多种S1断裂内含肽的体内交叉反应

断裂内含肽含有两个独立分离的多肽片段(N端内含肽和C端内含肽),它催化蛋白质反式剪接反应,在蛋白质研究与蛋白质工程中已得到诸多实际应用.在蛋白质反式剪接过程中,内含肽的N端内含肽和C端内含肽通过结构互补特异性地非共价组合.然而,Ssp DnaX S1型断裂内含肽的较大C端内含肽片段近来被发现能够与源自其它内含肽的N端内含肽片段交叉反应,表明蛋白质内含子Ssp DnaX具有结构杂交特征.本研究对另外2种S1型内含肽Rma DnaB和Ssp GyrB的较大C端内含肽与不同S1型断裂内含肽的N 端内含肽交叉反应活性进行分析检测.目的是探讨S1型断裂内含肽的结构杂交特征是否具有普遍性.结果发现,Rma DnaB的S1 C端内含肽能够与Ssp GyrB的S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1 N端内含肽交叉反应;与此相似,Ssp GyrB的S1 C端内含肽能够与Rma DnaB的 S1 N端内含肽交叉反应,却不能与Ssp DnaX的S1 N端内含肽交叉反应.此外,某些交叉反应表现出温度依赖性.这些结果对于内含肽的结构 功能关系以及S1型断裂内含肽的应用研究具有重要的意义.     

新型断裂内含肽介导的可控性C端断裂

内含肽介导的蛋白质断裂被广泛地应用于蛋白质纯化、连接和环化. 但目前的方法都是用传统的连续的内含肽来介导蛋白质断裂反应,因而往往存在自发性断裂、产率低等问题. 本实验选择3个S1型新型断裂内含肽Ter ThyX、Ssp GryB和Rma DnaB来实现蛋白质断裂反应的可控性. 在可控性C端断裂反应中,S1型断裂内含肽的C端片段（IC ）与硫氧还蛋白（T）融合作为前体蛋白,加入化学合成的Ssp DnaB S1型断裂内含肽 的N端小肽与二硫苏糖醇（DTT）共同诱导C端断裂反应.结果表明,该小肽可以诱导这 3个不同的S1型断裂内含肽的前体蛋白发生C端断裂反应. 该方法为利用内含肽C端断 裂介导的蛋白质纯化提供了更多的选择,并为内含肽的结构与功能的关系研究提供-有用的线索.     

内含肽在构建亲和纯化系统中的应用

内含肽是前体未成熟蛋白中的一段具有自我剪接功能的多肽链,在蛋白质纯化、蛋白质连接、环肽制备、蛋白标记以及生物传感器等方面广泛应用。本文综述了内含肽应用于蛋白质亲和纯化的发展历程,分别对层析型和非层析型内含肽纯化体系进行了分析和讨论,并总结了对控制内含肽断裂反应所进行的研究,为进一步改善内含肽介导蛋白质纯化提供依据和线索。     

内含肽介导的蛋白连接技术及其应用

内含肽介导的蛋白质剪接是一种自发的翻译后事件,内含肽可介导其自身从前体蛋白上切除,同时将其两侧的外显肽连接起来.在过去10多年中,基于蛋白质剪接原理发展出的蛋白连接技术被广泛的用于蛋白质工程的研究中.这些技术打破了化学合成方法中对目标物大小的限制,有助于化学和生物学的研究.针对近年由蛋白质连接演化出来的新技术及其应用做简要的阐述.     

内含肽介导的氯离子通道蛋白CFTR的反式剪接

研究利用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接功能在大肠杆菌中对囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR)的反式剪接作用.CFTR基因突变导致一种常染色体隐性遗传疾病囊性纤维化(cystic fibrosis, CF).将CFTR的cDNA于剪接反应所需的保守性氨基酸残基Ser-660前断裂为N端和C端,分别与split mini Ssp DnaB 内含肽的106个氨基酸残基的N端和48个氨基酸残基的C端编码序列融合,构建到原核表达载体pBV220 诱导表达后SDS-PAGE可见预期大小剪接形成的CFTR蛋白条带,Western印迹用CFTR特异性抗体进一步证明为剪接所产生的CFTR蛋白,表明内含肽可有效催化CFTR的反式剪接.     

