片的GUS活性分别为1.007 0 pmol MU*μg-1*min-1 , 2.069 0 pmol MU*μg-1*min-1和0.021 4 pmol MU*μg-1*min-1.注射含pTA2和pCAMBIA 1304植物表达载体根癌土壤杆菌以及未注射的烟草叶片的每毫克总蛋白的GFP间接ELISA在490 nm的吸光值分别为89.577、100.440和3.287.     

美洲商陆抗真菌蛋白转化烟草的研究和抗病性检测

本研究为美洲商陆抗病毒蛋白(PaAFP)基因首次对植物遗传转化的研究,转入烟草中研究此蛋白对烟草立枯病的抗性。从美洲商陆叶片中获得美洲商陆抗真菌蛋白前体蛋白基因cDNA序列,构建植物表达载体pCAMBIA1300-PaAFP,通过三亲杂交法将其导入根癌农杆菌LBA4404受体菌,转染烟草获得了大量再生转基因植株。PCR、Southern杂交、RT-PCR以及Tris-Tricine-SDS-PAGE检测结果表明目的基因已经整合到烟草基因组中,并且已经得到转译。转基因植株苗期抗立枯病试验表明,转基因烟草植株对立枯丝核菌表现出了抗性。     

根癌农杆菌介导的灰葡萄孢菌遗传转化研究

以pCAMBIA1300-N载体为骨架, 成功构建了以绿色荧光蛋白(gfp)为报告基因, 潮霉素(hph)为抗性筛选标记的载体pKPG, 并利用根癌农杆菌介导转化系统, 成功获得了能表达绿色荧光蛋白的重组灰葡萄孢菌。通过PCR检测转化子的绿色荧光蛋白基因和潮霉素抗性表达框, 观察菌丝和分生孢子的荧光表型, 以及gfp基因的Southern杂交验证, 结果表明：被测转化子基因组中均成功整合了目的基因片段。     

盐穗木功能未知蛋白 (HcUKPP)的亚细胞定位

藜科的极端盐生植物盐穗木（Halostachys caspica）的高盐胁迫抑制差减文库中有39%的功能未知蛋白（proteins with obscure features, POFs）,利用亚细胞定位分析可以初步判断其可能的功能.将盐穗木的1个POF-cDNA序列HcUKPP的编码区构建至pCAMBIA1301-GFP植物表达载体上,冻融法将重组质粒pCAMBIA1301-HcUKPP-GFP转化农杆菌EH105A,利用花序浸染法将基因导入拟南芥,经潮霉素筛选获得T1代阳性幼苗.通过激光扫描共聚焦显微镜观察转基因拟南芥植株的根部细胞. 结果显示,表达GFP蛋白的对照转基因植株中,绿色荧光在细胞核、细胞膜以及细胞质中均能检测到,而表达HcUKPP-GFP融合蛋白的转基因植株中,绿色荧光只在细胞质膜上表达,说明HcUKPP蛋白为细胞质膜相关蛋白.本研究为深入探讨盐穗木未知蛋白的功能奠定了基础.     

两种瞬时表达体系研究拟南芥Profilin-1的亚细胞定位

使用两种瞬时表达方法研究Profilin-1(PRF1)的亚细胞定位,并比较了2种瞬时表达体系在亚细胞定位研究中的优缺点。利用拟南芥幼叶作为材料,提取叶片的RNA,采用特异性引物RT-PCR的方法克隆PRF1基因,连接到p CAMBIA1300-GFP的改造载体上,成功的构建p CAMBIA1300-GFP-PRF1的表达载体。然后分别利用PEG转化拟南芥原生质体、农杆菌浸染烟草叶片两种技术进行了瞬时表达,并在激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白的表达。研究结果表明,将PRF1基因导入拟南芥的原生质体和烟草表皮细胞后,融合蛋白绿色荧光均能被观察到,PRF1基因与GFP融合蛋白的产物在烟草表皮细胞中主要定位在细胞质和外周细胞器中,在拟南芥的原生质体中的细胞核和细胞质中都有定位。两种不同的瞬时表达体系中PRF1蛋白的定位出现了不同,这可能与同源或异源表达的植物的特性相关。     

绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达

目的:将绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)重组到胡萝卜愈伤组织细胞中,使其获得表达,为今后利用GFP基因作为植物报告基因提供条件。方法:通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体PBI1121转入到根癌农杆菌EHA105中,再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组织细胞中,经过除菌和抗性筛选后观测转化结果。结果:荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光,利用PCR法扩增出约740bp的目的基因片断。结论:GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达。     

绿色荧光蛋白基因(GFP)在抗虫转基因植物研究中的应用(英文)

用合成的cry1Ac基因与绿色荧光蛋白基因 (GFP)构成融合蛋白基因 ,然后和改造的GNA基因构建双价抗虫基因植物表达载体pBGbfg ,经根癌农杆菌介导转化了烟草。在紫外灯照射下 ,观察到转基因植株叶片中有较强的绿色荧光 ;经抗虫试验、PCR、Southernblot和Westernblot等检测 ,表明该重组植物表达载体能够在转基因植物中有效表达外源基因 ,转基因植株绿色荧光的表型与其抗虫性密切相关。从而成功地建立了以绿色荧光蛋白基因与抗虫基因组成的融合基因转化系统 ,简化了抗虫转基因植物筛选程序 ,有助于快速获得双价抗虫转基因植株。     

