利用TAIL-PCR技术分析拟南芥At1g52910突变体插入位点的侧翼序列

在筛选与维管发育相关的拟南芥突变体过程中,发现拟南芥基因At1g52910突变体的花器官明显异常。TAIL-PCR分析结果表明突变体为Ds单位点插入突变,突变体后代表型出现分离现象,暗示有其它突变位点存在。     

利用荧光标记高通量鉴定减数分裂重组抑制突变体

正向遗传学突变体筛选被广泛用于揭示减数分裂中涉及的遗传基因, 如调控减数分裂II型交叉形成途径的重组抑制基因。该研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉荧光标记系进行EMS突变体的正向遗传学筛选, 鉴定拟南芥野生型Col遗传背景下的重组抑制突变体, 共获得18个重组率显著提高3倍以上的重组抑制突变体, 其中包括显性和隐性遗传突变。研究表明, 基于荧光标记高通量鉴定重组抑制突变体是可行的, 可为植物减数分裂重组调控分子机制研究提供新方法和突变材料。     

利用荧光标记高通量鉴定减数分裂重组抑制突变体

正向遗传学突变体筛选被广泛用于揭示减数分裂中涉及的遗传基因, 如调控减数分裂II型交叉形成途径的重组抑制基因。该研究利用拟南芥(Arabidopsis thaliana)花粉荧光标记系进行EMS突变体的正向遗传学筛选, 鉴定拟南芥野生型Col遗传背景下的重组抑制突变体, 共获得18个重组率显著提高3倍以上的重组抑制突变体, 其中包括显性和隐性遗传突变。研究表明, 基于荧光标记高通量鉴定重组抑制突变体是可行的, 可为植物减数分裂重组调控分子机制研究提供新方法和突变材料。     

快速筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因的方法

阐明拟南芥受精和早期胚胎发生过程对理解被子植物生殖发育有着重要的指导意义,而利用正向遗传学方法研究拟南芥突变体的表型及其分子机理是探究植物基因功能最常用的一种方法。基于常规的插入突变(包括T-DNA和转座子)、化学诱变(如ethylmethane sulfonate,EMS)和高能射线方法构建的突变体库中假阳性突变体多,难以高效筛选到受精和早期胚胎发生相关基因的突变体。为解决这一难题,本研究建立了一种构建T-DNA插入突变体文库的新方法。即在载体p CAMBIA1302的T-DNA元件上增加花粉特异荧光标记基因(p LAT52∷EGFP),并遗传转化具有四分体花粉的Columbia野生型拟南芥突变体qrt1-2;对获得的突变体库可利用花粉荧光快速排除假阳性突变体,并采用反向PCR(inverse-PCR)扩增技术确定突变位点。此方法在筛选拟南芥受精和早期胚胎发生相关基因突变体上的成功应用表明,其是一种效率高、针对性强、操作相对快捷方便的拟南芥突变体筛选方法。     

拟南芥光形态突变体的筛选与基因鉴定

以哥伦比亚(Columbia)野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料,用含有激活标记双元质粒pCB260的农杆菌浸花进行转化,构建拟南芥T-DNA插入突变体库.通过突变体的筛选和表型分析,获得了两株光形态突变体,子叶下胚轴伸长的光抑制效应减弱.通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced-PCR)技术,成功扩增出突变植株T-DNA插入位点侧翼序列,经NCBI序列比对,T-DNA分别插在CRY1第一和第三外显子部位.突变体的表型分析及PCR鉴定结果表明,T-DNA插入CRY1并影响到突变植株的光形态建成.     

利用氧化剂甲基紫精筛选拟南芥寿限延长突变体

在模式动物中的研究表明,寿限延长与氧化胁迫耐受能力密切有关;在模式植物拟南芥中也发现晚花突变体具有更强的抗氧化胁迫能力,但迄今为止未见有关拟南芥寿限延长突变体的研究报道。本文建立了用氧化剂甲基紫精筛选寿限延长突变体的方法,并对用该方法从经快中子诱变的拟南芥Columbia生态型M2代群体中筛选获得的突变体SFNA-9—4进行分析,发现该突变体的抗氧化胁迫能力和寿限均显著增加。由此说明,用该方法筛选拟南芥寿限延长突变体是可行的。     

