利用TAIL-PCR技术分析拟南芥At1g52910突变体插入位点的侧翼序列

在筛选与维管发育相关的拟南芥突变体过程中,发现拟南芥基因At1g52910突变体的花器官明显异常。TAIL-PCR分析结果表明突变体为Ds单位点插入突变,突变体后代表型出现分离现象,暗示有其它突变位点存在。     

拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定

叶的极性建立直接决定叶的平展性发育,极性改变导致叶形态异常,影响植物体的各种正常生理活动。利用反向遗传学方法,从拟南芥基因激活标签突变体库中分离到一个叶片边缘锯齿状表型的突变体（命名为pCB1294）,该突变体同时表现出叶表皮腺毛形态发育异常。通过TailPCR方法成功定位突变基因为At5g41663,该基因编码miR319b基因。Real time PCR显示,pCB1294突变体植株中miR319b基因的表达量是野生型（col）植株的11倍多。所得结果为进一步研究miRNA调控叶极性的分子机制和进一步分析miR319b与叶形态发生的关系奠定了基础。     

拟南芥叶绿体分裂突变体pdl37的基因鉴定与分析

pd137是经甲基磺酸乙脂（ethyl methane sulphonate, EMS）诱变并通过筛选得到的一个拟南芥叶绿体分裂突变体。该突变体的叶绿体表型与野生型相比有很大差异： 叶绿体面积显著增大, 细胞中叶绿体数量明显减少。遗传分析显示pd137的突变表型受隐性单基因控制。本研究通过遗传作图将该突变基因粗定位于拟南芥2号染色体的分子标记CH2-13.70和CH2-16.0区间内。该区间内已知的与叶绿体分裂相关的基因只有FtsZ2-1。对FtsZ2-1基因的测序结果显示pd137突变体的FtsZ2-1基因第505位碱基发生了无义突变, 使蛋白质翻译提前终止。该突变还严重影响了FtsZ2-1基因的mRNA水平。转基因互补实验进一步验证了该突变体表型是由于FtsZ2-1基因突变引起。本项工作为研究叶绿体分裂的机制提供了新材料和一些有用的线索。     

拟南芥叶绿体分裂突变体pd137的基因鉴定与分析

pd137是经甲基磺酸乙脂(ethyl methane sulphonate,EMS)诱变并通过筛选得到的一个拟南芥叶绿体分裂突变体。该突变体的叶绿体表型与野生型相比有很大差异:叶绿体面积显著增大,细胞中叶绿体数量明显减少。遗传分析显示pd137的突变表型受隐性单基因控制。本研究通过遗传作图将该突变基因粗定位于拟南芥2号染色体的分子标记CH2-13.70和CH2-16.0区间内。该区间内已知的与叶绿体分裂相关的基因只有FtsZ2-1。对FtsZ2-1基因的测序结果显示pd137突变体的FtsZ2-1基因第505位碱基发生了无义突变,使蛋白质翻译提前终止。该突变还严重影响了FtsZ2-1基因的mRNA水平。转基因互补实验进一步验证了该突变体表型是由于FtsZ2-1基因突变引起。本项工作为研究叶绿体分裂的机制提供了新材料和一些有用的线索。     

拟南芥光形态突变体的筛选与基因鉴定

以哥伦比亚(Columbia)野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为实验材料,用含有激活标记双元质粒pCB260的农杆菌浸花进行转化,构建拟南芥T-DNA插入突变体库.通过突变体的筛选和表型分析,获得了两株光形态突变体,子叶下胚轴伸长的光抑制效应减弱.通过TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced-PCR)技术,成功扩增出突变植株T-DNA插入位点侧翼序列,经NCBI序列比对,T-DNA分别插在CRY1第一和第三外显子部位.突变体的表型分析及PCR鉴定结果表明,T-DNA插入CRY1并影响到突变植株的光形态建成.     

拟南芥矮小丛生突变体的分离与分子鉴定

顶端优势是指侧生分生组织的生长被主茎或主花序所抑制.最近的研究通过分离和鉴定顶端优势发生改变的突变体开始揭示顶端优势的分子机制.通过T-DNA标签法分离了拟南芥矮小丛生(bushy and dwarf 1, bud1 )突变体.突变体植株的表型包括顶端优势丧失、株型矮小,表明bud1 突变体存在生长素代谢、运输或信号传导的缺陷.一个对生长素特异反应的启动子驱动的报告基因在bud1 中表达模式改变.生长素敏感性和运输能力的测定表明这两个过程在 bud1中均正常.以上结果显示bud1 表型是生长素代谢缺陷的结果.遗传分析表明BUD1 为半显性突变且与一个T-DNA插入共分离,可通过iPCR方法分离.     

