鼠伤寒沙门菌pagC启动子的克隆与活性分析

从鼠伤寒沙门菌中克隆出pagC启动子(PpagC),构建体内激活的表达质粒pZW,插入庚型肝炎病毒（HGV）NS3基因,构建出表达质粒pZWNS3。以其转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,观察PpagC的启动活性。结果表明：Mg2+可抑制PpagC的启动活性,Mg2+浓度小于50mmol/L时培养的重组菌经SDSPAGE和Western blot检测能高水平表达HGV NS3蛋白。Mg2+浓度升至50mmol/L时,NS3蛋白表达量明显降低。收集以50mmol/L Mg2+的培养基扩增的重组菌,灌胃接种C57小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和CTL反应。结果显示PpagC是一个强的宿主体内激活的启动子,为构建以伤寒沙门氏菌为载体的高效免疫口服疫苗提供了一个新的途径。     

肿瘤生物治疗的新方法——减毒鼠伤寒沙门菌的应用

减毒鼠伤寒沙门菌由于具有肿瘤靶向性,能在肿瘤组织中复制并产生抗肿瘤效果的能力,使肿瘤治疗获得了新契机。减毒鼠伤寒沙门菌作为细菌载体使目的基因在肿瘤组织内特异表达,表现出良好治疗效果。近期研究发现,单独使用突变后的菌株A1-R在裸鼠模型上治疗乳腺癌和前列腺癌分别可达到40％和50％的治愈率;在小鼠肿瘤转移模型中也展现出良好的治疗效果。鼠伤寒沙门菌作为肿瘤治疗制剂有诱人的前景。本文就这些研究的最新进展做一综述。     

携带HCV核心蛋白原核表达质粒与真核表达质粒的减毒伤寒沙门菌诱导小鼠免疫应答之比较

丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原,然而,该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒,一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C,另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C,分别将重组菌口服接种小鼠,检测小鼠的免疫应答,结果发现：① SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3⁺CD4⁺ T细胞持续降低,而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3⁺CD4⁺ T细胞无明显改变;② SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体,加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响,而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③ SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示：携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式（结构以及磷酸化修饰）的HCV核心蛋白,可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题,并具有接种方便,成本低廉等优点,从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。     

携带HCV核心蛋白原核表达质粒与真核表达质粒的减毒伤寒沙门菌诱导小鼠免疫应答之比较

丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白是丙肝疫苗的重要候选抗原,然而,该蛋白因具有免疫调控作用而影响免疫应答的诱导。构建了HCV核心蛋白的两种表达质粒,一种是体内激活型原核表达质粒pZW-C,另一种是真核表达质粒pCI-C。将该两种质粒转化减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,得到重组菌SL7207/pZW-C和SL7207/pCI-C,分别将重组菌口服接种小鼠,检测小鼠的免疫应答,结果发现:①SL7207/pCI-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞持续降低,而SL7207/pZW-C免疫鼠的CD3 CD4 T细胞无明显改变;②SL7207/pCI-C免疫只诱导低水平抗HCV核心蛋白抗体,加强免疫对抗体阳转率及抗体水平无明显影响,而SL7207/pZW-C免疫组所有小鼠均产生较高水平的抗核心蛋白抗体。③SL7207/pCI-C免疫鼠脾细胞的体外增殖活性、细胞毒性T细胞活性以及加强免疫对细胞免疫应答的增强作用均明显不及SL7207/pZW-C免疫鼠。结果提示:携带真核表达质粒pCI-C的沙门菌因在小鼠细胞内表达天然形式(结构以及磷酸化修饰)的HCV核心蛋白,可能通过对T细胞的免疫抑制作用而弱化免疫应答。而以携带原核表达质粒pZW-C的沙门菌免疫可避免这一问题,并具有接种方便,成本低廉等优点,从而可望作为基于HCV核心蛋白为靶抗原的HCV疫苗的候选免疫方式。     

携带HBV包膜大蛋白DNA疫苗的减毒沙门菌在小鼠诱导免疫应答

探索一种简便、有效的乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫方法。将编码绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFPN1转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL7207,灌胃饲服BALB/c小鼠,流式细胞术检测出小鼠脾细胞内表达的绿色荧光蛋白;构建编码HBV包膜大蛋白的DNA疫苗pCIS1S2S,分别以SL7207为载体的口服途径或直接肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的血清抗体、T细胞增殖和细胞毒性T淋巴细胞反应,结果表明两种免疫途径均能在小鼠体内诱生细胞和体液免疫应答,但口服途径诱导免疫应答的强度明显强于肌肉注射途径。口服携带HBV DNA疫苗的减毒伤寒沙门菌可能代表一种简便、有效的治疗乙型肝炎的新方法。      