利用氧化剂甲基紫精筛选拟南芥寿限延长突变体

在模式动物中的研究表明,寿限延长与氧化胁迫耐受能力密切有关;在模式植物拟南芥中也发现晚花突变体具有更强的抗氧化胁迫能力,但迄今为止未见有关拟南芥寿限延长突变体的研究报道。本文建立了用氧化剂甲基紫精筛选寿限延长突变体的方法,并对用该方法从经快中子诱变的拟南芥Columbia生态型M_2代群体中筛选获得的突变体SFNA-9-4进行分析,发现该突变体的抗氧化胁迫能力和寿限均显著增加。由此说明,用该方法筛选拟南芥寿限延长突变体是可行的。     

聚乙二醇模拟水分胁迫筛选拟南芥突变体的新方法

在以聚乙二醇（PEG）模拟水分胁迫的条件下,分别在拟南芥种子萌发期和幼苗期以25％和30％为选择浓度,根据一种子是否萌发和幼苗能否存活为指标,筛选拟南芥抗水分胁迫突变体。此法操作简单,方便快捷,特别适合实验室进行大规模筛选。我们用这种方法筛选了T—DNA插入的拟南芥突变体库,得到78株可能是拟南芥抗水分胁迫的突变体。     

拟南芥角质层发育突变体中WBC11基因的分析与鉴定

从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)突变体库中筛选到一个发育突变体ku7fy1,其突变表型为叶片狭长,生长缓慢。该研究利用图位克隆技术和候选基因测序鉴定出ku7fy1角质层发育基因(white-brown complex11,WBC11)有一个点突变。对该突变体cDNA测序结果显示,WBC11基因的突变导致其第7个内含子在形成成熟mRNA时无法被正常剪切,使该突变体内WBC11的mRNA大量降解并在翻译时提前引入终止密码子。甲苯胺蓝染色实验显示,突变体叶片表面角质层有缺陷;遗传互补实验进一步证明,突变体ku7fy1中的突变基因是WBC11,ku7fy1表型是由WBC11突变造成的。     

拟南芥高温诱导组织坏死突变体(eil)的鉴定分析

eil是新发现的高温诱导叶片出斑的拟南芥突变体,遗传分析表明该突变体是核遗传单基因隐性突变的纯合体。对野生型和突变体H2O2含量和组织染色的分析结果表明,在突变体表型出现前就有H2O2的积累;突变体幼苗生长在含有DPI[NAD(P)H氧化酶抑制剂]的培养基中,高温条件下没有观察到突变体叶片出斑。实验结果表明拟南芥EIL基因功能与氧爆发有关,氧爆发引起了eil细胞死亡,EIL是负调氧爆发的基因。     

拟南芥突变体uro的表型分析表明URO基因参与生长素调节的植物发育过程

在筛选拟南芥(ArabidopsisthalianaL.)叶突变体的过程中获得拟南芥uprightrosette(uro)突变体。uro为半显性突变体,因突变体在幼苗生长期莲座叶竖直生长而得名。对uro突变体的表型进行了详细的分析,结果表明uro突变不仅造成叶生长模式的改变,还出现多种其他异常表型。uro杂合和纯合突变体都表现出植物顶端优势的丧失,纯合突变体表现得更为严重。uro纯合突变体的一些二级分枝会被叶取代,这种叶的叶柄与叶片远轴面连接。突变体的花发育也有多种异常表型,主要表现为花瓣及雄蕊数目的改变、花器官的同源异型转化和不同花器官的融合。uro突变体茎软,细胞学水平分析表明突变体的内皮层组织发生增生,束间纤维发育及维管束分化受阻。顶端优势的丧失及维管组织的异常发育表明,URO基因可能参与生长素对植物发育的调节。pin1uro双突变体表型的分析表明,虽然双突变茎表型出现了两亲本表型的叠加,但双突变体的花却出现了新的表型,说明URO与PIN1基因在调节植物发育过程中具有部分遗传上的相互作用,这一结果进一步证明URO基因参与了生长素调节的植物发育过程。     

拟南芥H_2O_2突变体的筛选及特性分析

通过化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)诱变模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)获得突变体筛选群体.在5 mmol/L H2O2胁迫下,以叶片温度差异为筛选指标,利用远红外成像技术进行突变体的筛选,获得了对H2O2不敏感突变体hpi1(hydrogen peroxide-insensitive1)和敏感突变体hps1(hydrogen peroxide-sensitive1).进一步研究发现,两种突变均为单基因隐性突变,气孔密度同野生型一样,而叶片温度、气孔开度和叶片失水率则有明显的差异.种子萌发实验表明,hpi1对甘露醇(Man)和NaCl不敏感而对ABA敏感,hps1则对3种胁迫都表现出敏感特性.     