拟南芥矮小丛生突变体的分离与分子鉴定

顶端优势是指侧生分生组织的生长被主茎或主花序所抑制。最近的研究通过分离和鉴定顶端优势发生改变的突变体开始揭示顶端优势的分子机制。通过T-DNA标签法分离了拟南芥矮小丛生(bushy and dwarf l,budl)突变体。突变体植株的表型包括顶端优势丧失、株型矮小,表明budl突变体存在生长素代谢、运输或信号传导的缺陷。一个对生长素特异反应的启动子驱动的报告基因在budl中表达模式改变。生长素敏感性和运输能力的测定表明这两个过程在budl中均正常。以上结果显示budl表型是生长素代谢缺陷的结果。遗传分析表明BUDI为半显性突变且与一个T-DNA插入共分离,可通过iPCR方法分离。     

拟南芥种皮色素形成突变体的筛选与表型鉴定

类黄酮在植物应答各种环境胁迫和种皮发育调控中起着重要作用。通过甲基磺酸乙酯（EMS）诱变筛选获得1个透明种皮突变体,与野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）(Col-0)相比,突变体成熟的种子颜色为黄色,其表型性状由隐性单基因控制。利用图位克隆和精细定位技术将突变基因定位于5号染色体MAH20的BAC上,是TT4(At5G13930)基因的第1 299位碱基C突变为T,使得第324位氨基酸甘氨酸突变为谷氨酸。TT4(transparent testa 4)编码1个类黄酮合成的结构基因查尔酮合酶（CHS）,突变后种皮透明,种子颜色为黄色,突变体命名为tt4-1。利用功能回补突变体恢复褐色种皮表型,进一步证明了TT4在调节种皮颜色发育过程的重要作用。启动子偶联GUS基因组织表达分析显示TT4基因在植株幼苗的根、茎、叶和花中均有表达,生理表型分析结果显示与野生型相比,突变体tt4-1种子萌发早,幼苗主根短、侧根和根毛较多,成苗叶片气孔开度大和失水率高等特性。该研究将为进一步阐述TT4基因功能奠定理论依据。     

拟南芥IQM3基因的表达分析及其突变体的鉴定

对拟南芥(Arabidopsis thaliana)IQM3基因的功能进行了分析.结果表明,推定IQM3的启动子中存在多种光、非生物胁迫和植物激素反应的顺式作用元件,可能参与植物对环境变化的反应.RT-PCR分析表明,IQM3在拟南芥莲座叶、花序叶、茎、花和根中的表达较强,但在荚果中的表达很弱;IQM3基因的T-DNA插入突变体iqm3-1和iqm3-2分别是功能缺失和超表达突变体,对这些突变体的表型分析表明,IQM3基因与种子萌发及幼苗子叶膨大有密切关系.     

拟南芥MeIAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

生长素是最重要的植物激素之一,参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的IAA是生长素的主要活性形式,在IAA甲基转移酶1（IAMT1）的作用下,IAA可以转变为IAA甲酯（MelAA）。MelAA本身没有活性,在植物体内的MelAA酯解酶作用下可以重新转变为IAA。MelAA是非极性分子,能够在植物体内自由扩散。利用MelAA的这种特殊性质筛选突变体,可以分离到MelAA代谢途径或者IAA途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行EMS诱变,通过观察黑暗下下胚轴的生长情况,筛选MelAA的抗性突变体。我们成功分离到了8株可能的抗性突变体,并对其中的一个Methyl-JAAresistant1（mir1）突变体进行了深入分析。MelAA抗性突变体的筛选将为进一步了解MelAA的代谢、IAA稳态调控和响应机理提供新的材料。     

拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3的PCR鉴定

应用两种植物T-DNA插入突变体PCR鉴定方法,即“三引物法”和“双引物法”对拟南芥T-DNA插入突变体atsuc3（目的基因两条染色体均发生T-DNA插入的纯合突变体）进行鉴定和比较的结果表明,“三引物法”由于易产生非特异性扩增而无法得到PCR鉴定结果,从而导致鉴定失败;“双引物法”则可避免此种现象,得到可靠、有效的鉴定结果。     