减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鼠伤寒沙门菌口服活疫苗载体,本研究以pYA3493质粒为基础,用鼠伤寒沙门菌sopE_(Nt100)基因及其启动子替代原有的P_(trc)启动子,构建沙门菌三型分泌表达载体pYA-sopE_(Nt100);再将质粒pYA-sopE_(Nt100)电转入沙门菌ΔcrpΔasd SL1344,构建减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因egfp克隆入sop E基因下游,构建重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100)-egfp),感染Vero细胞,用Western blotting分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明,减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株Δcrp SL1344及野生株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢;重组菌株ΔcrpΔasd SL1344(p YA-sop E_(Nt100))的LD50较野生株SL1344降低了7.0×104倍;Western blotting结果发现,重组菌培养上清中能检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da);重组菌株感染Vero细胞后,可以同时检测到Sop E_(Nt100)-egfp融合蛋白(37 k Da)和EGFP蛋白(27 k Da)。以上结果证实,本研究成功构建了新型减毒鼠伤寒沙门菌ΔcrpΔasd(p YA-sop E_(Nt100))三型分泌表达系统,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

鼠伤寒沙门菌微孔蛋白的免疫学研究进展

本文对鼠伤寒沙门菌（ＳＴＭ）微孔蛋白的免疫学研究作了阐述,分析了ＳＴＭ－微孔蛋白的结构、功能及遗传学,展示了研究ＳＴＭ－微孔蛋白所面临的问题及实际应用价值。     

表达幽门螺杆菌粘附素保守区的减毒鼠伤寒沙门菌免疫治疗作用的研究

探讨表达幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）粘附素保守区（AB）的减毒鼠伤寒沙门菌X4072（pYA248-AB）的免疫治疗效果,以及可能的免疫治疗机制,以确定X4072（pYA248-AB）在Hp疫苗研制中的应用价值.建立Hp感染小鼠模型,在该模型中评价X4072（pYA248-AB）治疗Hp感染的效果,运用细菌培养法观察Hp根除率及定植量的改变,流式细胞术分析免疫后小鼠脾细胞亚型,IL-2和IL-4细胞依赖株的细胞测活法检测细胞因子,ELISA法检测小鼠血清及肠液中抗AB抗体产生情况.结果表明,免疫治疗后疫苗治疗组根除率为53.3%,显著高于X4072（pYA248）和PBS对照组（P＜0.01）.未根除Hp的小鼠,疫苗治疗组Hp的定植密度明显低于其他两组（P＜0.01）.应用流式细胞仪分析免疫小鼠脾CD4⁺/CD8⁺ T淋巴细胞的比值时,发现疫苗治疗组和鼠伤寒菌对照组的比值均显著高于PBS对照组（P＜0.05）,而疫苗治疗组的比值又显著高于鼠伤寒菌对照组（P＜0.05）.进一步对细胞因子进行分析发现,与PBS对照组相比免疫治疗组和鼠伤寒菌对照组IL-2和IL-4明显升高(P＜0.05).同时,免疫治疗组与鼠伤寒菌对照组相比,IL-4增高明显(P＜0.05).针对AB的抗体测定结果发现,仅在免疫治疗组的小鼠肠液中检测到了IgA抗体.免疫治疗组IgG抗体滴度较其他两组明显升高,第二次加强免疫后2周即上升至1∶10 000.动物实验表明,X4072（pYA248-AB）能根除或显著降低Hp在小鼠胃内的定植,其可能的免疫治疗机制包括提高CD4⁺/CD8⁺比值,诱导Th1和Th2反应以及产生针对AB的特异性抗体.     