拟南芥突变体uro的表型分析表明URO基因参与生长素调节的植物发育过程

在筛选拟南芥(Arabidopsisthaliana L.)叶突变体的过程中获得拟南芥upright rosette(uro)突变体.uro为半显性突变体,因突变体在幼苗生长期莲座叶竖直生长而得名.对uro突变体的表型进行了详细的分析,结果表明:uro突变不仅造成叶生长模式的改变,还出现多种其他异常表型.uro杂合和纯合突变体都表现出植物顶端优势的丧失,纯合突变体表现得更为严重.uro纯合突变体的一些二级分枝会被叶取代,这种叶的叶柄与叶片远轴面连接.突变体的花发育也有多种异常表型,主要表现为花瓣及雄蕊数目的改变、花器官的同源异型转化和不同花器官的融合.uro突变体茎软,细胞学水平分析表明突变体的内皮层组织发生增生,束间纤维发育及维管束分化受阻.顶端优势的丧失及维管组织的异常发育表明,URO基因可能参与生长素对植物发育的调节.pin1 uro双突变体表型的分析表明,虽然双突变茎表型出现了两亲本表型的叠加,但双突变体的花却出现了新的表型,说明URO-与PIN1基因在调节植物发育过程中具有部分遗传上的相互作用,这一结果进一步证明URO基因参与了生长素调节的植物发育过程.     

拟南芥叶绿体分裂突变体pdl37的基因鉴定与分析

pd137是经甲基磺酸乙脂（ethyl methane sulphonate, EMS）诱变并通过筛选得到的一个拟南芥叶绿体分裂突变体。该突变体的叶绿体表型与野生型相比有很大差异： 叶绿体面积显著增大, 细胞中叶绿体数量明显减少。遗传分析显示pd137的突变表型受隐性单基因控制。本研究通过遗传作图将该突变基因粗定位于拟南芥2号染色体的分子标记CH2-13.70和CH2-16.0区间内。该区间内已知的与叶绿体分裂相关的基因只有FtsZ2-1。对FtsZ2-1基因的测序结果显示pd137突变体的FtsZ2-1基因第505位碱基发生了无义突变, 使蛋白质翻译提前终止。该突变还严重影响了FtsZ2-1基因的mRNA水平。转基因互补实验进一步验证了该突变体表型是由于FtsZ2-1基因突变引起。本项工作为研究叶绿体分裂的机制提供了新材料和一些有用的线索。     

拟南芥叶绿体分裂突变体pd137的基因鉴定与分析

pd137是经甲基磺酸乙脂(ethyl methane sulphonate,EMS)诱变并通过筛选得到的一个拟南芥叶绿体分裂突变体。该突变体的叶绿体表型与野生型相比有很大差异:叶绿体面积显著增大,细胞中叶绿体数量明显减少。遗传分析显示pd137的突变表型受隐性单基因控制。本研究通过遗传作图将该突变基因粗定位于拟南芥2号染色体的分子标记CH2-13.70和CH2-16.0区间内。该区间内已知的与叶绿体分裂相关的基因只有FtsZ2-1。对FtsZ2-1基因的测序结果显示pd137突变体的FtsZ2-1基因第505位碱基发生了无义突变,使蛋白质翻译提前终止。该突变还严重影响了FtsZ2-1基因的mRNA水平。转基因互补实验进一步验证了该突变体表型是由于FtsZ2-1基因突变引起。本项工作为研究叶绿体分裂的机制提供了新材料和一些有用的线索。     