蛋白质内含肽及其生物学意义

蛋白质内含肽是存在于前体蛋白质中的一段多肽链,靠自我剪切的方式从前体蛋白中释放出来。蛋白质内含肽的发现,不仅在理论上丰富了遗传信息翻译后加工的内容,而且在实践上有重大的生物学意义,特别是在蛋白质纯化方面有着广泛的应用前景。本文就蛋白质内含肽的发现、特征、鉴定、剪接机制及其生物学意义作一概述。     

微生物内含肽在基因治疗中的应用

蛋白质内含肽是存在于前体蛋白质中的一段多肽,依靠蛋白质自剪接这一特殊机制从前体蛋白中释放出来,并且使两侧的蛋白质外显肽连接成为成熟的蛋白质。本文就内含肽在基因治疗方面的研究做一综述。     

内含肽介导的生物学效应及其应用

蛋白质翻译产物在成熟过程中剪切释放出来的一段氨基酸序列称为“intein”---即内含肽。它与前体蛋白以框内融合的形式共同翻译,并内嵌于前体蛋白序列中。内含肽的解离以及内含肽两侧氨基酸序列的连接是在内含肽自身催化作用下完成的。本文将从内含肽的发现、结构特征和作用机理等方面对这种具有特殊意义的蛋白质成熟机制进行较为全面的论述,同时介绍了近年来发展起来的以内含肽介导的蛋白质剪接为基础的蛋白质纯化和改造技术。     

通过断裂内含肽介导的反式剪接合成大的蛋白

大肠杆菌难以表达大的蛋白,毒性蛋白以及膜蛋白,“Npu DnaE内含肽表达系统“使这些蛋白的表达成为可能。该系统的基本原理是：在特定位点处将目标基因（编码T7 RNA聚合酶的基因）断裂成两部分,然后分别与Npu DnaE内含肽的N端,C端片段融合,两种融合基因分别表达纯化,在体外将两种融合蛋白等摩尔比混合即可产生有功能的T7 RNA聚合酶。理论上,该体系也可用于合成其他大的蛋白,毒性蛋白或膜蛋白。     

内含肽介导的新型蛋白质纯化技术

内含肽（intein）的自切割功能在蛋白质工程领域有着广泛的应用,尤其是在蛋白质纯化方面,将内含肽与亲和纯化技术联合应用,使得传统的亲和纯化方式有了重大的突破。近年来,随着内含肽的研究不断深入,一批内含肽介导的新型蛋白质纯化技术不断出现。新技术依靠内含肽的自切割功能去除亲和标签,避免了传统工艺中因外加蛋白酶而带来的诸多麻烦;新的聚合材料的引入又成功地避开了亲和树脂柱的使用,不仅优化了工艺,也大大降低了纯化的成本,为在工业化大生产中的应用奠定了基础。     

Protein Trans-Splicing of Multiple Atypical Split Inteins Engineered from Natural Inteins

Protein trans-splicing by split inteins has many uses in protein production and research. Splicing proteins with synthetic peptides, which employs atypical split inteins, is particularly useful for site-specific protein modifications and labeling, because the synthetic peptide can be made to contain a variety of unnatural amino acids and chemical modifications. For this purpose, atypical split inteins need to be engineered to have a small N-intein or C-intein fragment that can be more easily included in a synthetic peptide that also contains a small extein to be trans-spliced onto target proteins. Here we have successfully engineered multiple atypical split inteins capable of protein trans-splicing, by modifying and testing more than a dozen natural inteins. These included both S1 split inteins having a very small (11–12 aa) N-intein fragment and S11 split inteins having a very small (6 aa) C-intein fragment. Four of the new S1 and S11 split inteins showed high efficiencies (85–100%) of protein trans-splicing both in E. coli cells and in vitro. Under in vitro conditions, they exhibited reaction rate constants ranging from ∼1.7×10⁻⁴ s⁻¹ to ∼3.8×10⁻⁴ s⁻¹, which are comparable to or higher than those of previously reported atypical split inteins. These findings should facilitate a more general use of trans-splicing between proteins and synthetic peptides, by expanding the availability of different atypical split inteins. They also have implications on understanding the structure-function relationship of atypical split inteins, particularly in terms of intein fragment complementation.     