拟南芥 MeIAA 抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

生长素是最重要的植物激素之一, 参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的IAA是生长素的主要活性形式, 在IAA甲基转移酶1(IAMT1)的作用下, IAA可以转变为IAA甲酯 (MeIAA)。MeIAA本身没有活性, 在植物体内的MeIAA酯解酶作用下可以重新转变为IAA。 MeIAA是非极性分子, 能够在植物体内自由扩散。利用MeIAA的这种特殊性质筛选突变体, 可以分离到MeIAA代谢途径或者IAA途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行EMS诱变, 通过观察黑暗下下胚轴的生长情况, 筛选MeIAA的抗性突变体。我们成功分离到了8株可能的抗性突变体, 并对其中的一个Methyl -IAA resistant 1 (mir1) 突变体进行了深入分析。MeIAA抗性突变体的筛选将为进一步了解MeIAA的代谢、IAA稳态调控和响应机理提供新的材料。     

拟南芥MelAA抗性突变体的筛选和初步图位克隆分析

生长素是最重要的植物激素之一,参与了植物生长发育的各个方面。植物体内游离的IAA是生长素的主要活性形式,在IAA甲基转移酶1（IAMT1）的作用下,IAA可以转变为IAA甲酯（MelAA）。MelAA本身没有活性,在植物体内的MelAA酯解酶作用下可以重新转变为IAA。MelAA是非极性分子,能够在植物体内自由扩散。利用MelAA的这种特殊性质筛选突变体,可以分离到MelAA代谢途径或者IAA途径中新的成分。我们对拟南芥种子进行EMS诱变,通过观察黑暗下下胚轴的生长情况,筛选MelAA的抗性突变体。我们成功分离到了8株可能的抗性突变体,并对其中的一个Methyl-JAAresistant1（mir1）突变体进行了深入分析。MelAA抗性突变体的筛选将为进一步了解MelAA的代谢、IAA稳态调控和响应机理提供新的材料。     

拟南芥高温诱导组织坏死突变体(eil)的鉴定分析

eil是新发现的高温诱导叶片出斑的拟南芥突变体,遗传分析表明该突变体是核遗传单基因隐性突变的纯合体。对野生型和突变体H2O2含量和组织染色的分析结果表明,在突变体表型出现前就有H2O2的积累;突变体幼苗生长在含有DPI[NAD(P)H氧化酶抑制剂]的培养基中,高温条件下没有观察到突变体叶片出斑。实验结果表明拟南芥EIL基因功能与氧爆发有关,氧爆发引起了eil细胞死亡,EIL是负调氧爆发的基因。     

拟南芥角质层发育突变体中WBC11基因的分析与鉴定

从拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)突变体库中筛选到一个发育突变体ku7fy1,其突变表型为叶片狭长,生长缓慢。该研究利用图位克隆技术和候选基因测序鉴定出ku7fy1角质层发育基因(white-brown complex11,WBC11)有一个点突变。对该突变体cDNA测序结果显示,WBC11基因的突变导致其第7个内含子在形成成熟mRNA时无法被正常剪切,使该突变体内WBC11的mRNA大量降解并在翻译时提前引入终止密码子。甲苯胺蓝染色实验显示,突变体叶片表面角质层有缺陷;遗传互补实验进一步证明,突变体ku7fy1中的突变基因是WBC11,ku7fy1表型是由WBC11突变造成的。     