拟南芥未知功能基因At4g22890 编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890 编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208 bp 的DNA 片段, 与绿色荧光蛋白(GFP) 基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP, 经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察, GFP 荧光仅在叶绿体中观察到, 表明所克隆的DNA 序列编码的多肽能够将At4g22890 编码蛋白质引导进入叶绿体, 由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

拟南芥未知功能基因At4g22890编码蛋白的叶绿体定位

蛋白质的亚细胞定位信息对于深入了解该蛋白质的功能具有重要意义。本文对一个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At4g22890编码蛋白进行了叶绿体定位研究。我们克隆了该基因5′端长208bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-cTP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥。转基因植株经激光共聚焦显微镜观察,GFP荧光仅在叶绿体中观察到,表明所克隆的DNA序列编码的多肽能够将At4g22890编码蛋白质引导进入叶绿体,由此推测该蛋白质为叶绿体蛋白质。     

基于农杆菌介导瞬时转化法的AtGLR1.4亚细胞定位分析

将拟南芥基因AtGLR1.4启动子驱动的AtGLR1.4基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合后,利用根瘤农杆菌介导瞬时转化法(Fast Agro-mediated Seedling Transfomation,FAST)浸染拟南芥幼苗,对其进行亚细胞定位的研究。转基因植株通过激光共聚焦扫描显微镜的观察,发现GFP绿色荧光在叶片表皮细胞的细胞膜上特异表达,表明At-GLR 1.4蛋白定位于细胞质膜上,为其后续的功能研究提供了线索。     

拟南芥未知功能基因At3g61870编码蛋白的叶绿体定位研究

利用反向遗传学研究方法对1个预测的拟南芥叶绿体未知功能基因At3g61870编码蛋白进行了亚细胞定位研究.通过克隆At3g61870基因5′端长229 bp的DNA片段,与绿色荧光蛋白(GFP)基因构建重组表达载体pMON530-CP-TP-GFP,经农杆菌介导转化拟南芥.转基因植株的叶肉细胞经激光共聚焦显微镜观察,叶绿素自发荧光与GFP荧光共定位于叶绿体中.结果表明,未知功能基因At3g61870编码的蛋白质为叶绿体蛋白质.     

绿色荧光蛋白标记检测鸦胆子素D抗TMV活性

以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）为报告基因,将含TMV表达载体的质粒p35S-30B：GFP转化农杆菌EHA 105,通过渗透法把经MMA诱导后的农杆菌悬浮液注射到本氏烟叶片内,测定了鸦胆子素D （Bruceine D） 对烟草植株内TMV的增殖和运动的抑制作用;通过PEG介导法把p35S-30B：GFP转化到本氏烟叶肉细胞原生质体内,测定了Bruceine D对烟草原生质体中TMV增殖的抑制效果.结果表明,在10 μg/mL浓度下,Bruceine D不仅可抑制烟草叶肉细胞原生质体中TMV的增殖,还可以抑制烟草接种叶中TMV向茎部及植株上部叶片移动,且对寄主植物不造成明显的毒害.     

Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达

构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体, 并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。 通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列, +4 位碱基分别为A和G, 且不改变氨基酸编码, 将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A, pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞, 荧光显微镜下观察绿色荧光表达, 流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率, Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染 HEK293细胞, 其中流式细胞术分析显示: pHGFP-A组GFP阳性率约为15%, pHGFP-G组GFP阳性率约为45%; Western blot 显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明, Kozak序列+4G(?3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用, 可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。     

Kozak序列+4G提高绿色荧光蛋白在HEK293细胞中的表达

构建含不同Kozak序列的绿色荧光蛋白(GFP)基因真核表达载体, 并检测它们在HEK293细胞中的表达差异。 通过设计突变的PCR引物改变目的基因GFP的Kozak序列, +4 位碱基分别为A和G, 且不改变氨基酸编码, 将PCR扩增的GFP片段与载体pcDNA3.1进行酶切、连接、转化、鉴定。成功构建的pHGFP-A, pHGFP-G质粒采用脂质体法转染HEK293细胞, 荧光显微镜下观察绿色荧光表达, 流式细胞术检测目的蛋白GFP的荧光表达阳性率, Western blot检测目的蛋白GFP的表达。构建的两质粒均能有效转染 HEK293细胞, 其中流式细胞术分析显示: pHGFP-A组GFP阳性率约为15%, pHGFP-G组GFP阳性率约为45%; Western blot 显示pHGFP-G的GFP表达量约为pHGFP-A的GFP表达量3.87倍。结果表明, Kozak序列+4G(?3位为嘌呤碱基时)在蛋白表达中发挥重要作用, 可以使绿色荧光蛋白GFP在HEK293细胞中的表达量提高约4倍。