Scalable Geometrically Designed Protein Cages Assembled via Genetically Encoded Split Inteins

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Split Inteins介导的多肽链两端标记

多肽链多位点特异性标记有助于了解蛋白质的结构与功能,特别是在蛋白质的动态构象研究方面. 但是,现有的多肽链多位点特异性标记方法各有局限性,并且种类有限,所以有必要开发新的多肽链多位点特异性标记方法以满足研究需求. 本文以Diub (ubiquitin dimer) 蛋白为研究对象,借助S1和S11型2种不同的断裂蛋白质内含子 (split inteins) 的蛋白质反式剪接,将含有不同荧光基团的两种小肽成功剪接至靶蛋白的两端,最终达到对靶蛋白的末端标记目的.     

Structural and Dynamical Features of Inteins and Implications on Protein Splicing

Protein splicing is a posttranslational modification where intervening proteins (inteins) cleave themselves from larger precursor proteins and ligate their flanking polypeptides (exteins) through a multistep chemical reaction. First thought to be an anomaly found in only a few organisms, protein splicing by inteins has since been observed in microorganisms from all domains of life. Despite this broad phylogenetic distribution, all inteins share common structural features such as a horseshoe-like pseudo two-fold symmetric fold, several canonical sequence motifs, and similar splicing mechanisms. Intriguingly, the splicing efficiencies and substrate specificity of different inteins vary considerably, reflecting subtle changes in the chemical mechanism of splicing, linked to their local structure and dynamics. As intein chemistry has widespread use in protein chemistry, understanding the structural and dynamical aspects of inteins is crucial for intein engineering and the improvement of intein-based technologies.     

Protein Splicing: How Inteins Escape from Precursor Proteins

Inteins are nature''s escape artists; they facilitate their excision from flanking polypeptides (exteins) concomitant with extein ligation to produce a mature host protein. Splicing requires sequential nucleophilic displacement reactions catalyzed by strategies similar to proteases and asparagine lyases. Inteins require precise reaction coordination rather than rapid turnover or tight substrate binding because they are single turnover enzymes with covalently linked substrates. This has allowed inteins to explore alternative mechanisms with different steps or to use different methods for activation and coordination of the steps. Pressing issues include understanding the underlying details of catalysis and how the splicing steps are controlled.     

海藻糖及其在生物工程方面的应用

自海藻糖发现以来对其化学性质、生理功能、作用机理、代谢途径等已进行了较为深入的研究,其分子生物学的研究也渐渐兴起。研究表明海藻糖能提高生物体对干旱、低温、高温、pH、盐渍等逆境条件下的抗性。离体试验表明海藻糖能保护生物膜、蛋白质的结构并能保持逆境下的酶活性,同时,外源海藻糖同样对生物体有保护作用。由于海藻糖具有这些独特的生物学功能,它已在许多方面得以应用,可作为食品工业的一种添加剂和甜味剂,使干燥食品在得水后保持原有的色、香、味;也可作为医药工业的非特异性生物制品和生化药品保护剂,使其在常温下保存,从而降低运输与储存费用;另外,在农业研究中可利用现代分子生物技术培育表达海藻糖的转基因作物,提高农作物的抗旱、抗冻等抗逆性能。     

铁蛋白的生物工程应用

铁蛋白是一种普遍存在于生物体内的储铁蛋白,具有铁离子代谢、抗氧化胁迫及消除其他过量金属离子毒害作用的功能。随着对铁蛋白结构和生化功能认识的深入,铁蛋白作为一个含有四氧化三铁核心的特殊蛋白复合体,被广泛应用于生物医学、纳米材料、生物分子成像等各种生物工程领域。该综述针对已知的主要铁蛋白分子,论述了铁蛋白的结构及酶活性机理,基于铁蛋白的多功能分子骨架应用,以及基于铁蛋白磁性的生物分子开关等热点研究,最后对铁蛋白生物工程、生物医学领域的应用和发展进行了展望。