拟南芥活性氧不敏感型突变体筛选与特性分析

采用EMS化学诱变方法与H2O2氧化胁迫选择,以根在重力作用下的弯曲生长为指标,筛选得到拟南芥活性氧不敏感型突变体。对突变体杂交后代遗传分析表明,突变株对活性氧不敏感性状为隐性单基因突变所致;生理生化分析表明突变体对H2O2有很强的抗性,表现为气孔开度对H2O2不敏感和H2O2胁迫时较低的膜脂过氧化水平。运用LSCM技术并结合H2O2荧光探针H2DCFDA检测外源ABA诱导保卫细胞内产生H2O2的情况,结果显示突变体体内荧光强度比对照低,暗示了突变体体内消除H2O2的能力可能有所提高,增强了植株对氧化胁迫的抗性。拟南芥活性氧不敏感突变体的筛选,不仅为人们深入研究活性氧在细胞内的作用提供良好的实验材料,而且还将大大加深人们对信号转导途径的再认识。     

ATMYB123和ATKOR1基因参与拟南芥根发育的调控

从拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选到2个根发育相关基因ATMYB123和ATKOR1表达缺失的突变体atmyb123和atkor1,通过杂交构建这两个基因表达缺失的双突变体atmyb123/atkor1,以明确这两个基因在根发育中的作用。结果显示:(1)ATMYB123表达缺失突变体atmyb123植株地上部分发育减缓,种皮颜色变黄,而ATKOR1表达缺失突变体atkor1植株在这两方面与其野生型没有明显差异;两基因缺失均显著影响了拟南芥根的发育,根生长受到了严重抑制。(2)双突变体atmyb123/atkor1在植株形态和种皮颜色方面表现出单突变体AT-MYB123的特点,而其根长却介于两单突变体的中间。(3)进一步研究发现,培养基pH改变、NaCl处理、外源GA施用均没有改变突变体根生长趋势,显示这3种因素与两基因缺失突变引起的根发育抑制无关。研究表明,AT-MYB123和ATKOR1基因参与拟南芥根的发育调控,转录因子ATMYB123可能作为主调控因子参与ATKOR1对拟南芥根发育的调控。     

拟南芥活性氧不敏感型突变体的筛选与特性分析

采用 EMS化学诱变方法与 H2 O2 氧化胁迫选择 ,以根在重力作用下的弯曲生长为指标 ,筛选得到拟南芥活性氧不敏感型突变体。对突变体杂交后代遗传分析表明 ,突变株对活性氧不敏感性状为隐性单基因突变所致 ;生理生化分析表明突变体对 H2 O2 有很强的抗性 ,表现为气孔开度对 H2 O2 不敏感和 H2 O2 胁迫时较低的膜脂过氧化水平。运用 L SCM技术并结合 H2 O2 荧光探针 H2 DCFDA检测外源 ABA诱导保卫细胞内产生 H2 O2 的情况 ,结果显示突变体体内荧光强度比对照低 ,暗示了突变体体内消除 H2 O2 的能力可能有所提高 ,增强了植株对氧化胁迫的抗性。拟南芥活性氧不敏感突变体的筛选 ,不仅为人们深入研究活性氧在细胞内的作用提供良好的实验材料 ,而且还将大大加深人们对信号转导途径的再认识     

拟南芥白化突变体心口的基因定位与分析

EMS30是拟南芥经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变得到的白化突变体。该突变体的叶绿体结构存在严重缺陷,同时伴随叶绿素缺失。遗传分析显示EMS30突变体的突变表型受隐性单基因控制。采用图位克隆的方法对EMS30突变基因进行定位的结果显示,该基因位于拟南芥第一条染色体的分子标记F21M12和F14N23之间的96kb区间内,该区间包含25个基因。通过生物信息学分析发现,该区间内有3个基因定位在叶绿体或与叶绿体发育相关。这些结果有助于该基因的克隆,为阐释叶绿体发育提供线索。     

拟南芥干旱突变体远红外成像技术的筛选和特性鉴定

利用化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)对模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行化学诱变获得突变体筛选群体。在干旱胁迫下,以叶片的温度差异为筛选指标,利用远红外成像技术进行突变体的筛选,获得了对干旱不敏感突变体dri1(drought-insensitive 1)和敏感突变体drs1(drought-sensitive 1)。实验结果表明dri1和drs1为单基因隐性突变,气孔密度同野生型无差异,而叶片温度、气孔开度和叶片失水率则有明显改变。在MS培养基上的种子萌发实验表明在ABA、甘露醇和NaCl胁迫下dri1萌发率要比野生型高,而drs1则比野生型低。对突变基因的研究有待进一步进行。