双歧杆菌防治鼠伤寒沙门菌感染的实验研究

目的　以小鼠为模型,研究双歧杆菌在体内对鼠伤寒沙门菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ,ＳＴＭ） 感染的防治作用。方法　分别用大剂量悉复欢、Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ 、生理盐水（ＮＳ） 给三组小鼠灌胃,再用ＳＴＭ 攻击,观察小鼠经上述不同处理前后肠道双歧杆菌数量和ＳＴＭ 攻击后粪便ＳＴＭ 培养阳性率,阳性标本ＳＴＭ 分离值及小鼠ＳＴＭ 感染率;同时用双歧杆菌、悉复欢、双歧杆菌加悉复欢分别治疗ＳＴＭ 感染的小鼠,观察并比较疗效。结果　１． 大剂量悉复欢使用可使小鼠肠道内双歧杆菌明显降低,而双歧杆菌灌胃则肠道双歧杆菌明显增多。双歧杆菌灌胃的小鼠粪便ＳＴＭ培养阳性率、阳性粪便ＳＴＭ 值明显低于用大剂量悉复欢和ＮＳ 的小鼠,小鼠ＳＴＭ 感染发病率也明显较低。２． 对于ＳＴＭ 感染鼠,双歧杆菌与悉复欢联合治疗效果最好。结论　１． 双歧杆菌在体内对ＳＴＭ 有拮抗作用;能预防和减少ＳＴＭ 感染发生;２． 在ＳＴＭ 感染时,先用悉复欢,再用双歧杆菌可以达到预期疗效,双歧杆菌对鼠伤寒沙门菌感染有辅助治疗作用。     

用体内激活的启动子调控HCV核心抗原表达可增强重组鼠伤寒沙门氏菌的免疫原性

为提高抗原表达质粒在重组伤寒沙门氏菌中的稳定性以增强重组伤寒沙门氏菌诱导的免疫应答 ,克隆鼠伤寒沙门氏菌pagC基因启动子 ,以其为转录调控元件构建HCV核心抗原表达质粒 ,转化到减毒鼠伤寒沙门氏菌中。体外培养时 ,Mg2 能够剂量依赖性抑制该重组菌表达HCV核心抗原。将该重组菌和组成性表达的重组菌分别口服接种BALB/c小鼠 ,观察质粒的稳定性和小鼠的免疫应答。结果表明 ,体内激活的pagC基因启动子能明显提高质粒在重组鼠伤寒沙门氏菌中的稳定性和增强重组菌诱导的体液和细胞免疫应答 ,这为发展高效免疫、成本低廉的口服丙肝疫苗提供了一个新思路     

口服型HCV融合抗原DNA疫苗在小鼠诱导免疫应答

将编码一个外源信号肽、一个通用型辅助性T淋巴细胞抗原表位和HCV核心 包膜蛋白E2融合抗原基因的真核表达质粒pST CE2t(DNA疫苗 )转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7.将该重组菌口服接种BALB c小鼠 3次 .小鼠的抗HCV核心和E2抗体阳转率分别达 6 0 %和 70 % .体外以重组HCV核心或E2抗原刺激小鼠脾细胞 ,均使之发生明显的增殖反应 ,且小鼠脾细胞能有效杀伤表达HCV核心抗原的同系骨髓瘤细胞SP2 0 .这为研制高效免疫、成本低廉、接种方便的HCV疫苗提供了一个新的可行途径     

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达新城疫病毒融合蛋白

RT PCR扩增了新城疫病毒 (NDV)F4 8E9株的融合蛋白 (F)基因并插入到 pcDNA3的CMV启动子下游 ,构建成真核表达质粒pcDNA3 F ,高压电转化dam和 phoP基因双突变株减毒鼠伤寒沙门氏菌 (ZJ111株 ) ,并直接感染Vero细胞 ,分别提取细胞总DNA和总RNA ,DIG标记探针均可检测到阳性杂交信号。FITC标记的羊抗鸡IgG进行间接免疫荧光试验 ,可检测到特异性的黄绿色荧光。ELISA检测F蛋白结果表明 ,转染后 4 8h开始表达 ,随后逐渐增多。SDS PAGE和Western印迹可检测到 5 5kD的蛋白质条带。上述试验结果证实减毒沙门氏菌不仅可将目的基因呈递给Vero细胞 ,而且还得到了转录和表达 ,表达的F蛋白具有免疫反应性 ,为研制减毒沙门氏菌为载体的口服NDVDNA疫苗创造了条件。     

减毒沙门氏菌为载体在Vero细胞中表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因

用长距离RT-PCR扩增了传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）ZJ2000株多聚蛋白基因,定向克隆入真核表达载体Pci,电转化dam^-和phoP^－双突变的减毒鼠伤寒沙门氏菌ZJ111株,并直接转染Vero细胞。RT-PCR和间接免疫荧光试验可从Vero细胞中检测到阳性信号,SDS-PAGE和West blotting均可检测到41kD的蛋白条带。结果表明减毒沙门氏菌可将外源基因导入Vero细胞,并进行转录和表达,具有免疫反应性,为进一步研制减毒沙门氏菌为载体的IBDV口服DNA疫苗打下基础。     