拟南芥抗凋亡突变体fbr136的分离鉴定与分析

植物细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)在植物的生长发育进程以及防御生物与非生物胁迫的过程中具有重要的作用.Fumonisin B1(FB1)是一种真菌毒素,是鞘脂生物合成途径中关键酶神经酰胺合酶(ceramide synthase)的竞争性抑制剂.FB1在动植物细胞中均能够诱导PCD.为了探索植物PCD的机制,通过筛选拟南芥抗FB1的突变体,分离鉴定了11个,fumonisin B1 resistant (fbr)突变体.遗传分析表明,这些突变体分别是由9个相同或者不同的遗传座位突变造成的.对其中一个代表性的突变体fbr136进行了详细的表型分析和初步遗传定位.fbr136对其他PCD诱导剂,例如H2O2或paraquat也表现出一定的抗性或耐受性,而且在fbr136突变体中FB1不能正常诱导PR1基因的表达,说明fbr136突变体PCD的发生可能受到阻碍.硝基四唑(Nitroblue tetrazolium,NBY)染色表明,FBl处理fbr136突变体后产生和积累活性氧(reactive oxygenspecies)比野生型植物显著降低,暗示其抗凋亡表型可能与活性氧的产生有关.推测FBR136可能是FB1在诱导PCD过程中,从鞘脂含量变化到活性氧积累变化这一途径的一个重要的调控因子.fbr136被定位于染色体Ⅲ上,与以往鉴定的抗FB1突变基因的定位都不同,因此,FBR136可能是FB1诱导PCD信号途径中的一个新基因.     

拟南芥线粒体蛋白突变体ssr1-2表型的详细鉴定与分析

SSR1在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中编码一个线粒体蛋白,为深入了解SSR1基因在植物生长发育和逆境应答中的作用,以ssr1-2及其抑制子突变体EMS143和EMS145为材料,对其根和地上部分的生长,及其对脯氨酸的敏感性和铁稳态进行跟踪分析,并利用拟南芥幼苗嫁接技术分析了ssr1-2短根表型对地上部分生长的影响。结果表明：ssr1-2主根长变短,根系的形态与须根系类似。地上部分也小于野生型,但出现得晚于根短表型。嫁接试验结果表明,突变体的根能限制野生型的地上部分生长,反之突变体的地上部分也能影响野生型的根,但前者的作用更大。ssr1-2在种子萌发、根长和叶绿素含量等指标上表现出对脯氨酸的超敏感表型。此外,ssr1-2对铁营养不敏感,即铁盐对其生长的促进作用显著小于WS野生型,说明其利用铁的能力显著下降。这些结果表明SSR1可能通过影响铁营养利用参与拟南芥根生长的调控,暗示线粒体铁元素利用机制的损伤可能是脯氨酸对植物生长发育抑制作用加强的原因之一。     

拟南芥株型突变体zpr1的性状特征与基因鉴定分析

对本研究室经T-DNA插入法获得的拟南芥株型突变株系——隐性突变体zpr1植株进行植物学性状调查和遗传分析,并对该突变基因进行鉴定、表达定位和调控元件分析。结果显示:(1)性状分析表明,与野生型拟南芥Ws-2相比,突变体zpr1的茎生叶分枝数量增加,茎生叶分枝发生于拟南芥顶端花序部位;野生型拟南芥茎生叶为披针形,而突变体zpr1没有出现分枝的茎生叶呈倒卵形,出现分枝的茎生叶呈披针型;突变体zpr1的主花序高度、株高、分枝高度和分枝长度都高于野生型,且分枝数多于野生型。(2)利用质粒挽救和反向PCR法(IPCR)确定了ZPR1基因突变发生位置是该基因起始密码子上游426bp处,证明T-DNA插入破坏了ZPR1基因的启动子区域,导致该基因在拟南芥内不能正常表达。(3)基因转录调控区域的顺式作用元件分析发现在ZPR1基因的转录调控区有多个与植物激素相关的调控元件,还有与光周期调节相关的调控元件。(4)亚细胞定位发现,ZPR1基因在所有细胞中的细胞膜中表达,而在部分细胞的细胞膜、细胞质和细胞核中均有表达。研究表明,ZPR1基因的表达对植物株型发育有重要的调控作用,该基因的表达水平受植物激素和光照的调节,最终导致了植物株型的变化。     

拟南芥光周期开花突变体的筛选和基因的鉴定

以双子叶模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）突变体crylcry2为实验材料,用舍有激活标记质粒DSK1015的农杆菌浸花进行转化,构建了拟南芥T-DNA插入突变体库．通过筛选和观察分析,获得了一些开花时间比crylcry2明显延迟或明显提早的突变体．采用IPCR（inverse PCR）和TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）等方法,鉴定了这些突变体T-DNA插入位点的基因组旁邻序列,并采用半定量RT-PCR对插入位点两侧基因的mRNA水平进行了分析,初步鉴定了与开花相关的候选基因,为进一步研究其功能,深入研究隐花素调节光周期开花的作用机制奠定了基础．