戊型肝炎病毒重组颗粒性蛋白疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答研究

HEV 239是福建省医学分子病毒学研究中心实验室研制的一种戊型肝炎病毒（HEV）重组颗粒性蛋白疫苗,该文旨在研究HEV239蛋白疫苗在小鼠体内诱导产生特异性免疫应答的情况.将5μg HEV 239蛋白疫苗（239-Pro）、加铝佐剂疫苗（239-Vac）或加弗氏佐剂疫苗（239-CFA）肌肉注射免疫BALB/c鼠3次,第8周检测鼠血清抗HEV抗体及其亚类,同时用ELISPOT方法检测细胞毒性T细胞（CTL）应答.结果显示：239-Vac诱导的抗体滴度与239-CFA相当,高于无佐剂的239-Pro.239-Vac诱导的抗体中,IgG1/IgG2a比值显著高于239-CFA和239-Pro,主要为Th2型应答.除239-CFA之外,239-Vac和239-Pro也可诱导出一定的HEV抗原特异性I型Tc应答.提示：重组抗原HEV 239能诱导良好的抗体应答及一定的Tc1应答.     

表达乙型脑炎病毒E蛋白重组减毒沙门菌活载体疫苗株的构建

目的:构建表达乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株。方法:克隆JEV E基因,将其插入表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-E,将重组质粒电转入鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(缺失asd、cya、crp基因),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-E);鉴定重组菌E蛋白的表达,测定重组菌的稳定性、生长曲线、安全性,以及小鼠的免疫试验和血清中和试验。结果:酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功;SDS-PAGE检测有目的蛋白条带;Western印迹证实表达的E蛋白能与猪抗JEV阳性血清特异性结合;重组菌株在体外营养选择压力下,可稳定地携带重组质粒传代繁殖,在体内可较稳定地定居于肠系膜淋巴结和脾脏;小鼠口服试验证实重组菌无毒性作用,安全可靠;小鼠口服重组菌免疫,ELISA检测产生了抗JEV抗体;中和试验表明产生的抗体具有中和活性。结论:构建了能稳定表达JEV E蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌疫苗株X4550(pYA3341-E),为研究乙型脑炎口服基因工程疫苗奠定基础。     

减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的H5亚型禽流感病毒DNA疫苗的实验免疫效果研究

将运送H5亚型禽流感病毒DNA疫苗重组减毒鼠伤寒沙门氏菌以1.0×1010CFU剂量口服接种1日龄SPF雏鸡,结果表明重组菌对雏鸡具有良好的安全性。将重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)以2×109CFU的剂量两次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,同时,将重组菌分别与pVAX1-IFN-γ或pVAX1-IL2(200μg/只)联合免疫,通过测定小肠粘膜抗体效价,结果显示,重组菌单独免疫组和联合免疫组能激发机体产生粘膜免疫应答,且与空载体组、空白对照组以及油苗组之间存在显著性差异(P<0.05)。攻毒后,免疫保护结果显示无论是重组菌单独免疫组还是联合免疫组均与空载体组和空白对照组之间存在显著性差异(P<0.05),而重组菌单独免疫组与联合免疫组之间不存在显著性差异,说明重组菌SL7207(pVAX1-HA)和X4550(asd-pVAX1-HA)能够提供机体抵抗HPAIV H5亚型强毒攻击的良好的免疫保护作用,这为进一步筛选出基于粘膜免疫途径的新型禽流感基因工程疫苗奠定了基础。     

大剂量HBsAg对HBV转基因小鼠T细胞免疫调节的研究

目的：研究大剂量HBsAg对HBV转基因小鼠其T细胞免疫效果的影响。方法：用大剂量血源性HBsAg免疫HBV转基因小鼠,采用ELISA方法观察转基因小鼠所诱生的HBsAg特异性Th1类细胞因子的水平,ELISPOT方法检测不同免疫方案对小鼠HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量的影响,同时检测对小鼠淋巴细胞增殖的影响。结果：HBsAg组免疫后脾细胞产生的Th1类细胞因子（IFN-γ、IL-2）、HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞及T细胞增殖水平较对照组显著增加（P〈0.05）。结论：大剂量的HBs-Ag可以诱导乙肝转基因小鼠产生高水平Th1类细胞因子并打破免疫耐受。